Name: Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin vomeronazal organ (VNO) nöronlarında feromon yanıtlarını görüntülemek için canlı doku dilimleri hazırlama yöntemini. G-CaMP2 ifadeli transgenik fareler kullanılarak sinirbilim araştırmalarında kimyasal iletişim mekanizmaları incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hayvan bakımı ve teknik hizmetler konusundaki mükemmel destekleri için Andrea Moran'a ve Stowers Institute bünyesindeki Laboratuvar Hayvan Hizmetleri Tesisi (LASF) üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Stowers Institute ve NIH (NIDCD 008003) tarafından CRY'ye sağlanan finansmanla desteklenmiştir. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal İşitme ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. tetO-G-CaMP2 fareleri için Stowers Institute, CRY ve LM adına ABD patent başvurusu sürmektedir.

<ol><li>Birch, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirch%2C+MC+%22Pheromones%22">Pheromones</a>. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).</li>
<li>Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).</li>
<li>Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vomeronasal+organ+mediates+interspecies+defensive+behaviors+through+detection+of+protein+pheromone+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs.</a> Cell. 141, 692-703 (2010).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li>
<li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographically+organized+and+sexually+dimorphic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li>
<li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li>
<li>Ryba, N. J., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Neuron. 19, 371-379 (1997).</li>
<li>Pantages, E., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+candidate+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel family of candidate pheromone receptors in mammals.</a> Neuron. 28, 835-845 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+and+vomeronasal+receptor+genes+in+two+mouse+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies.</a> Genomics. 83, 802-811 (2004).</li>
<li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li>
<li>Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+and+isolated+families+within+the+mouse+superfamily+of+V1r+vomeronasal+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors.</a> Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).</li>
<li>He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+gender+and+individual+information+in+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ.</a> Science. 320, 535-538 (2008).</li>
<li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Chamero, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+pheromones+that+promote+aggressive+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour.</a> Nature. 450, 899-902 (2007).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+peptides+from+exocrine+glands+stimulate+mouse+vomeronasal+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons.</a> Nature. 437, 898-901 (2005).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+and+%5BCa2%2B%5D+with+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Vomeronasal reseptörlerin (VR'ler) çoğunluğu, Dulac ve Axel tarafından keşfedildiklerinden beri 5 orfan reseptörler olarak kalmıştır. Bu kemosensör reseptörlerin feromon ligandları ve hayvan davranışlarını yönetmedeki rolleri henüz yeterince anlaşılamamıştır. Şimdiye kadar yalnızca bir ligand/reseptör çifti, ESP1 peptidi ve bunun eş reseptörü Vmn2r116 (V2Rp5), tanımlanmış ve spesifik sosyal bilgileri ilettiği gösterilmiştir 19,23. Bir başka reseptör olan V1rb2'nin, muhtemelen dişi fare idrarında zen...

görüntüleme nöronal cevaplar vomeronasal organ dilim hazırlıklar genetiği kodlanmış kalsiyum sensör ifade

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Vomeronazal organ (VNO), aynı türdeki bireylerin sosyal, cinsel ve reprodüktif durumları hakkında bilgi taşıyan kemosensör sinyalleri algılar 1,2. Bu tür içi sinyaller olan feromonlar ve bazı yırtıcılardan gelen sinyaller 3, vomeronazal duyusal nöronları (VSN'ler) yüksek düzeyde özgünlük ve hassasiyetle aktive eder 4. Kemosensör ipuçlarının algılanmasını sağlamak için VNO nöronlarında G-protein kenetli reseptörlerin en az üç farklı ailesi, V1R, V2R ve FPR 5-14, eksprese edilir. Feromon bilgisinin VNO tarafından nasıl kodlandığını anlamak için, tekil VSN'lerin çeşitli uyaranlara karşı verdikleri yanıt profillerini analiz etmek ve bu yanıtları yöneten spesifik reseptörleri belirlemek kritik önem taşır.
VNO'nun nöroepitelyumları bir çift vomer kemiği ile çevrilidir. VNO'nun yarı kör tübüler yapısının, burun boşluğuna bağlanan bir açık ucu (vomeronazal kanal) vardır. VSN'ler dendritlerini, feromon sinyallerinin dendritik yumrularda eksprese edilen reseptörlerle temas ettiği VNO'nun lümen kısmına uzatırlar. VSN'lerin hücre gövdeleri, apikal ve bazal katmanlarda sırasıyla V1R ve V2R eksprese edilen yalancı tabakalı katmanlar oluşturur 6-8. VSN'lerin duyusal uyarılara verdiği yanıtları izlemek için çeşitli teknikler kullanılmıştır 4,12,15-19. Bu teknikler arasında, akut dilim preparasyonu birçok avantaj sunar. Birincisi, disosiye VSN'lerle 3,17 karşılaştırıldığında, dilim preparasyonları nöronları doğal morfolojilerinde tutar ve hücrelerin dendritleri nispeten bozulmadan kalır. İkincisi, tüm epitel ve whole-mount preparasyonlara kıyasla 12,20, VNO'nun koronal dilimlerinde VSN'lerin hücre gövdelerine elektrofizyoloji çalışmaları ve görüntüleme deneyleri için kolayca erişilebilir. Üçüncüsü, bu yöntem, reseptör tanımlamaya olanak sağlamak için moleküler klonlama teknikleriyle birleştirilebilir.
Duyusal stimülasyon, VSN'lerde reseptör aktivasyonunun göstergesi olan güçlü bir Ca2+ girişini tetikler 4,21. Bu nedenle, VSN'ler dahil olmak üzere olfaktör duyusal nöronlarda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler geliştirdik 15,22. Probun hassasiyeti ve genetik doğası, Ca2+ görüntüleme deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırmaktadır. Bu yöntem, önceki çalışmalarda kullanılan boya yükleme sürecini ortadan kaldırmıştır 4,21. Ayrıca, VNO dilimlerine çeşitli stimülüslerin uygulanmasına olanak tanıyan bir ligand iletim sistemi kullanıyoruz. İki tekniğin kombinasyonu, çok sayıda stimülüse yanıt olarak birden fazla nöronun eş zamanlı olarak izlenmesini sağlamaktadır. Son olarak, görüntü işlemeye yardımcı olmak amacıyla yarı otomatik bir analiz hattı oluşturduk.

Vomeronazal organ (VNO), sosyal ve üreme bilgilerini ileten tür içi kimyasal sinyalleri tespit eder. VNO dokusunda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler kullanarak Ca2+ görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, vomeronazal nöronların çok sayıda feromon uyarısına verdiği karmaşık yanıt modellerini analiz etmemize olanak tanır.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Vomeronazal organ (VNO), bireylerin sosyal, cinsel ve üreme durumları hakkında bilgi taşıyan kemosensör sinyalleri tespit eder...

Bu prosedürün genel amacı, MRO nazal organ nöronlarındaki feromon yanıtlarının görüntülenmesi için canlı doku kesitlerinin nasıl hazırlanacağını göstermektir. Bu işlem, öncelikle genetik bir kalsiyum indikatörü olan GCaMP iki eksprese eden farelerden canlı MRO nazal organ veya VNO doku kesitleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, kesiti muhafaza etmek, stimulus uygulamak ve görüntüleme yapmak için mikroskop tablası üzerinde perfüzyon sisteminin kurulmasıdır.Yanıt. Ardından, çeşitli feromon stimülasyonları ile bir zaman ayarlı görüntüleme deneyi gerçekleştirilir ve görüntüleme sonuçlarının veri analizi yapılır. Nihayetinde, VNO nöronlarının farklı feromon stimülasyonlarına verdiği yanıt paternleri elde edilir.Bu tekniğin veya kalsiyum D yüklemesi ya da disosiye hücrelerde görüntüleme gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, hücrelerin bozulmamış morfolojisini koruyabilmemiz, dilimlerin sağlığını daha iyi muhafaza edebilmemiz ve daha güçlü bir sinyal elde edebilmemizdir. Bu yöntem; ligandların ve reseptörlerinin belirlenmesi ve bireysel solucan burun nöron yanıtlarının profillenmesi gibi, sıcak burun sistemi çalışmalarındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ayrıca olfaktör, serum veya beyin psoriasis gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, iyi sedef hastalığı örnekleri elde etmenin zorluğu ve profüzyon sisteminin kurulumu nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu prosedüre başlamadan önce; fare, yapay serebrospinal sıvı ringer çözeltisi, %4 düşük erime noktalı agaroz ve feromon uyaranları dahil olmak üzere gerekli çözeltileri beraberindeki el yazmasına göre hazırlayın. Ardından, düşük erime noktalı agaroz içeren iki tüpü ısıtma bloğuna yerleştirin.Agarozu eritmek için sıcaklığı 60 °C'nin üzerine ayarlayın. Jel sıvılaştığında tüpleri 37 °C'lik bir ısıtma bloğuna aktarın. VNO dilimlerini hazırlamak için.Ötanazi uygulanmış bir GCaMP two faresinin kafası kesildikten sonra, alt çeneyi çıkarmak için mandibula kemikleri bir makasla kesin. Ardından, burun boşluğunu açığa çıkarmak için tırtıklı üst damak dokusunu soyun. Daha sonra, iki ön kesici dişin arasına cerrahi bir bıçak yerleştirerek çene kemiklerini birbirinden ayırın.VNO'yu açığa çıkarmak için çene kemiğini dikkatlice çıkarın. Bu noktada, kuyruk kemiğinden tutarak tüm VNO'yu burun boşluğundan yukarı kaldırın. VNO'yu soğuk oksijenlendirilmiş fare A CSF solüsyonuna aktarın.Dissection mikroskobunun altında, pens uçlarını septal kemik duvarı boyunca nazikçe kaydırarak iki vno'yu birbirinden ayırın. VNO dokusunu çevreleyen vulner kemiğini soyun. Ardından, tüm VI NO dokusunu kemik boşluğundan nazikçe kaldırın.Nöroepitelyuma zarar vermemek için bu adımda aşırı dikkatli olunmalıdır. Ardından, doku yüzeyinde kalan küçük kemik parçaları tamamen temizlenmelidir. Kalan parçalar gömülmeden önce.Kesme bıçağı dokuyu yakalayarak aros bloğundan dışarı çekebilir. Bundan sonra, forseps ile VNO dokusunun posterior ucunu tutun ve dokuyu nazikçe eritilmiş arosun içine daldırın. Tüpü buz üzerinde hızla soğutun.Aros'u katılaştırmak için, gömme ve soğutma işlemi iki dakikadan kısa sürmelidir. Ardından, VNO içeren aros bloğunu kesin ve doku tutucuya yapıştırın. Sonrasında, doku tutucuyu metal silindirin içine yerleştirin ve kalan boşluğu ek düşük erime noktalı aros ile doldurun.Düşük erime noktalı agar buz üzerinde katılaştıktan sonra, hemen kesme işlemine geçin; doku dilimleyici cihazın kesme haznesine soğuk, oksijenlenmiş fare A CSF ekleyin ve her bir dilimi 180 ile 200 mikron kalınlığında kesin. Ardından, kesilen dilimleri toplayıp inkübasyon haznesine aktarın. Dilimler, oda sıcaklığındaki oksijenlenmiş fare A CSF içerisinde altı ila sekiz saat boyunca canlı kalabilir.Bu prosedürde, öncelikle bir VNO kesitini perfüzyon odasının ortasına yerleştirin ve kesiti bir kesit sabitleyici ile aşağıda tutun. Sabitleyicinin dişleri, kesitin sadece düşük erime noktalı aros kısmına baskı yapmalı, VNO dokusuna baskı yapmamalıdır. Ardından, oksijenlenmiş fare A CSF'sini giriş portu aracılığıyla perfüzyon odasına saniyede yaklaşık 100 microliters hızla iletin.Taze fare A BOS'unun sürekli akışını sağlamak için sıvı, çıkış portu aracılığıyla bir vakum iğnesi ile tahliye edilir. Ardından, 30 mililitrelik bir şırıngayı ringer çözeltisi ile doldurun ve şırınga pompasına sabitleyin. Pompa hızını dakikada 300 ila 600 mikrolitre olarak ayarlayın.Kesit üzerine sürekli bir ringer solüsyonu akışı sağlamak için, ringerlerin çıkışını A-H-P-L-C enjeksiyon döngüsüne bağlayın. Enjeksiyon döngüsü kontrolü iki akış yoluna sahiptir. Yükleme konumunda, fare idrarı örneğini bir Hamilton hassas şırınga ile örnek döngüsüne yükleyin.Fazla numune, numune döngüsünden atık çıkışı aracılığıyla dışarı atılır. Şırınga pompası tarafından enjekte edilen Ringer çözeltisi, numune döngüsünü baypas ederek doğrudan enjeksiyon konumundaki perfüzyon ucuna bağlı olan çıkışa gider. Pompa çözeltisi numune döngüsünden akarak feromon stimülasyonlarını çıkışa doğru iter.Görüntüleme deneyinden önce, perfüzyon sıvısının sorunsuz akışını sağlamak için hava kabarcıklarını giderin. Ardından, perfüzyon ucunu 5x veya 10x objektif altında, uç vien O kesitinden yaklaşık bir milimetre uzaklıkta olacak şekilde ayarlayın.Örnek gecikme süresini ve süresini ölçmek için, %0,1 rho domine six G boyasıyla floresan boya yüklemesi yaparak örnek döngüsüne aktarın. Ardından valfi enjeksiyon konumuna getirin. Görüntüleme başlangıcından beş saniye sonra, 10 ila 30 saniye arasında floresan sinyalini tespit edin.Floresan sinyalinin pürüzsüz eğrisi, daldırma lensinin altında çok az türbülans oluştuğunu ve laboratuvarımızda oksijenlendirilmiş fare A CSF'sinin dilime yeterli düzeyde perfüzyonunun sağlandığını göstermektedir. GAMP iki sinyallerini tespit etmek için yapılan zaman ayarlı görüntülemede, 10 x veya 20 x su daldırma lensine sahip Zeiss Axio scope FS iki mikroskobu kullanılır. Standart 450 ila 490 nanometre GFP bant geçiren filtre kullanılır.Epi floresan görüntüler, GCaMP two ekspresyon seviyelerine bağlı olarak birer birer veya ikişer ikişer döndürme yapan bir CCD kamera ile elde edilir. İlk olarak, görüntüleme hızını saniyede bir kareye ayarlayın. GCaMP two sinyallerinin beyazlamasını ve hücrelerin fotohasarını en aza indirmek için ışık yoğunluğunu ayarlayın.Ardından, bir deney seti içindeki tüm denemelerde tutarlı zaman gecikmeleri elde etmek için valfi belirli bir zaman noktasında enjeksiyon konumuna getirin. Şimdi, stimülüs olarak ringer çözeltisi kullanarak bir test çalışması gerçekleştirin ve numune enjeksiyonu sırasında hareket artefaktı oluşursa perfüzyon düzeneğini yeniden ayarlayın. Bundan sonra, farklı numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için çözeltide 1:100 oranında seyreltilmiş fare idrarı ile bir pozitif kontrol çalışması gerçekleştirin.Bir uyaran yüklendikten sonra Hamilton şırıngasını ringer çözeltisi ile en az üç kez yıkayın. Benzer şekilde, farklı uyaranlar uygulanmadan önce örnek döngüsünü (sample loop) ringer çözeltisi ile en az üç kez yıkayın. Bir kesitten elde edilen tüm görüntülerin görüntü kaydını (image registration) gerçekleştirebilmek için, bir sonraki uyaran öncesinde MRO nazal duyusal nöronlarının toparlanması için dört ila 10 dakika bekleyin.Bu süreci otomatikleştirmek için Avision'da özel olarak yazılmış bir VBA betiği kullanılır. Bu durumda, aynı deney içindeki tüm görüntü kareleri, yanıt veren hücreleri belirlemek amacıyla görüntü çıkarma işlemi gerçekleştirmek için elastik yöntemle seçilen ortak bir referans kareye göre kaydedilir. Bu süreci otomatikleştirmek için ImageJ sürüm 1.42'deki özel olarak yazılmış makrolar kullanılır.Her yığın için bir minimum projeksiyon görüntüsü oluşturulur ve yanıt veren hücreler, minimum projeksiyonun ham yığınlardan çıkarılmasının ardından belirginleşir. Ardından, çıkarılmış yığınlar üzerinden ilgi alanı belirlenir ve Image J'deki multi mesure eklentisi kullanılarak ROI koordinatları elde edilir. Daha sonra, tek bir deney için tüm yığınlar işlenir ve tüm ROI koordinatları bir ROI ana listesine kaydedilir. Bunun ardından, ham görüntü yığınlarındaki hücre yanıtlarını ölçmek için özel yazılmış makro ve Image J'deki multi mesure eklentisi ile ROI ana listesi kullanılır. Son olarak, yanıt eğrileri ve ısı haritası matlab'da çizdirilir.Burada, dört farklı fareden toplanan idrar örneklerinin kullanıldığı VNO görüntüleme deneyine bir örnek gösterilmiştir. Yaklaşık 80 hücre, idrar stimülasyonlarından en az birine yanıt vermiş olup, bu hücrelerin yanıt delta F/F değerleri ısı haritasında grafiğe dökülmüştür. Burada; hücre bir, iki ve üçün idrar stimülasyonları ile aktivasyonun zaman seyrini gösteren yanıt izleri yer almaktadır; hücre bir, her iki dişi idrar örneğine yanıt verirken erkek örneklerine yanıt vermemektedir.İkinci hücre ise zıt aktivasyon modelleri sergilemekte ve her iki erkek örneğine de yanıt vermektedir. Sadece üçüncü hücre, hem bireysel erkek hem de dişi örnekler tarafından aktive edilir. İşlem başlatıldıktan sonra, dilim 30 dakika içinde hazırlanabilir ve uygun şekilde gerçekleştirilirse piyano nöronları altı ila sekiz saat boyunca canlı tutulabilir.Bu yöntemi uygularken, doku kültürü kalitesinde reaktifler kullanmaya ve doku hazırlıklarıyla doku sabitleme reaktiflerinin temas etmesini önlemeye dikkat etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde G Camp ekspresyonu kullanılarak Vienna nöronlarındaki termal yanıtların görüntülenmesi için canlı doku parçalarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri...

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Protokol videosu, farelerde vomeronazal organın (VNO) duyusal nöronlarından elektrofizyolojik kayıt için bir tam hücre yama kelepçesi oluşturmayı açıklar. Floresan olarak işaretlenmiş duyusal nöronlara sahip bir koronal VNO dilimi, bir kayıt kurulumuna yerleştirilir. Etiketli bir nöron, kimyasal uyaranlara yanıt olarak elektrofizyolojik kayıt için tüm hücre konfigürasyonunda bir kayıt pipeti ile yamalanır.

Vomeronazal Duyusal Nöronlardan Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturulması

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin vomeronazal organ (VNO) nöronlarında feromon yanıtlarını görüntülemek için canlı doku dilimleri hazırlama yöntemini. G-CaMP2 ifadeli transgenik fareler kullanılarak sinirbilim araştırmalarında kimyasal iletişim mekanizmaları incelenir.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Daha fazla video keşfet