Name: HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Keşfedin HIV-1 çekirdeklerinin in vitro uncoating sürecini izole etme ve kinetik analiz yöntemleriyle. Bu teknik, viral yaşam döngüsü ve hücresel faktörlerin rolünü anlamak için viroloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HIV-1 Aiken laboratuvar uncoating çalışmalar NIH hibe AI40364 AI50423 ve AI076121 tarafından desteklenmiştir. P24 ELISA kullanılan reaktifler de dahil olmak üzere birçok önemli malzemeler, NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH tarafından verilmiştir.

1. HIV-1 parçacıkların üretimi Devam etmeden önce, izin almak gerekir ve bulaşıcı HIV için onaylanmış bir biyogüvenlik tesisinde çalışmak üzere kurum Biyogüvenlik ofis yönergeleri izleyin. Bunu uygun bakım sağlamak ve biyogüvenlik laboratuar çalışma sırasında güvenlik önlemleri takip edilmektedir. HIV-1 parçacıkların üretimi genellikle kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 7, 8 ile HIV-1 proviral DNA ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon tarafından yapılır. Bulaşmış T hücrelerinin kültürü ile yetişen yüksek titresi virüs hisse senetleri de uygundur. <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik ile desteklenmiş içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) Kültür 293T hücreleri [Penisilin (100 IU / ml) ve Streptomisin (100 mg / ml)] 37 ° C,% 5 CO 2 . </li><li> % 0.25 'lik tripsin-EDTA ve tohum 2x10 6 kullanarak yaklaşık konfluent yemekleri hücreleri Ayır </li><li> Ertesi gün, hücre mono tabakaları yaklaşık% 25 konfluent ve transfeksiyon için hazır olmalıdır. Transfekte hücreleri altı yemekleri için, 2.7 ml steril su ile hacmi 120 mikrogram proviral DNA getirmek. Bu karışımı 0.3 ml 2.5 M CaCl 2 ve 2XBBS 3 ml ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme düzgün karıştırın. Karışımı 10-20 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Karıştırmak için hafifçe dönen her yemeğin merkezine çıkan karışımı damla damla 1 ml ekleyin. Inkübatör 35 ° C ve% 3 CO 2 set gecede yemekler (~ 16 saat) yerleştirin. </li><li> Kültür ortamı aspire edin ve hafifçe 5 ml PBS ekleyin. </li><li> PBS aspire edin ve 5 ml taze orta ekleyin. 37 ve inkübatörde Kültür hücrelerideg C ve% 5 ek 24-48 saat için 2 CO. </li><li> Viral parçacıkların bulunduğu kültür süpernatant toplayın, 50 ml konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüm yemekler süpernatantlar birleştirin ve pelet hücreleri ve enkaz 5 dakika boyunca 1.500 xg'de santrifüj. 0.45 mikron gözenek boyutu şırınga filtreleri kullanarak süpernatantı Filtresi. Önlemler canlı virüs ile çalışırken aerosol oluşumunu en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Bu santrifüj basamağı sırasında O-ring veya rotor kova kapakları ile konik tüplerin kullanımını içerir. Bu mümkün değilse, tüpler, vidalı kapakları parafilm ile sarılmalıdır. </li></ol> 2. HIV-1 virionlar Ultrasantrifügasyon konsantrasyonu <ol><li> Kültür süpernatant 38.5 ml polyallomer santrifüj tüpüne (Beckman SW32Ti rotor veya eşdeğeri) (30 ml) koyun. 5 ml, 5 ml pipetlemeyin kullanarak PBS içinde% 20 sukroz solüsyonu ile virüs içeren süpernatant hafifçe altında yatan. </li><li> 3 saat santrifüj32.000 rpm, 4 ° C (r max 175.000 xg) pelet virüs partikülleri. </li><li> Tüpün dibinde pelet rahatsız etmemek için özen, aspirasyon ile süpernatantı. 0.5 ml 1XSTE tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA), 4 tüp ve yere ° C'de 1 saat pelet gevşetmek için. Hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı birkaç kez tüp alt pelet ayırmak için geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanma. Sonraki köpük önlemek için özen gevşetti pelet, 1,5 ml mikrosantrifüj tüp transferi. Küçük öbekler virüs dağıtmak için izin vermek için başka bir 1-3 saat için 4 ° C'de inkübe edin. Bu dönemde, sukroz gradient adım 3.1 'de açıklandığı gibi hazırlayın. </li><li> Yavaşça pipetlemeyin virüs süspansiyon yukarı ve aşağı birkaç kez ve 8,000 rpm (6.000 xg), 4 ° C, 1 dakika boyunca buzdolabında mikrofuge'de santrifüj kalan kümeleri kaldırın. Bu işlem sırasında numune soğuk tutun. </li></ol> 3. Sakkaroz degradeçekirdek izole için santrifüj HIV-1 çekirdekleri HIV-2 çekirdek (10) arıtma için daha önce açıklanan yöntemi bir değişiklik bir "spin-thru" yöntemi 9 kullanılarak izole edilmiştir. <ol><li> 14.5 ml polyallomer SW32.1Ti rotor için bir santrifüj tüpüne 12 ml 1XSTE tampon doğrusal% 30 -% 70 sukroz gradient hazırlayın. Degrade hazırlamak için, eski bir 20 ml degrade kullanmak; yakın tarafında yer% 70 sakaroz çözeltisini 6 ml (çıkış bağlantı noktasına yakın) ve uzak tarafında% 30 sakaroz çözeltisini 6 ml. Hava kabarcıkları, iki odadan birbirine bağlayan kanal kapana kısılmış olmadığından emin olun. Otomatik alttan 1 ml% 85 sakaroz çözeltisini altta içeren tüpün üst degrade pompa eski yoğunlukları Akış degrade kullanın. Yavaşça 4 degrade ° C soğutmalı kadar (2-4 saat). </li><li> Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak hafifçe 0.25 ml,% 15 sakaroz çözeltisini ile% 1 Triton X-100 içeren STE gradient overlay. </li> Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak STE% 7.5 sakaroz çözeltisini 0.25 ml yavaşça kaplaması. Katmanları karıştırmak için dikkatli olun. <li> Adım 2.4 'ten 0.5 ml virus süspansiyonu ile yavaşça bindirme. Bu adım, herhangi bir degrade bozukluğu ve underlaid sakaroz katmanları karıştırma önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> 4 gecede 32.000 rpm (r max 187.000 xg) (16-20 saat) önceden soğutulmuş SW32.1Ti kova ve santrifüj ° C tüpler yerleştirin Santrifüj vakum 250 mikron ulaşıncaya kadar santrifüj duraklamadan önlemek için, santrifüj başlamayın </li><li> 1 ml üstten Otomatik yoğunlukları Akış degrade parçalama kullanarak degrade alt fraksiyonları toplayın. Toplama üzerine tüpler hemen buz koyun. Tüplerin içeriği tersini birkaç kez karıştırın ve ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay ölçümü için her bir fraksiyonu 50 ul çekilme. </li></ol> 4. HIV-1 çekirdek yerelleştirilmesive çekirdek depolama <ol><li> Uncoating testleri yapmadan önce, bu kesirler sağlam HIV-1 çekirdek içeren belirlemek için önemlidir. Bu p24 ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay adım 3.6 50 ul alikotları kullanarak tespit edilebilir. </li><li> Çekirdeği ile ilişkili CA kurtarma genellikle çekirdek istikrar ile ilgili. P24 ELISA 9 her fraksiyon bir örnek kullanarak çekirdek ilişkili CA ölçün. Alternatif olarak, her bir fraksiyonu ters transkriptaz aktivitesini ölçmek. Her iki yöntem kullanılarak zirveye fraksiyonu 10 civarında olmalıdır. </li><li> Çekirdek içeren fraksiyonları Havuzu. Çekirdek içine toplanmış çekirdek, 0,2 - 0,3 ml alikotları -80 sıvı N2 ve mağaza flaş dondurucu ° C hemen kısım tahlil uncoating için kullanılacak değilse Bu şekilde dondurulmuş Çekirdek uncoating tayini için uygundur. Çekirdek ilişkili CA verimi genellikle p24 mililitrede 1-2 mg veya yaklaşık% 15 toplam virion ilişkilip24. </li></ol> 5. HIV-1 uncoating Kinetik tahlil <ol><li> Uncoating reaksiyon başına gerekli HIV-1 çekirdek miktarı yaklaşık 50 ng. In vitro uncoating tayininde gerçekleştirmek için, süspansiyonun viskozitesini azaltmak için çekirdek kısım soğuk 1XSTE tampon eşit hacimde seyreltme ve pipetleme hataları en aza indirmek için. </li><li> Ayrıca, 0.15 ml, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 mcg / ml BSA içeren soğuk 1XSTE tampon çekirdek 100 ul sulandırmak. Biz tüpün duvarlarına CA adsorpsiyonu en aza indirmek için, BSA (10 mg / ml) ile STE tampon tamamlar. Tersine tüp birkaç kez karıştırın. Örnekleri girdap etmeyin. 37 az bir su banyosunda tüpleri ° C'de zaman aralıklarında (15, 30, 60 ve 120 dk). Tüpler hatta ısınma sağlamak için en azından iç örnek düzeyde su banyosuna daldırılmış olmalıdır. </li><li> İnkübasyon sırasında, yavaşça (genellikle 5 periyodik tüp içeriği karıştırmakTüp Flicking 10 dk). Sıfır dakika kontrolü için, 0.15 ml soğuk 1XSTE tampon içine çekirdek 100 ul sulandırmak ve tüm uzunluğu (120 dk) deney için buz üzerinde inkübe. Sıfır dakika kontrolünde bazal uncoating değeri verir ve 37 ° C farklı zaman aralıklarında inkübe çekirdeği, uncoating artışı belirlemek için kullanılır. </li><li> Kuluçka döneminin sonunda, tüpler 10 dakika boyunca buz koyarak uncoating işlemini durdurmak. </li><li> 45.000 rpm (TLA-55 rotor; r maksimum 125.000 xg) tüpler Santrifüj az 20 dakika süreyle 4 ° C Bu pelet çekirdek uncoating bir sonucu olarak piyasaya sağlam bir çekirdek ve serbest CA süpernatantı kalacaktır. Rotor, 4 ° C örnekleri önce yükleme precooled olmalıdır. </li><li> Tercihen oda sıcaklığında saklanan jel yükleme ipuçları kullanarak yeni precooled mikrofuge'ye tüpleri süpernatantı aktarın. Pelet çıplak gözle görülebilen olmayacağını lütfen unutmayın, bu yüzden, çok dikkatli wsüpernatantı pipetleme hile. ELISA örnek seyreltici (PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve 5% Donör buzağı serumu) 250 ul pelet tekrar ELISA örnek seyreltici ekledikten sonra pelet etkin bir şekilde çözülmesini, vorteks sağlamak. Aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi p24 ELISA kullanarak pelet ve süpernatant CA içerik sayısal olmalıdır. </li><li> Uncoating kapsamı süpernatantı CA kesir hesaplanması ile elde edilir. </li></ol> 6. P24 ELISA yöntemi ile CA Testi <ol><li> Birçok ticari ELISA kitleri mevcuttur ve CA ölçmek için kullanılabilir. Kullanın ve herhangi bir ticari veya "in-house" ELISA testinin doğrusallık belirlemek için p24 standartları içerir. Numunelerin çözeltiler doğruluğunu sağlamak için çalışılmalıdır. </li><li> Biz rutin CA için tahlil için kullanabileceğiniz bir ev yapımı ELISA yöntemi geliştirdik. Prosedür, bir önceki rapordan 11 uyarlanmıştır ve NIH YARDIM edinilebilir yakalama ve dedektör antikorlar kullanılarak yapılırS Araştırma ve Referans Reaktif Programı. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: ELISA sonucu çekirdek içeren fraksiyonları belirlemek için bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. Fraksiyonları (1 ml) topladıktan sonra, her bir fraksiyonu 50 ul örnek seri dilüsyonları yapmak için kullanılır ve ELISA yöntemi ile analiz edilmiştir. Oniki kesirler değerler ekleyerek elde edilen toplam p24 14.5 mikrogram oldu. Rakam kesirler 8 ile 10 çekirdeği içerdiği gösterilmiştir. Çekirdek içeren fraksiyonlar için p24 değeri 2.17 mg. Çekirdek kesirler için p24 değeri oranı (2.17 mcg), toplam p24 değeri (14.5 mikrogram) alarak çekirdek ilişkili p24 yüzdesi (% 14.97) tespit edildi. Kesir 1 veya 2, p24, her zaman yüksek miktarda içerir; bu çekirdek ile ilişkili değildir ücretsiz CA temsil eder. Bu, sonraki her fraksiyonu ile p24 değerleri kademeli olarak azaltılması, sonra keskin bir artış ve p24 nihayet keskin bir düşüş takip ediyordeğerleri. Degrade yüklenirken uygun bakım alınırsa sonra çekirdek ilişkili CA zirve fraksiyonu 10 civarında bulunmuştur. HIV-1 çekirdek uncoating kinetiği assaying elde edilen tipik bir sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir. Grafik, yabani tip HIV-1 çekirdek uncoating bir zamana bağımlı bir artış gösterir. Süpernatantı CA kesir hesaplanmak suretiyle yüzde uncoating değeri elde edildi. Uygulama ile, testin yüksek tekrarlanabilir ve in vitro olarak viral çekirdek istikrar belirlemek için yararlıdır. Testin tekrarlanabilirliği, işlem sırasında örneklerin uygun taşıma son derece bağımlı olduğunu lütfen unutmayınız. Çekirdek ısıya dayanıksız olduğundan, örnekleri ° C tahlil boyunca kuluçka dönemi sırasında dışında 4 muhafaza edilmelidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Denge yoğunluk gradiyenti santrifüjHIV-1 çekirdek. % 1 Triton X-100 ile üst üste% 30 ila% 70 doğrusal sukroz gradient üst konsantre bir virüs süspansiyonu uygulandı. 187.000 xg ve 4 geceleme santrifüj sonrasında ° C, 1 ml kesirler yukarıdan aşağıya (Kesir 1) (Kesir 12) toplandı ve p24 ELISA yöntemi ile belirlendi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> In vitro HIV-1 uncoating 2 Saat dersin Şekil. Saflaştırılmış HIV-1 çekirdekleri ° C belirtilen zaman aralıkları için seyreltilmiş ve 37 saat inkübe edildi. Sıfır min örnek deney tamamı boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Inkübasyon sonrasında, örnekler 4 ° C'de 20 dakika boyunca 125.000 xg'de ultra santrifüje edildi Süpernatant ve pelet p24 ELISA ile ayrılmış ve analiz edildi. Protokol metninde açıklandığı gibi uncoating bir ölçüde tespit edildi. Her uncoating tepki yinelenen yapıldı; hata çubuklarını iki değer aralığına yayılır.

<ol><li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li>
<li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV.+AIDS%22%5BJournal%5D)">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li>
<li>Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li>
<li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li>
<li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiken%2C+C+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).</li>
<li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li>
<li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li>
<li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li>
<li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+authentic%2C+mature+HIV-1+virions+and+cores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li>
<li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li>
<li>Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores%3A+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6%28gag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem, hedef hücreleri, HIV-1 uncoating analiz etmek için geçerli bir yöntem olmaması nedeniyle bu aşamada, HIV-1 yaşam döngüsü eğitimi için yararlı in vitro uncoating çalışmada HIV-1 çekirdek arındırmak için buraya nitelendirdi. Bu yöntem, çekirdek arındırmak için denge Ultrasantrifügasyon kullanıyor olsa da, diğerleri ile kısa Parçalama işleminden sonra doğrudan peletleme kullandık% 1 Triton X-100, 12, 13 ya da% 0,1 Triton X-100, 14, 15 ile üst üste sakaroz yastık yoluyla peletleme. <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Reaktifi Adı </td><td width="197"> Şirket </td><td width="114"> Katalog numarası </td><td width="161"> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker A.Ş. </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 &#39;lik tripsin-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Kompozisyon: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl ve 1.5 mM Na 2 HPO 4. PH 6.95 ile ayarlayınoda sıcaklığında. Sterilize &amp; Süzgeç alikotları -20 ° C&#39;de saklamak, </td></tr><tr><td> Kaplama antikor: p24 için monoklonal antikor (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primer antikor: HIV-Ig (hiper-immün insan hasta serum) </td><td> NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> İkincil antikor: Keçi anti-insan IgG, konjuge peroksidaz </td><td> Delmek </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP substrat </td><td> KPL Inc. </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 kuyucuğu </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti ve SW32.1 Ti rotorları ve uyumlu ultrasantrifüjdeki </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotor ve masaüstü ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Yüksek hızda mikrofuge&#39;ye borular </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326.823, 358.123, 357.448 </td><td></td></tr><tr><td> Otomatik yoğunlukları Akış yoğunluk gradiyenti parçalama </td><td> Labconco Corp. </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradient Eski </td><td> CBS Bilimsel A.Ş. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

hiv-1 Çekirdek in vitro uncoating

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Retrovirüsler genom lipid bir zarf tarafından çevrili bir kapsid kaplı. HIV-1 olarak lentiviruses için altıgen bir kafes olarak düzenlenmiştir CA protein, konik kapsid kabuk oluşur. Kapsid dar sonunda koni 1, 2, 7 pentamers geniş sonunda ve 5 kapalı . Bu kapsid kabuk kaplı viral ribonükleoprotein kompleksi ve birlikte çekirdek oluşturur. HIV-1, hedef hücre zarı ile viral membran füzyonu takiben, sitoplazmaya salınır. Kapsid sonra uncoating olarak adlandırılan bir süreç içinde çözünür formu 3 CA serbest bırakmadan sökülebilir. HIV-1 uncoating hücre içi konumu ve zamanlama tam olarak anlaşılamamıştır. Kapsid istikrarı değiştirmez CA Tek amino asit yer değiştirmelerin hücreleri 4 bulaştırmak için de HIV-1 yeteneğini bozar. Bu kapsid istikrarı HIV-1 enfeksiyonu için kritik olduğunu gösterir. </p&gt; HIV-1 uncoating Bu işlem için duyarlı ve güvenilir testlerin mevcudiyeti eksikliği nedeniyle çalışma zor olmuştur. Burada bulaşıcı HIV-1 parçacıkları izole çekirdeği kullanılarak in vitro uncoating çalışmak için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşımı soğuk, deterjan ve doğrusal bir sukroz gradient katmanı üzerinden konsantre virionlar sedimentasyon çekirdek izolasyonu içerir. Uncoating ölçmek için, izole çekirdek 37 inkübe ° C çeşitli zaman aralıklarında ve Ultrasantrifügasyon tarafından sonradan pelet. Uncoating kapsamı süpernatantı CA kısmını nicel analiz edilir. Bu yaklaşım, HIV-1 kapsid istikrar 4, 5, 6 viral mutasyonların etkilerini analiz etmek için istihdam edilmiştir . Ayrıca HIV-1 uncoating hücresel faktörlerin rol çalışmak için yararlı olacaktır.

Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri göstermek<em&gt; In vitro</em&gt;.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

Retrovirüslerin genomu, lipid bir zarla çevrelenmiş bir kapsid içerisindedir. HIV-1 gibi lentivirüsler için konik kapsid kabuğu...

Bu prosedürün genel amacı, HIV-1'in in vitro ENC kaplamasını gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle HIV-1 partiküllerinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Varyantlar daha sonra ultrasantrifüjleme ile konsantre edilir. Bir sonraki adım, sükroz gradyan ultrasantrifüjlemesi yoluyla virüslerin izole edilmesidir.Son olarak, HIV-1 kapsid açılımının kinetik analizi gerçekleştirilir. Elde edilen sonuçlar, pellet ve süpernatanttaki ca içeriğinin ELISA ile miktar tayini yoluyla HIV-1'in zamana bağlı kapsid açılımını göstermektedir. Bu yöntem, HIV-1 alanıyla ilgili olarak, hücresel faktörlerin kapsid açılımındaki rolü ve mutasyonların virüs kapsid stabilitesi üzerindeki etkisi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bulaşıcı HIV-1 ile biyogüvenlik tesisinde çalışmak için kurumunuzun biyogüvenlik ofisinden izin almalı ve yönergelerine uymalısınız. Biyogüvenlik laboratuvarında çalışırken uygun taşıma ve bakım önlemleri alınmalıdır. Bu gösterimde, 293T hücrelerinin HIV-1 proviral DNA ile geçici transfeksiyonu yoluyla HIV-1 partikülleri üretilmektedir.Transfeksiyondan bir gün önce, kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullanarak, önceden kültüre edilmiş 2 9 3 T hücreleri elde edild

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Bu protokol, HIV-1 nükleokapsid proteininin şaperon aktivitelerini in vitro olarak inhibe edebilen moleküllerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına izin veren bir test olan NAME'yi tanımlar.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

Burada, HIV-1 Gag ve lipid membranları arasındaki etkileşimlerin, buğday tohumu bazlı in vitro translasyon sisteminde sentezlenen YFP etiketli Gag ve bir elektroformasyon tekniği ile hazırlanan GUV'ler kullanılarak görsel olarak analiz edildiği bir in vitro membran bağlanma testini gösteriyoruz.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

Bu rapor, akut enfekte olmuş hücrelerin sitoplazmik ekstraktlarında insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) ön entegrasyon kompleksi (PIC) ile ilişkili entegrasyon aktivitesini ölçmek için bir in vitro testi açıklar. PIC ile ilişkili HIV-1 DNA'sının heterolog hedef DNA'ya entegrasyonu, iç içe geçmiş bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu stratejisi kullanılarak ölçülür.

Ölçümü İn Vitro HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

Bu yöntem, in situ hücresel kriyotomografi ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için elektron mikroskobu (EM) ızgaralarının hazırlanması için erişilebilir ve esnek bir protokol sağlar.

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Keşfedin HIV-1 çekirdeklerinin in vitro uncoating sürecini izole etme ve kinetik analiz yöntemleriyle. Bu teknik, viral yaşam döngüsü ve hücresel faktörlerin rolünü anlamak için viroloji araştırmalarına katkı sağlar.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

Daha fazla video keşfet