Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Bu prosedürün genel amacı, 100 nanometre uzunluğundaki kısa DNA moleküllerini, sabit ve iyi kalibre edilmiş optik kuvvetlerle manipüle etmektir. Bu işlem, DNA'nın bir ucunun bir lamel camına (cover slip), diğer ucunun ise bir polistiren mikroküreye bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, optik cımbızlar hizalanır ve kalibre edilir.

Ardından, mikroküreye etki eden gradyan kuvvetleri ve saçılma kuvvetlerinin kombinasyonu ile DNA yüzeyden uzağa doğru gerilir. Son olarak, boncuk potansiyelin doğrusal bölgesinde hapsedilerek DNA uzatılır. Bu protokol, DNA'nın mekanik özelliklerini ve DNA-protein bağlanma kinetiğini incelemek için kullanılmıştır ve ayrıca kısa DNA yapılarının elastikiyeti üzerinde sınır koşullarının öneminin aydınlatılmasında faydalı olmuştur.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sabit kuvvetli optik cımbızların hizalanması ve kalibrasyonunun zor ve karmaşık olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Optik cımbızlar, birbirine dik polarize edilmiş iki ışına ayrılan 1064 nanometrelik bir lazerden gelen ışını içerir. Bunlardan biri biyomolekülü manipüle etmek için, diğeri ise kalibrasyon amacıyla kullanılır.

Manipülasyon ışınının şiddeti, bir AO optik deflektör veya bir OD ile kontrol edilir. Ardından ışınlar, başka bir polarize ışın ayırıcı ile yeniden birleştirilir. Işınlar, bir plan APO 60 x 1.4 yağ daldırma mikroskop objektifi ile numune hücresi üzerine sıkıca odaklanır. Bu cımbız düzeneği, halojen bir lambadan gelen ve bir kondansatör vasıtasıyla numune haznesine odaklanan aydınlatmayı sağlayan, laboratuvar yapımı bir parlak alan mikroskobu ile birleştirilmiştir.

Aydınlık alan görüntüsü, dikroik bir ayna ile lazer ışığından ayrılır ve ardından iki CCD kameraya yansıtılır. CCD'lerden biri, veri toplamanın temel yolu olarak görev yapar ve hassas örnekleme hızları elde etmek için yazılımsal olarak tetiklenir. Diğer CCD ise, konumu mikroskoptaki kaymaları telafi etmek için bir geri besleme kontrol sistemi olarak hizmet eden, sabitlenmiş tek bir referans mikrokürenin görüntülenmesi için kullanılır.

Numune, bir XY tablası ile objektife göre kaba olarak konumlandırılır ve ardından gömülü üç boyutlu bir piso tablası ile hassas bir şekilde konumlandırılabilir. Boncuğun boyutunu kalibre etmek için ileri saçılan ve iletilen lazer ışığı, parlak alan kondanseri tarafından toplanır ve bir fotodedektöre odaklanır; bir numune odasını fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş 800 nanometre çaplı polistiren mikrokürelerin dağılmış bir çözeltisi ile doldurun. 10 ila 15 dakika bekletin ve ardından tamponla hafifçe yıkayın.

Fazla mikroküreleri uzaklaştırmak için, lamel camına rastgele yapışmış bir mikroküre bulun ve örnek haznesinin yüksekliğini, mikroküre odak noktasının yaklaşık bir mikrometre altına gelene kadar ayarlayın. LabVIEW kullanarak görüntünün görünür boyutunu ölçmek için defokuslanmış bir görüntü oluşturmak amacıyla, öncelikle geometrik desen eşleme fonksiyonunu kullanarak mikrokürenin merkezini bulun. Ardından, 360 derece üzerinden ortalama alarak mikrokürenin radyal yoğunluk profilini oluşturun.

Her bir enine kesitin merkezi çevresinde, parlak alan görüntülerinin her birindeki beyaz halkaya karşılık gelen radyal profile kuadratik bir fonksiyon uydurulur. Bir parlaklık piki bulmak için, bu pik ile merkez arasındaki mesafe, boncuğun görünür boyutunun bir ölçüsü olarak kullanılabilir; kalibre edilmiş piezo sahne kullanılarak mikrokürenin eksenel konumu kademeli olarak artırılır ve CCD kamera ile her eksenel konumda bir görüntü alınır. Mikrokürenin görünür boyutunu eksenel konumuyla ilişkilendirmek için görüntü analizi her bir ardışık görüntü için tekrarlanır.

Bu yöntemle elde edilen aksiyel çözünürlük yaklaşık 1.4 nanometredir; manipülasyon ışınının optik potansiyelini haritalandırmak için, manipülasyon ışını kapalıyken manipülasyon ışını ile kalibrasyon ışınını koline ederek başlayın. Serbest bir mikroküreyi, kalibrasyon ışınının çok daha sert olan tuzağı içerisinde hapsedin. Şimdi manipülasyon ışınını açın.

Kalibrasyon ışınından çok daha zayıf olduğu için, mikrokürenin eksenel konumu hafifçe değişecektir. Eksenel konumda meydana gelen bu değişim, daha önce açıklandığı üzere, odak dışı parlak alan görüntülerinden ölçülebilir. Eksenel odağı kaydırın ve yer değiştirme delta X değerini, kalibrasyon ışını odağının eksenel konumuna karşı grafiğe dökerek işlemi tekrarlayın.

Mikrosferin en büyük yer değiştirmesine karşılık gelen eksenel konum, optik tuzağın doğrusal bölgesinin merkezini belirler. Bir DNA örneğini germek için, yüzeye bağlı DNA moleküllerini içeren hazneyi yerleştirin ve parlak alan görüntüsünü izlerken, teleskopu ayarlayarak manipülasyon ışınının odağını gerilmemiş mikrosferlerin biraz üzerine getirin; ardından mikrosferlerden biri yakalanana kadar sahnenin konumunu ayarlayın. Mikrosferi optik tuzağın XY düzleminin merkezine kabaca konumlandırın, LabVIEW'de bir dizi kare dalga oluşturun ve lazer ışınını tekrarlayan şekilde açıp kapatmak için bunları A OD'ye gönderin.

Tuzak tekrar tekrar açılıp kapatılırken mikroküreyi izleyin. Ve X ve y yönlerinde mikrokürenin konumunu iteratif olarak ayarlarken, lazerin mikrokürenin hareketine herhangi bir tercih edilen yön verip vermediğini not edin. Piezo sahne kontrol edilerek, mikrokürenin rastgele hareketi, lazer açıkken belirgin şekilde kısıtlansa da X-y düzleminde izotropik hale gelmelidir.

Ardından, boncuğu Z yönünde hizalayın. Lazer ışınını yeniden kesikli olarak açıp kapatın. Bu sırada mikro kürelerin eksenel yer değiştirmesini gerçek zamanlı olarak ölçün.

Sahneyi, DNA rampasını germek için Z yer değiştirmenin en yüksek olduğu nokta olan doğrusal bölgeye ortalayın; her adımda 0,025 voltluk artışlarla sıfır volttan 0,5 volta kadar A OD'ye bir voltaj sinyali göndererek lazer yoğunluğunu ayarlayın. Saniyede 100 kare olacak şekilde 400 kare kaydedin ve eksenel yer değiştirmeyi elde etmek için bunları ortalayın. Son olarak, kuvvet-uzama eğrilerini çizin ve bunları modifiye edilmiş solucan benzeri zincir (worm-like chain) modeline uydurun.

Burada, kısa DNA dizileri için 1, 298 baz çifti ve 247 baz çifti uzunluğundaki 2D NA dizilerine ait kuvvet-uzama eğrileri gösterilmektedir. Geleneksel solucan benzeri zincir (WLC) modeli, kuvvet-uzama ilişkisini tam olarak açıklamamaktadır; çünkü bu uzunluk ölçeklerinde, sonlu boyut etkileri ve sınır kısıtlamalarından kaynaklanan sıfır kuvvet uzamasının dikkate alınması gerekir. Bu nedenle, kuvvet-uzama ölçümlerinin, ek materyallerde daha ayrıntılı olarak açıklanan etkili kalıcılık uzunluğu ve sıfır kuvvet uzamasına sahip modifiye bir WLC modeli kullanılarak uydurulması gerekmektedir.

D-S-D-N-A'nın büyük kontur uzunlukları için, etkili kalıcılık uzunluğu basitçe yaklaşık 50 nanometre olan nominal kalıcılık uzunluğudur ve sıfır kuvvet uzaması modifiye edilmiş WLC sığdırmalarında ihmal edilebilir. Geliştirilmesinin ardından, etkili kalıcılık uzunlukları 1.298 baz çifti DNA için 35 nanometre ve 247 baz çifti DNA için 25 nanometredir. Bu yöntem, düzenleyici protein aracılı DNA döngülerinin oluşum ve yıkım kinetiği üzerine yapılan bir çalışma da dahil olmak üzere, DNA ve DNA-protein kompleksleri üzerinde bir dizi nanomekanik ölçümün önünü açmıştır.