Name: İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Öğrenin insan trofoblast hücrelerinde üç boyutlu döner hücre kültürü sistemini kullanarak in vivo benzeri hücre davranışlarını nasıl elde edeceğinizi. Bu yöntem farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonunu artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık hibe NIH / NICHD # HD051998 (CAM) Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Kollajen Boncuk Preparation <ol><li> 3-boyutlu hücre kültürü için yükleme EVTs önce, bir Cytodex-3 microcarrier boncuk hazırlamak gerekir: <ol><li> Deney için gerekli Cytodex-3 boncuk uygun miktarda tartılır. Bu protokol, boncuk 0.05g gerekli olan 10ml RCC gemi için uyarlanmıştır. 50ml RCC bir gemi için, buna göre ölçekli. 50ml otoklavlanabilir konik tüp 12ml Dulbecco'nun fosfat, 250 mg Cytodex-3 boncuklar bir arada çözüm (DPBS) tamponlu. Bu miktar 5 RCC gemiler için yeterli olacaktır. </li></ol></li><li> Otoklav süreci buharlaşma sonucu olarak yeterli hacmi, konik tüp içinde bulunur olun. Gevşek 110 tüp ve 10 dakika otoklav kapağı ° C </li><li> Otoklav döngüsü bitiminde konik tüp çıkarın ve Cytodex-3 boncuk çözüm soğumasını bekleyin. </li><li> Konik tüp oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra, 1X DP ile toplam hacmi 12.5mL getirmek için steril tekniği kullanmakBS. </li><li> Cap ve oda sıcaklığında hazırlanan Cytodex-3 boncuk saklamak. Hazırlanan boncuklar kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar şişer ve serinlemek için izin verin. Yukarıdaki hazırlık Cytodex-3 boncuk, beş 10ml RCC gemiler için sağlayacaktır. Biz yaklaşık bir ay sonra kollajen istikrarsızlaştırmak Cytodex-3 boncuk oda sıcaklığında uzun depolama, performans azalması neden olacağını gözlemledik. 133-215 mikron boyutunda Cytodex-3 boncuk aralığı. </li></ol> 2. Medya Hazırlık <ol><li> Artı takviyeleri ve% 60 L-15 Leibovitz medya (22 uyarlanmıştır),% 40 MEM alfa-2 oluşur GTSF medya (22 uyarlanmıştır), optimize edilmiş RCC 1L hazırlayın. Birincisi, MEM alfa ile desteklenmiş toplam hacmi 400ml hazırlamak: 21.2mM sodyum bikarbonat % 0,06 Peptonlu 0.7mm Fruktoz 1.4mm Galaktoz 5.6mM Glikoz 1% Hepes % 1 L-glutamin % 0.5 'DA % 10 FBS </li><li> ITS bir stok solüsyonu hazırlamak için, buzul asetik asit ilavesi (yaklaşık 0.05mL) tarafından hazırlanan 5 ml'lik steril asitlendirilmiş H 2 O çözülür. Çözmek için Swirl 45mL steril su ile izleyin. </li><li> Doku kültürü notu H 2 O çözme orta 600ml için yeterince L-15 Leibovitz tozu tartılır </li><li> L-15 Leibovitz orta hücre kültür ortamı ile 1L toplam hacim kazandırın. Filtre sterilize ve 4 saklamak ° C karanlıkta. Kullanılan orta her kısım için ayrı ayrı% 1 Penisilin-Streptomisin ekleyin. </li><li> GTSF-2 medya daha başka birçok medya formülasyonları RCC başarıyla test edilmiştir. Bireysel laboratuvarlarda deney yapıldığı için en uygun olan orta kendileri için karar vermelisiniz. </li></ol> 3. Hücreler ve Boncuk Kuluçka <ol><li> ~ 80% confluency EVTs yayma, trypsinize ve kabul edilen hücre kültürü uygulamaları kullanarak saymak. </li><li> Ilık 4ml 1x10 6 EVTs Askıya Almaed medya. </li><li> Hazırlanan Cytodex-3 boncuk hafifçe karıştırın. Steril teknikleri kullanarak, geniş bir ucu, 10 ml serolojik pipet ve kullanılmayan bir 15 mL konik tüp transfer kullanılarak hazırlanan boncuk 2.5ml çıkarın. Pipet eklemek gibi küçük bir boncuk kaybı olabileceğini unutmayın. </li><li> Cytodex-3 boncuk tüp alt yerleşmek için izin verin. Sedimantasyon sonra Cytodex-3 boncuk bozmadan DPBS en üst tabakasını kaldırmak için bir pipet kullanın. </li><li> Hazırlanan Cytodex-3 boncuk ile medya 1x10 6 hazırlanan EVTs karıştırın. </li><li> Hücre-boncuk karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Periyodik yavaşça karıştırın. 37 ° C ve% 5 CO 2 'de bir 30 dakika daha inkübe. Periyodik yavaşça karıştırın. </li></ol> 4. RWV yükleme <ol><li> Laminer akış kabini, ambalaj, 10 ml RCC kaldırmak ve istikrarı için steril, 6 gözlü bir kültür plakasına yerleştirin. RC etiketli diyagram Şekil 1 bakınCS. </li><li> Limandan büyük stoper çıkarın. </li><li> Kuluçka hücre-boncuk karışımı toplam hacmi 10 ml ile ısındı medya getirin. </li><li> Hücre / boncuk-karışımı büyük bir bağlantı noktası üzerinden RCC içine yükleyin. RCC az eğik olmalıdır 45 ° açılı (büyük port) olası hava kabarcıklarının alınması yardım yüklerken. Geminin yavaş yavaş ve sürekli doldurarak pozitif basınç oluşturmak önleyin. </li><li> Büyük liman stoper değiştirin. </li><li> 3 ml şırınga pistonları çıkarın ve küçük liman üzerine boş bir şırınga yerde. 1-3ml her şırınga medya ekleyin. Yavaş yavaş iki vanalarının açık. Yavaşça şırınga şırınga pistonları değiştirin. Tüm kabarcıklar iç odasının kaldırılana kadar bir şırınga medya ekleyin. </li><li> RCC Pick up ve kabarcıkları kontrol etmek için önünüzde dönerken yan hafifçe dokunun. Hava kabarcıkları oluşumu o engel olacak şekilde, herhangi bir kabarcıkları varsa, oda onları almak gerekirf hücre agrega ve kesme kuvvetleri tanıtmak. RCC kabarcıkları küçük liman altında olana kadar döndürerek kabarcıklarını çıkarın. Sonra yavaşça liman ve odanın içine ya da dışına baloncuklar zorlamak için, karşı tarafında şırınga aşağı doğru itin. </li><li> Bir tarafı bağlantı noktasını kapat. Şekillendirme kabarcıkları önler gemi, içine küçük bir miktar pozitif basınç tanıtmak için diğer şırınga pistonu yavaşça aşağı doğru itin. İkinci vanasını kapatın. </li><li> RCC rotor üzerine yerleştirin. 37 ° C CO 2 inkübatör 19rpm dönme başlayın. </li></ol> 5. Medya değiştirme <ol><li> Sonra her gün daha sonra, ilk üç gün boyunca her gün bir ortam. </li><li> Rotor kapatın ve RCC kaldırmak. Pistonlar, bazı emme oluşturmak, her bir küçük liman şırınga kaldırmak ve boncuklar, büyük bir liman tersi yerleşmek böylece bir açı RCC yere kadar çekin. </li><li> Boncuk yapıldıktan sonra, küçük vanaların birini açmak veRCC medya ve bir atık kabı içine akmasına izin verin. Bu şekilde 2 / 3 'medya çıkarın. Boncuk rahatsız değil ve herhangi bir agrega atmayın emin olun. </li><li> Küçük bir kapak kapatın ve büyük bir liman açmak. Medyanın büyük bir bağlantı noktası üzerinden RCC içine ekleyin. Büyük liman stoper değiştirin. </li><li> 4.9 - 4.6 adımları tekrarlayın. </li><li> Agrega boyutu arttıkça, dönme hızını artırmak için en uygun hızda küçük bir dolaşım deseni, ideal olarak, her zaman süspansiyon onları tutmak için gerekir. Genel olarak, agrega, gözle görülür bir şekilde büyüyen başladıktan sonra her emzirmeden sonra 0,3-0,7 rpm arasında hız artışı. </li></ol> 6. Toplama Hücreler yayılma <ol><li> Rotor RCC çıkarın. Her bir küçük liman şırınga çıkarın ve RCC, boncuklar, büyük bir liman ters yerleşmek böylece bir açıyla yerleştirin. </li><li> Boncuk yapıldıktan sonra, küçük vanaların açık ve medya dışarı akmasına izinRCC ve bir atık kabı içine. Bu şekilde 1 / 3 medya çıkarın. </li><li> Küçük bir kapak kapatın ve büyük bir liman açmak. Yavaşça girdap gemi çözüm içine agrega dağıtmak için. Boş steril bir 50ml konik tüp içine sıvı karışımı. Toplanan büyüklükler agrega kurtarma en üst düzeye çıkarmak için kültür damarı iyice yıkamak için supernatant kullanmadan önce konik tüp yerleşmek için izin verin. Büyüklükler, akış sitometri, istila testleri, immunofloresan ve diğerleri gibi hemen aşağı deneyleri için kullanılan olabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar RCC Cytodex-3 boncuk üzerinde yetiştirilen EVT benzeri hücreler (trofoblast hücre hattı SGHPL-4) bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. EVT hücre hattı gibi ana küme uzak uzanan ve komşu kümeler takılarak projeksiyonları görüntüler. Birçok boncuk tamamen propaganda hücreleri ile kaplıdır. Bir kez RCC ve pla kaldırıldıted bir ekstrasellüler matriks, EVT gibi 3-D yetiştirilen hücreler, agresif ve / veya göç (Şekil 3) işgal . RT-PCR veriler geleneksel hücre kültürü mono tabakaları (Şekil 4) karşı 3-D agrega görülen MMP'lerin artmış ekspresyonu onaylar. İlginçtir ki, işgali ile ilişkili olmayan genlerin de RCC upregüle (Tablo 1) ve işgalci trofoblast hücreleri ile bağışıklık etkileşimler gibi alanlarda tasvir yardımcı olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Döner Hücre Kültürü Sistemi (RCC) Karikatür tasviri. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, 5 gün büyüme bir RCC sonra bir temsilci toplam faz kontrast mikrografı . Oklar işgalci hücreleri gösterir ve * Cytodex-3 microcarrier boncuk gösterir. <imgalt src='"/' files></imgalt> Şekil 3 RCC Yetiştirilen agrega fibrin jel gömüldü. Fibrin jel ile Invasion, (A) 24 saat sonrası fibrin gömme gibi erken olarak görülen ve (B) 48 saat boyunca devam edildi. Oklar işgalci hücreleri gösterir * Cytodex-3 microcarrier boncuk (Ref izni ile uyarlanmıştır. 7) ifade eder. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4, tek tabaka ve RCC Karşılaştırmalı jelatin zymogram SGHPL-4 EVT-benzeri hücreler yayılır . Pro-MMP-2 ve MMP-9 ve aktif formları RCC yetiştirilen trofoblast hücreleri (Ref 7 izni ile uyarlanmıştır) tarafından salgılanan. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1 bir RCC yetiştirilen SGHPL-4 hücreleri (Ref 7 izni ile uyarlanmıştır) mikroarray sonuçları özeti. <ol class="lalpha"><li3-d normalize gen de monlayer agrega katlama ind a gibi hesaplan><li> Mono tabakaları algılama sınırının altında genler gösterir. </li></li3-d></ol>

<ol><li>Knofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).</li>
<li>Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+at+the+maternal-fetal+interface%3A+relevance+to+human+pregnancy+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.</a> Reproduction. 140, 803-803 (2010).</li>
<li>Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+Gabor+Than+Award+lecture%3A+Transformation+of+the+spiral+arteries+in+human+pregnancy%3A+key+events+in+the+remodelling+timeline%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline.</a> Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).</li>
<li>Whitley, G. S., Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast-mediated+spiral+artery+remodelling%3A+a+role+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis.</a> J. Anat. 215, 21-21 (2009).</li>
<li>Apps, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32, 33-33 (2011).</li>
<li>Bilban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+invasion%3A+assessment+of+cellular+models+using+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures.</a> Placenta. 31, 989-989 (2010).</li>
<li>LaMarca, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+growth+of+extravillous+cytotrophoblasts+promotes+differentiation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion.</a> Placenta. 26, 709-709 (2005).</li>
<li>Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-8+%28CXCL8%29+stimulates+trophoblast+cell+migration+and+invasion+by+increasing+levels+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%292+and+MMP9+and+integrins+alpha5+and+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1.</a> Reproduction. 139, 789-789 (2010).</li>
<li>Husslein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+regulation+and+functional+characterization+of+matrix+metalloproteinase-3+of+human+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast.</a> Placenta. 30, 284-284 (2009).</li>
<li>Barrila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+3D+cell+culture+models%3A+using+the+rotating+wall+vessel+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).</li>
<li>Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+tissues+in+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Growing tissues in microgravity.</a> Nat. Med. 4, 901-901 (1998).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).</li>
<li>Bentrup, H. önerzu, K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).</li>
<li>Carterson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).</li>
<li>Myers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+phenotypic+gap+between+transformed+neuronal+cell+lines+in+culture+and+untransformed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).</li>
<li>Hjelm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).</li>
<li>Straub, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+infectivity+assay+for+human+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).</li>
<li>Nickerson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+assemblies%3A+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).</li>
<li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol. J. 6, 103-103 (2009).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbooks%22">Handbooks</a>. , Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks">http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks</a> (2005).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Burada sunulan kültür tekniği son derece invaziv EVT-benzeri hücreler ile araştırmacılar sağlar. Şimdi farklılaşma kaybı hücresel yanıtları, üç boyutlu (apikal, bazal ve lateral hücre yüzeylerinde) 10,13 kimyasal ve moleküler ipuçları inhibisyonu nedeniyle mono tabakaları oluşur kabul edilmiştir . Bu teknik EVT hücreleri istila in utero not özelliklerini yansıtır. Prosedür geleneksel tek tabakalı doku kültürü zaman kinetiği taklit eder, ancak diferansiyel ifadesi ile hücreler sağlar, karşılaştırmalı ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Cytodex microcarrier boncuklar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> Döner Hücre Kültürü Sistemi (RCC) </td><td> Synthecon </td><td> RCC-D </td><td> Rotor tabanı, güç kaynağı, 4 tek RCC birimleri içerir </td></tr><tr><td> RCC Disposable Üniteleri </td><td> Synthecon </td><td> İletişim Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml Luer-Lock ucu şırınga </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml geniş ucu serolojik pipet </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 orta, toz </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, Endotoksin ücretsiz </td><td> Balıkçı </td><td> MT-25-055-CM </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> Fruktoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> Galaktoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> İnsülin-Transferrin-sodyum selenit (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan hücre kültürü döner hücre kültür sistemleri: bir model olarak İnsan trofoblast hücreleri

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Insan trofoblast araştırma alanında plasenta sırasında kurulan karmaşık bir ortamda anlama yardımcı olur. Bu çalışmalar doğası gereği, in vivo deney insan mümkün değildir. Primer kültürlerinde, eksplant kültürler ve trofoblast hücre hatları 1 bir arada rahim duvarına 2 işgali ve gebelik başarılı bir şekilde kurulması için gerekli olan extravillous trofoblast hücreleri (EVTs), rahim spiral arterler 3,4 remodeling anlayışımızı desteklemektedir. Bu modellerin toplanan bilginin zenginlik rağmen, in vivo meslektaşları 5,6 ile kıyaslandığında EVT gibi hücre hatları kullanılarak in vitro hücre kültür modelleri hücresel özellikleri değişmiş ekran kabul edilir. Dönen hücre kültür sistemi (RCC) kültür hücreler u daha yakından ayırt taklit EVT hücre hatları gibi, morfolojik, fenotipik ve fonksiyonel özellikleri görüntülerişgali (örneğin matriks metalloproteinazların (MMP)) ve trofoblast farklılaşma 7,8,9 aracılık genlerin artmış ekspresyonu ile Tero EVTs. Saint Georges Hastanesi Plasental hücre Line-4 (SGHPL 4) (nazik Dr Guy Whitley ve Dr. Judith Cartwright tarafından bağışlanan) RCC test etmek için kullanılan bir EVT gibi hücre hattı. RCC kültür geminin tasarımı, organ ve dokuların üç boyutlu (3-D) bir ortamda işlev olduğu ilkesine dayanmaktadır. Fizyolojik ilgili kayma koşulları da dahil olmak üzere, üç boyutlu olarak yetişen gemi dinamik kültür koşulları, hücreler nedeniyle doğal hücresel yakınlık temelinde bir araya toplanırlar ve doku gibi meclisleri Organotipik 10,11,12 farklılaşırlar. In vivo koşullara benzer bir düşük kesme, düşük türbülans ortamında bir sıvı yörüngesinin bakım sağlar. Kültürlü hücrelerinin Sedimantasyon dönme ayarlayarak karşıhücrelerin sürekli bir serbest düşüş sağlamak için RCC hızı. Gaz değişimi biyoreaktör arkasında bulunan geçirgen bir hidrofobik zarından oluşur. Ebeveyn in vivo doku gibi, RCC yetiştirilen hücreler, gözenekli microcarrier boncuk yüzey kültüre, çünkü üç boyutlu (yani, apikal, bazal ve lateral yüzeylerde), kimyasal ve moleküler gradyanlar yanıt vermek mümkün. Plastik gibi geçirimsiz yüzeylerde iki boyutlu mono tabakaları gibi büyüdüğü zaman, hücreler bazal yüzeyindeki bu önemli iletişim yoksun. Sonuç olarak, çevreye dayattığı mekansal kısıtlamalar derinden, böylece 3-D ortam 13 için önemli bir rol ima hücreleri çevreleyen mikroçevresinin duygusu ve decode sinyalleri nasıl etkileyecek. Biz, çeşitli insan epitel dokuların 7,14,15,16 biyolojik olarak anlamlı bir 3-D modellerin mühendisi RCC kullandık . Gerçekten de, çok daha önceki raporlarda demRCC kültür hücreleri diğer modelleri 10,17-21 mümkün olmayan fizyolojik ilgili fenotipleri varsayabiliriz hücre dizilerindeki ardışık. Özet olarak, RCC kültür farklılaşmış hücrelerin çeşitli deneysel manipülasyon için uygun olan çok sayıda sağlayan kolay, tekrarlanabilir, yüksek verimli bir platformu temsil eder. Aşağıdaki protokol, bir örnek olarak EVTs kullanarak, açıkça RCC üç boyutlu kültür yapışık hücreleri için gerekli adımları tanımlamak.

Geleneksel iki boyutlu hücre kültür teknikleri genellikle farklılaşma belirteçleri, sitokinler ve büyüme faktörleri açısından değişmiş özellikleri. Extravillous trofoblast hücre hattı ile burada gösterildiği gibi dönen hücre kültür sistemi Üç boyutlu hücre kültürü (RCC), bu faktörlerin çoğunun ifade yeniden kurar.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

İnsan trofoblast araştırmaları alanı, plasentasyon sırasında oluşturulan karmaşık ortamın anlaşılmasına yardımcı olur. Bunların doğası gereği...

Bu prosedür, in vivo hücre kinetiğini taklit etmek için üç boyutlu bir hücre kültürü sistemi kullanır. İşleme, hücreleri kollajen ENC kaplı boncuklarla inkübe ederek başlayın. Ardından, hücreleri ve boncukları döner bir hücre kültürü sistemine yükleyin ve düşük kayma gerilimli, düşük türbülanslı bir ortamda 3B hücre agregatlarını çoğaltın.Son olarak, tipik bir monokatmanda büyütülen hücrelerin gen ekspresyonu ve hücresel farklılaşmasıyla karşılaştırılacak aşağı akış uygulamalarında kullanılmak üzere hücreleri hasat edin. Elde edilen 3D kültürler, in vivo ortamı yakından taklit eden hücre kinetiği ve davranışları sergiler.Çeşitli insan epitelyal dokularının biyolojik olarak anlamlı 3D modellerini geliştirmek için RCCS kullandık. İş birliği yaptığım Dr. Sydney Morris'in laboratuvarında eski bir lisansüstü öğrencisi olan Dr. Jessica Warner, şimdi bu prosedürü EVT hücreleri ile gösterecek. 50 mililitrelik konik bir tüp içerisinde 12 mililitre DPBS içindeki 250 miligram mikro taşıyıcı cytodex three boncuğunu otoklavlayın. Hazırlanan boncukların şişmesini bekleyin ve oda sıcaklığına soğumalarını sağlayın.Ardından, steril koşullar altında toplam hacmi 12,5 mililitreye tamamlayın. DPBS kullanarak %80 konfluente ulaşmış ekstra villöz trofoblast hücre kültürünü hasat edin. Tripsin sindirimi kullanarak hazırlanan cytodex 3 boncuklarını nazikçe karıştırın ve geniş uçlu 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak 2,5 mililitreyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Cyto Dex 3 boncukları tüpün dibine çöktükten sonra, boncukları rahatsız etmeden üstteki DPBS tabakasını pipetle çekin. EVT hücrelerini Cyto Dex 3 boncukları ile karıştırın.Periyodik olarak karıştırarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından ara sıra karıştırarak hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika bekletin. Steril altılı kuyucuklu kültür plakasına 10 mililitrelik bir RCCS yerleştirin ve büyük tıpayı çıkarın. Şimdi, hücre boncuk karışımının toplam hacmini 10 mililitreye tamamlamak için ısıtılmış GTSF two medyumu ekleyin ve büyük port aracılığıyla RCCS'ye yükleyin.Büyük port tıpasını değiştirin ve küçük portları kapatın. Bir sonraki aşamada, iki küçük porta üç mililitrelik şırıngaları boşaltın. Her şırıngaya medya ekleyin.İki valfi yavaşça açın ve şırınga pistonlarını yerleştirin. İç haznedeki tüm hava kabarcıkları dışarı atılana kadar bir şırıngadan nazikçe besiyeri ekleyin. RCCS'yi kaldırın ve kabarcıkları kontrol etmek için cihazı döndürürken yan kısmına hafifçe vurun.Kabarcıklar küçük portun altına gelene kadar RCCS'yi döndürerek kalan kabarcıkları giderin. Ardından, kabarcıkları porta ve haznenin dışına itmek için karşı taraftaki şırıngayı nazikçe aşağıya doğru bastırın. Bir yan portu kapatmaya devam ederek, kap içerisine az miktarda pozitif basınç uygulamak için diğer şırınga pistonunu nazikçe aşağı bastırın ve basınç uygularken ikinci valfi kapatın.Son olarak RCCS'yi rotora yerleştirin. Optimal kültür koşulları için hücre kültürü inkübatöründe 19 RPM hızında döndürmeyi başlatın. İlk üç gün gün aşırı, sonrasında ise günlük olarak medyayı yenileyin.Öncelikle rotoru kapatın ve RCCS'yi çıkarın. Bir miktar vakum oluşturmak için pistonları yukarı çekin. Her bir küçük porttaki şırıngaları çıkarın, RCCS'yi eğimli bir şekilde yerleştirin ve boncukların büyük portun karşısında çökelmesini sağlayın.Şimdi, boncukları yerinden oynatmadan RCCS içindeki besiyerinin üçte ikisini bir atık kabına boşaltmak için küçük vanolardan birini açın. Küçük vanayı kapatın, ardından geniş portu açın. RCCS'ye besiyeri ekleyin ve tıpayı yerine takın, daha önce gösterildiği gibi tüm hava kabarcıklarını dışarı atın ve kültürü inkübatördeki rotatora yerleştirin.Agregatlar büyümeye başladığında, hücrelerin süspansiyon halinde kalmasını sağlamak için rotasyon hızını gözle görülür şekilde artırın. Hücreleri toplamak için RCCS'yi rotordan çıkarın.Her bir küçük porttaki şırıngaları atın ve boncukların büyük portun karşısına yönelmesi için RCCS'yi eğimli bir konuma getirin. Boncukların tamamı çöktükten sonra, küçük valflerden birini açın ve medyanın üçte birini bir atık konteynerine boşaltın. Küçük valfi kapatın ve büyük portu açın.Agregatları tekrar çözeltiye dağıtmak için kabı hafifçe çalkalayın ve hücreleri steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Toplanan agregatların konik tüpte çökelmesini bekledikten sonra, agregat geri kazanımını maksimize etmek için üst fazı (süpernatantı) kültür kabını tekrar iyice yıkamak için kullanın. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak agregatları, sonraki fonksiyonel analizler için hemen alıkotlayın.S-G-H-P-L dört trofoblast hücre hattı, ekstra villöz trofoblast benzeri hücrelere bir örnektir. Cyto X 3 üzerinde bir RCCS içinde büyütülen tipik bir agregatta, birçok boncuk çoğalan hücrelerle tamamen kaplanmıştır. Ana kümeden uzaklaşarak komşu kümelere bağlanan uzantılara dikkat edin.RCCS'den çıkarılıp bir hücre dışı matrise ekildikten sonra, 3 boyutlu büyütülmüş EVT benzeri hücreler agresif bir şekilde invaze eder ve/veya migrasyon gösterir. Nitekim, R-T-P-C-R verileri, geleneksel hücre kültürü monokatmanlarına kıyasla 3 boyutlu agregatlarda görülen MMP'lerin artmış ekspresyonunu doğrulamaktadır. İlginç bir şekilde, invazyonla ilişkili olmayan genler de RCCS'de yukarı regüle edilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, in vivo hücre kinetiğini daha yakından taklit eden üç boyutlu hücre kültürleri elde etmek için RCCS'yi hücre hattınız, primer hücreleriniz veya kök hücrelerinizle nasıl kullanacağınız konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız.

rotating-cell-culture-systems-for-human-cell-culture-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Organoidler, organ geliştirme, ilaç keşfi ve hastalık araştırmaları için kişiselleştirilmiş doku modellemesinde devrim yaratıyor. Organoid mühendisliği, karmaşık sentetik dokular oluşturmaya doğru ilerler. Amaç, doku mühendisliğini ilerletmek için morfogenez, assembloid teknolojisi ve biyomatrisleri entegre etmektir. Bu protokol, karaciğer organogenezinin modellenmesine ve sentetik doku yapımı için kılavuzların oluşturulmasına yardımcı olur.

Karaciğer Organogenezini Modellemek, Assembloidler Oluşturmak ve İnsan Hücre Hatlarını Kullanarak Sentetik Dokular Tasarlamak için İn Vitro Yetiştirme Teknikleri

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Öğrenin insan trofoblast hücrelerinde üç boyutlu döner hücre kültürü sistemini kullanarak in vivo benzeri hücre davranışlarını nasıl elde edeceğinizi. Bu yöntem farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonunu artırır.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

Daha fazla video keşfet