Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein ekspresyonundaki heterojenlik derecesine sayısal bir değer atamak için insan kanserinin tüm doku bölümleri boyunca biyobelirteç ekspresyonunu doğru bir şekilde ölçmektir. Bu, ilk olarak kanser dokusunun immüno-floresan etiketli bölümlerinin tam bir slayt floresan tarayıcı kullanılarak taranmasıyla elde edilir. Tümör içindeki sonraki ilgi alanları değerlendirme için seçilir.

Daha sonra, invaziv tümör alanları içinde ilgilenilen proteinin ekspresyonu, aqua analizi otomatik görüntü analiz sistemi kullanılarak ölçülür. Sonuç olarak, bu yöntem, doku bölümü boyunca genellikle çok heterojen olan kanser dokusundaki biyobelirteç ekspresyonunu haritalamak için kullanılabilir. Bu tekniklerin kullanılmasının, renk ve metrik görselleştirme reaktifleri kullanılarak yapılan immünohistokimya gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, immünofloresanın daha kantitatif ve daha duyarlı olmasıdır.

Bu analitik yöntemleri bütün bir kesitle birleştiren immünofloresan taraması, dokular arasında biyobelirteç ifadesindeki ince değişikliklerin ince taneli haritalanmasını sağlar. Bu prosedürleri ilk kez gösteren, Histo RX laboratuvarında doğrudan operasyon direktörü olan Mark Gustafson'dur. Mikrotom, bir kanser dokusu biyopsisinin kesitlenmesi ve ilgilenilen biyobelirteçlerin ifadesi için numunenin immünofloresan boyanmasından sonra, lekeli bölümlerin en fazla beş slaytını slayt tarayıcının slayt kasetine yükleyin.

Ardından tarama kapsamı konsolundaki arayüzü kullanarak. Her slayt için, boyama deseninden veya numunenin diğer gözlemlenebilir yönlerinden bağımsız olarak, slayttaki tüm dokuyu kapsayacak bir bölge seçin. Ardından, tarama kapsamı konsolunu kullanarak, önce en iyi temsili sağlamak için dokunun tümör bölgesi içinde ideal olarak değerlendirmek için bir doku bölgesi seçin.

Şimdi tarama kapsamı konsolu otomatik pozlama özelliğini kullanarak, görüntü odağıyla birlikte her kanal için pozlama süresini belirleyin, dokudan uzakta ek bir bölge seçmek için tarama kapsamı konsol görüntüsündeki mavi baklavayı kullanın, ancak yine de düz alan düzeltme görüntülerinin elde edileceği arka plan alanını tanımlamak için kapak kaymasının altındaki slayt bölgesi içinde. Her filtre için, görüntü yakalamayı optimize etmek üzere sarı karelerle temsil edilen doku alanına odak noktaları ekleyin. Görüntüler yüksek arka plana veya diğer görüntü yapaylıklarına sahip gibi görünüyorsa, görüntü bölgesi taşınmalı ve yeni görüntüler alınmalıdır.

Doku daha sonra taranır ve elde edilen dijital slayt görüntüleri daha sonra otomatik olarak Aperio spektrum veritabanına yüklenir. Spektrum veritabanındaki dijital slayt listesinden analiz için slaydı seçmek için spektrum programının küçük resmine çift tıklayın. Ardından, eşlik eden h ve D açıklamalı görüntüyü kullanarak, floresan görüntüdeki ilgilenilen bölgeye açıklama ekleyin.

Tek bir örnek üzerinde tek tek dairelerle tanımlanan birden fazla ilgi alanı seçilebilir. Açıklamalı görüntüler otomatik olarak spektrum veritabanına kaydedilir. Şimdi analiz penceresi göründüğünde ekranın üst kısmındaki menü çubuğundan Analiz Et'i seçin, açılır menüden histo RX aqua analizi'ni seçin.

Başlamaya hazır olduğunuzda, analiz düğmesine basın, Windows görev çubuğunda, görüntülerin Spectrum veritabanından yerel bilgisayara aktarımının ilerlemesini gösteren simge durumuna küçültülmüş bir konsol penceresi görünecektir. Veriler aktarıldıktan sonra, su analizi, bir numune ilk eşiğinin, arka plan görüntü sinyalinin üzerindeki pan sitokeratin görüntü sinyalinin veri kümelenmesine dayalı olarak denetimsiz bir su puanlama algoritması kullanarak bir su puanı oluşturmak için başlatılacaktır. Bu, daha sonra sonraki hesaplamalar için kullanılabilecek bir tümör maskesi tanımlamak için piksellerin kullanılmasına izin verecektir.

Tümör hücrelerinin sitoplazmik veya nükleer olmayan bölgelerini de tanımlamak için yüksek ekspresyonlu pan sitokeratin piksellerini kullanın. Burada görüldüğü gibi, tümör maskesi içinde bulunan DPI kanalında yüksek sinyale sahip pikseller, doğası gereği nükleer olarak tanımlanır. İnceleme sonucunda örnek veya görüntüleme artefaktları nedeniyle puanlama için uygun olmayan alanlar tanımlanırsa, bu alanlar puanlamadan çıkarılır ve ayrıca nihai bir başarısızlık sonucu üretir.

Aqua puanlamasının sonuçları, tüm doku kesiti numunesi içindeki ilgili bölgedeki her 512 x 512 piksellik karo ile ilişkili bir skor tablosu olarak temsil edilir ve bu tablo kaydedilebilir ve sonraki istatistiksel analizler için kullanılabilir. Bu hemat toin ve eoin lekeli foto mikrograflar, aynı yumurtalık kanserinin farklı alanlarının nasıl değişken morfoloji sergileyebileceğini göstermektedir. Şekil B'nin sağ üst köşesindeki yüksek güç görünümü, tümörün üst kısmında sitoplazmik temizleme ve sağlam bir büyüme paterni olan hücreleri vurgular.

Bununla birlikte, Şekil C'nin sağ alt bölümünde büyütülen dokunun alt kısmı, daha homojen bir eozinofilik sitoplazmaya ve papiller bir büyüme modeline sahiptir. Burada, bir kemoterapi tedavisi öncesi ve sonrası over kanserinin bir doku kesitinde ER ekspresyonunun heterojen ısı haritaları sırasıyla üst ve alt panellerde gösterilmiştir. Üstteki şekilde hem yüksek hem de düşük ifade bölgelerinin bulunduğu bölüm boyunca değişken ER ifadesinden, alttaki şekilde kırmızı ile gösterilen yüksek ER ifadesinin eşit dağılımına geçişe dikkat edin.

Bu değişimin sayısal temsili, Simpsons endeksindeki düşüşle solda gösterilir. Bu şekilde, yumurtalık kanserinin bir doku bölümündeki HER ikisinin heterojenlik ısı haritaları, sırasıyla üst ve alt panellerde görüldüğü gibi tedaviden önce ve sonra tekrar gösterilmiştir. Yine, üst figürde hem yüksek hem de düşük ifade bölgelerinin bulunduğu bölüm boyunca HER iki ifadesi değişkeninden, alt figürde yüksek HER iki ifadesinin eşit dağılımına geçişe dikkat edin.

Bir kez daha, Simpsons endeksinin düştüğü görülüyor. Bu prosedürü denerken, hesaplamalı analiz tarafından üretilen verilerin kalitesinin yalnızca boyamanın kalitesi kadar iyi olduğunu ve bunun yüksek bir teknik standartta olması gerektiğini unutmamak önemlidir.