İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

Bu prosedür, in vivo hücre kinetiğini taklit etmek için üç boyutlu bir hücre kültürü sistemi kullanır. Hücreleri kollajen ENC kaplı boncuklarla inkübe ederek başlayın. Daha sonra hücreleri ve boncukları dönen bir hücre kültürü sistemine yükleyin ve 3D hücre agregalarını düşük kesme, düşük türbülanslı bir ortamda çoğaltın.

Son olarak, tipik bir tek tabakada yetiştirilen hücrelerin gen ekspresyonu ve hücresel farklılaşması ile karşılaştırıldığında, aşağı akış uygulamalarında kullanılmak üzere hücreleri hasat edin. Elde edilen 3D kültürler, bu sahneye çok benzeyen hücre kinetiğini ve davranışını gösterir. İn vivo.

RCCS'yi çeşitli insan epitel dokularının biyolojik olarak anlamlı 3D modellerini tasarlamak için kullandık. İş arkadaşım Dr.Sydney Morris'in laboratuvarında eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Dr. Jessica Warner, şimdi bu prosedürü EVT hücreleri ile gösterecek 50 mililitrelik konik tüplü bir otoklavda 250 miligram mikro taşıyıcılar 12 mililitrede üç boncuk cyto dex. DPBS, hazırlanan boncukların şişmesine ve oda sıcaklığına soğumasına izin verir.

Daha sonra steril koşullar altında toplam hacmi 12,5 mililitreye getirin. DPBS'yi kullanarak, şimdi% 80'lik bir ekstra villus trofoblast hücresi kültürünü hasat edin. Tripsin sindirimi kullanarak, hazırlanan cyto dex üç boncuğu hafifçe karıştırın ve geniş bir uç kullanarak 10 mililitre serolojik pipet kullanın, 2.5 mililitreyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Cyto dex'ten sonra tüpün dibine üç boncuk yerleşmiştir. Cyto Dex üç boncuğu bozmadan DPBS'nin üst tabakasını pipetleyin. EVT hücrelerini cyto Dex üç boncuk ile karıştırın.

Periyodik karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından ara sıra karıştırma ile hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika inkübe edin. 10 mililitrelik bir RCCS'yi steril altı kuyulu bir kültür plakasına yerleştirin ve büyük tıpayı çıkarın. Şimdi, hücre boncuk karışımının toplam hacmini 10 mililitreye getirmek için ısıtılmış GTSF iki ortam ekleyin ve büyük porttan RCCS'ye yükleyin.

Büyük bağlantı noktası durdurucusunu değiştirin ve küçük bağlantı noktalarını kapatın. Bir sonraki pozisyonda, üç mililitrelik şırıngayı iki küçük portun üzerine boşaltın. Her şırıngaya medya ekleyin.

İki valfi yavaşça açın ve şırınga pistonlarını değiştirin. Tüm hava kabarcıkları iç hazneden dışarı atılana kadar bir şırıngadan yavaşça ortam ekleyin. RCCS'yi alın ve kabarcık olup olmadığını kontrol etmek için döndürürken hafifçe yana vurun.

Baloncuklar küçük bağlantı noktasının altına gelene kadar RCCS'yi döndürerek kalan baloncukları çıkarın. Ardından, kabarcıkları porta ve hazneden dışarı zorlamak için karşı taraftaki şırıngayı yavaşça aşağı doğru itin. Bir yan portu kapatmaya devam edin, kaba az miktarda pozitif basınç uygulamak için diğer şırınga pistonunu hafifçe aşağı bastırın ve basınç uygularken ikinci valfi kapatın.

Son olarak, RCCS'yi rotora yükleyin. Optimum kültür koşulları için bir hücre kültürü inkübatöründe rotasyonu 19 RPM'de başlatın. Medyayı ilk üç gün boyunca her gün ve daha sonra her gün yenileyin.

Önce rotoru kapatın ve RCCS'yi çıkarın. Biraz emiş oluşturmak için pistonları yukarı çekin. Şırıngaları her küçük porttan çıkarın ve RCCS'yi belirli bir açıyla yerleştirin ve boncukların büyük portun karşısına yerleşmesine izin verin.

Şimdi, boncukları bozmadan ortamın üçte ikisini RCCS'den bir atık kabına bırakmak için küçük valflerden birini açın. Küçük valfi kapatın, ardından büyük bağlantı noktasını açın. RCCS'ye ortam ekleyin ve durdurucuyu değiştirin, daha önce gösterildiği gibi tüm hava kabarcıklarını dışarı atın ve kültürü inkübatördeki döndürücüye yerleştirin.

Agregalar büyümeye başladığında, hücrelerin süspansiyon halinde kalmasını sağlamak için dönme hızını gözle görülür şekilde artırın. Hücreleri hasat etmek için. RCCS'yi rotordan serbest bırakın.

Şırıngaları her küçük bağlantı noktasından atın ve RCCS'yi, boncukları büyük bağlantı noktasının karşısına yönlendirmek için belirli bir açıyla yerleştirin. Boncukların tümü yerleştikten sonra, küçük valflerden birini açın ve ortamın üçte birini bir atık kabına boşaltın. Küçük vanayı kapatın ve büyük portu açın.

Agregaları tekrar çözeltiye dağıtmak için kabı hafifçe döndürün ve hücreleri steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Toplanan agregaların konik tüpe yerleşmesine izin verdikten sonra, agregaların geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için kültür kabını tekrar iyice yıkamak için süpernatanı kullanın. Geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, sonraki fonksiyonel tahliller için agregaları hemen alikot edin.

S-G-H-P-L dört trofoblast hücre hattı, hücreler gibi ekstra villus trofoblastlarının bir örneğidir. Cyto X üç üzerinde bir RCCS'de yetiştirilen tipik bir agregada, birçok boncuk tamamen yayılan hücrelerle kaplıdır. Ana kümeden uzağa uzanan ve komşu kümelere bağlanan projeksiyonlara dikkat edin.

RCCS'den çıkarıldıktan ve hücre dışı bir matris üzerine kaplandıktan sonra, EVT benzeri 3D büyümüş hücreler agresif bir şekilde istila eder ve/veya göç eder. Gerçekten de, R-T-P-C-R verileri, geleneksel hücre kültürü tek katmanlarının aksine 3D agregalarda görülen MMP'lerin artan ekspresyonunu doğrulamaktadır. İlginç bir şekilde, istila ile ilişkili olmayan genler de RCCS'de yukarı regüle edilir.

Bu videoyu izledikten sonra, in vivo hücre kinetiğini daha yakından taklit eden üç boyutlu hücre kültürleri elde etmek için RCCS'yi hücre hattı birincil hücrelerinizle ve hatta kök hücrelerinizle nasıl kullanacağınızı net bir şekilde anlamış olmalısınız.