Name: Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, sabit kuvvet eksenel optik cımbız kullanarak ~100 nm kısa DNA moleküllerini germe ve mekanik özelliklerini inceleme yöntemini. Bu teknik, DNA-protein etkileşimleri ve biyofizik araştırmaları için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz eksenel optik cımbız ile yardım ve bu el yazması onun uzanan bazı verilerin katkıda Dr Yih-Fan Chen ederim. Bu çalışma NSF hibe FİZ-0957293 ve ODAK hibe FİZ-0114336 sponsor oldu.

1. Cımbızlar Kurulumu <ol><li> Bir 1064 nm lazer ışını iki ortogonal polarize ışınları ayrılmıştır. Bir başka (bakınız Şek. 2) kalibrasyon amacıyla kullanılan en biyomolekül işlemek için kullanılır. </li><li> Her bir kiriş pozisyon ve odak bağımsız olarak, sırasıyla, ışın yönlendirme aynası ve optik teleskoplar ile kontrol edilir manipülasyon ışın yoğunluğu, bir akusto-optik deflektör (ATH) tarafından kontrol edilir. </li><li> Kirişler sonra başka bir polarize ışın ayırıcı ile recombined ve biraz mikroskop objektif arkasına diyafram doldurmayın için teleskop optik bir final seti daha da klimalıdır. Manipülasyon kiriş için biraz daha küçük bir faktörü, yaklaşık% 20, lineer potansiyel büyük bir çalışılabilir bölgeye çeviren bir sığ odak verirken kalibrasyon ışını için% 50 fazla doldurmayın, sıkı bir optik tuzağına götürür. Kirişler sıkıca PlanApo 60x/1.4 yağ immersiyon obj tarafından duruldunumune hücresi üzerine uygulamada etkili. </li><li> Bu cımbız kurulum bir kondansatör tarafından numune odacığı üzerine odaklanmış bir Halojen lamba aydınlatma sağlar bir ev inşa aydınlık mikroskop ile birleştirilmiştir. Aydınlık görüntü bir dikroik ayna tarafından lazer ışık ayrılır ve daha sonra iki CCD kamera üzerinde görüntülenmektedir. Diğer CCD görüntü olan pozisyon mikroskop sürüklenme telafi etmek için bir geri besleme kontrol sistemi olarak hizmet tek bir sıkışmış referans mikroküre için kullanılırken, biri CCD veri edinme bizim birincil aracı olarak görür ve, hassas örnekleme oranları elde etmek için tetiklenir yazılımdır. </li><li> Örnek kabaca bir XY aşama ile objektif ile ilgili olarak konumlandırılır ve daha sonra tam gömülü bir üç boyutlu bir piezo-katı ile yerleştirilebilir. </li><li> Öne saçılan ve yayılan lazer ışığı aydınlık kondenser tarafından toplanan ve bir fotodetektör üzerine odaklanmıştır. Elde edilen sinyal, 100 kHz bir yumuşatma filtre içinden süzülmüş amplifiye edilir ve birBir DAQ kartı kullanarak 200 kHz'de cquired. </li></ol> 2. Eksenel Pozisyon Boncuk Görünür Büyüklüğü Kalibre <ol><li> Bir fosfat içinde seyreltilmiş 800 nm çaplı polistren mikroküre çözümü Dispers bir örnek odası 9 yükleyin tamponlu salin. 10-15 dakika bekletin ve sonra hafifçe aşırı mikroküreler kaldırmak için tamponu ile yıkayın edelim. </li><li> Rastgele coverglass yapışmış bir mikroküre bulup mikroküre bir defocused görüntü oluşturmak için odak altında yaklaşık 1 mikron kadar numune odasının yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Resmin görünen boyutunu ölçmek için, ilk LabView eşleşen fonksiyonu geometrik desen kullanarak mikroküre merkezi bulabilirsiniz. </li><li> Daha sonra, her bir enine kesit merkezine yaklaşık 360 ° ortalaması alınarak mikrosfer, radyal bir yoğunluk profili oluşturmak. Aydınlık görüntülerin her bir beyaz halka karşılık radyal profil, bulmak için ikinci dereceden bir fonksiyonu takılabilirparlaklık pik. Bu tepe noktası ile merkez arasındaki mesafe boncuk mevcut boyutlarını bir ölçü olarak kullanılabilir. </li><li> Kalibre piezostage kullanarak, yavaş yavaş mikroküre arasında eksenel pozisyonunu artırmak ve CCD kamera ile her eksenel konumda bir görüntü kazanır. </li><li> (Bkz. Şek. 3) eksenel konumu ile mikroküre belirgin boyutu ilişkilendirmek için birbirini izleyen her görüntü için görüntü analizi tekrarlayın. Yöntemi ile elde edilen eksenel çözünürlüğü yaklaşık 1,4 mil 7'dir. </li></ol> 3. Manipülasyon Işın Optik Potansiyeli <ol><li> Collinearly manipülasyon ışını ve kalibrasyon ışın hizalayarak başlayın. Manipülasyon ışın çok zayıf olmalı iken kalibrasyon ışın hedefi arka diyafram yaklaşık 50 mW olmalıdır, 10 mW söylüyorlar. </li><li> Manipülasyon ışını kapalı olan, kalibrasyon ışının çok sert tuzak içinde bir serbest mikroküre sınırlandırmak. </li><li> Şimdi, mani açınpulation kiriş. Bu sayede, manipülasyon ışın demeti kalibrasyon çok daha zayıf olduğu için, bir mikrosfer eksenel pozisyonunu biraz bozulursa olacaktır. Eksenel konumda çıkan değişiklik olarak daha önce tarif odak dışı aydınlık alan görüntüleri ölçülebilir. </li><li> Manipülasyon ışını kapatın ve hala kalibrasyon kiriş içinde sıkışıp mikroküre ile teleskopik lens ayarlayarak kalibrasyon kirişin eksenel odak kayması. , Manipülasyon kiriş açın mikroküre ve tekrarın sonraki deplasman ölçer. </li><li> Değiştirmeler ΔX kalibrasyon ışının odak eksenel pozisyonunu karşı çizilebilir. Mikrosfer en büyük deplasman karşılık gelen eksenel pozisyonunu optik tuzak doğrusal bölgede (bakınız Şek. 4) merkezi belirler. </li><li> Eksenel konumunun bir fonksiyonu olarak manipülasyon kiriş optik güç elde son adım sertliğinin dikkatli bir şekilde ölçülmesi gereklidirkalibrasyon kiriş. Bunu elde etmek için, manipülasyon ışını kapalıyken teleskopik lens ayarlayarak yüzeyinden bir mikrometre civarına kalibrasyon ışını tarafından tuzağa mikroküre, hareket. </li><li> Bir fotodetektör ile iletilen ışığın yoğunluğunu ölçerek mikrosfer bir termal eksenel hareket kaydedin. </li><li> Sinyalin otokorelasyon, dalgalanmalar zaman sabitini vermek için tek bir üstel bozulma fonksiyonu takılabilir. Τ z </li><li> Hidrodinamik sürtünme katsayısı ζ, mikrosfer bir yüzey 5,10, mikrosferler yakınlık için düzeltilebilir. Kalibrasyon tuzak sertliği sonra κ z = ζ / τ z (bkz. Yardımcı Malzeme A ve B) tarafından verilir. </li><li> Kalibrasyon tuzak sertliği bilmek tek bir kuvvet ƒ içine thi z = κ z ΔX Entegrasyon önce ölçülen eksenel deplasman dönüştürmek sağlars eğri manipülasyon kiriş eksenel optik potansiyeli (bakınız Şek. 4) konumsal bir eşleme verir. </li></ol> 4. Bir DNA Sample Stretching <ol><li> Odasının 9 içeren yüzey gergin DNA molekülleri (&lt;1 kbp) monte ve aydınlık görüntü dikkat ederek, teleskop ayarlayarak hafifçe gerilmemiş mikrosferler yukarıda manipülasyon kiriş odağı yerleştirin. Daha sonra mikro biri tutulur kadar aşamasının konumunu ayarlamak. </li><li> Kabaca optik tuzak XY düzlemi merkezinde mikrosfer yerleştirin. LabView kare dalgalar bir dizi oluşturun ve tekrarlayan lazer ışını ve kapatmak için AOD gönderebilirsiniz. Dikkatlice lazer ve numune odasının ısınmasını önlemek için üzerindeki hal süresini yoğunluğunu kontrol. Genellikle, lazer güç (objektif arkasındaki diyafram ölçülen) 2 mW etrafında kullanımı ve 200 ms (açık) ve 500 ms (açık) ve bakliyat gönderebilirsiniz. Kare w genliğiave AOD gönderilen 0.5 civarında olmalıdır V. </li><li> Tuzak defalarca açılıp kapandığında olarak mikroküre İzle ve lazer mikroküre en hareketine herhangi bir tercihli yöne yönlendiren, unutmayın. Iteratif X ve Y yönünde hem mikroküre konumunu ayarlarken, piezostage kontrol ederek, mikroküre ve rasgele hareket lazer açıkken bile fark yoktur, XY düzleminde izotropik haline gelmelidir. </li><li> Sonra, Z doğrultusunda boncuk hizalanır. , Bu kez, aynı anda gerçek zamanlı mikroküreler eksenel deplasman ölçüm yaparken tekrar lazer ışını darbeli ve kapatır. Lineer bölge içinde merkezi aşama, ki Z deplasman yüksek olduğu noktadır. </li><li> Z yönünde dikkatli bir hizalama sonra, tuzak hala XY düzleminde merkezli olup olmadığını kontrol etmek şarttır. XY hizalama değiştirilmişse mikroküre üç boyunca düzgün ortalanmış kadar, XY ve Z hizalama hem tekrarlanmalıdıreksenleri. </li><li> DNA germe için, onları eksenel deplasman elde etmek için kayıt, 0.025 adımlarla V. Her adımda 0 V 0.5 V, AOD 400 100 fps kare ve ortalama bir voltaj sinyali göndererek lazer yoğunluğu rampa. </li><li> Kuvvet-uzama eğrileri şimdi (B Yardımcı Malzemeler bakınız) çizilen ve modifiye WLC modeli 11 için uygun olabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bir 1298 bp ve 247 bp dizisi, biz tekrarlanabilir germek mümkün olmuştur kısa dizisi olmanın ikincisi: Biz iki DNA dizileri için yürürlüğe uzatma eğrileri sunuyoruz. Bu uzunluk ölçeklerinde tek sonlu boyutlu efektler ve sınır kısıtlamaları kaynaklanan sıfır kuvvete uzantısı için hesap gerekir, çünkü DNA kısa menziller için, konvansiyonel Worm-beğendiniz Zincir (WLC) modeli tam kuvvet uzantısı ilişkisini açıklamaz. Kuvvet-uzama ölçümleri, bu nedenle, etkin bir e sahip bir modifiye WLC modeli kullanılarak uygun olması gerekirsebat uzunluğu ve ek materyalleri de açıklanan uyum parametreleri, bir sıfır kuvvete uzantısı ettik. DsDNA büyük kontur uzunlukları için, etkili bir kalıcılık süresini sadece nominal sebat uzunluğu (~ 50 nm) ve sıfır kuvvete uzantısı ihmal edilebilir. Bununla birlikte, çevre uzunluğu daha kısa hale olarak, etkili kalıcılık uzunluğu da 50 nm ve DNA altına düştüğünde hatta sıfır kuvvet altında, belirgin bir uzantı göstermektedir. Kuvvet-uzama eğrisi verileri ve ilgili uyan Şekil 'de gösterilmiştir. İki dizileri için 5. Modifiye WLC uyuyor, biz etkili kalıcılık uzunlukları 1298 bp DNA ve 247 bp DNA için 25 nm 35 nm olarak belirlenmiştir. Amaçlıdır, her sıra için güç uzatma eğrileri tek önlemleri sunuyoruz. Uygulamada, bir ölçüm birden çok kez tekrarlayın ve standart hataları ile birlikte ortalama sonuçlar elde ederim. Bu tha da belirtmek gerekirt her bir eğri elde etmek sonra mikrosfer önceden protokolde tarif edildiği gibi başka bir mikrosfer yeniden hizalanmalıdır, lineer bölge içinde sıkışmış ve uygun bir şekilde yerleştirilmiş olmasını sağlamak için zorunludur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Eksenel Optik cımbız Şekil 1. İlke. (Sol) Odak yakınındaki Konvansiyonel optik cımbız tuzak. Boncuk sonra gerilim uygulamak için lamel yanal hareket ettirilir. (Sağ) eksenel optik cımbız, bir mikroküre optik potansiyel doğrusal bölgede, odak uzak tutulur. Bu düzenlemede, polimer uzantılar için bir dizi sabit gerilim altında tutulur. Ayrıca, lazer yoğunluğu artan eksenel yönde mikrosfer hareket eder. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Şematik GösterimiEksenel Optik cımbız Lazer ışığı (1064nm Nd: Yvo 4). Polarize ışın ayırıcı (PBS) üzerinden geçerek iki kiriş ayrılmıştır. Manipülasyon ışın, bir acousto-optik saptırıcı (AOD) geçer ve kalibrasyon kiriş teleskopik lens kullanan bağımsız olarak ayarlanabilir. İki ışın, sonra yüksek bir NA objektif ile bir başka PBS ile yeniden birleştirilmesi, ve numune üzerine odaklanmıştır. Aynı zamanda, aydınlık alan aydınlatma mikrosfer izlemek için kullanılabilir, örnek geçen süzülmüş kızılötesi (IR) ve daha sonra bir geri besleme kontrol sisteminin bir parçası olarak diğer işlemler sırasında ölçüm yapar ve bunlardan biri iki CCD kamera tarafından görüntülenmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> 3 Eksenel Pozisyon Kalibrasyon Şekil. Eksenel pozisyonunu kalibre etmek için, biz sahne eksenel pozisyonları değişen odasına lamel yapışmış bir boncuk defocused görüntüler elde. Mikro boyutuphere merkezinde ve mikroküre bir görüntü etrafında oluşan parlak halka yaklaşık doruk şiddeti pozisyonu arasındaki mesafe tarafından verilir. Içerlek boncuk boyutunu verir radyal yoğunluğu dağılımını göstermektedir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Optik Potansiyeli ardında 4. İlke Şekil. Manipülasyon ışının optik kuvveti eşleştirmek için, daha güçlü bir kalibrasyon demeti içinde sıkışmış bir mikroküre üzerine uyardığını eksenel deplasman ölçülür. Bu yer değiştirme, bir maksimum olduğu doğrusal bölgenin merkezinde yer almaktadır. Eksenel Pozisyon eğrisi vs Optik Kuvvetleri optik potansiyel bulmak için entegre edilebilir. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Kuvvet Uzatma Eğrisi. Veriler rasgele 1298 bp ve 247 bp (inset) segmen için gösterilirdsDNA t eksenel optik cımbız tarafından gerilir. Veri noktaları denkleminin modifiye WLC modeli için uygun bulundular. 3 (katı çizgiler) ve 1298bp ve 247bp sırasıyla 34 nm ve 25 nm etkili sebat uzunlukları vermiştir.

<ol><li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li>
<li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loops+in+DNA%3A+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Phys.+J.+E.+Soft.+Matter%22%5BJournal%5D)">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li>
<li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA%3A+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li>
<li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li>
<li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li>
<li>Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Meiners+Lab%22">Meiners Lab</a>. , University of Michigan. (2011).</li>
<li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule%2C+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li>
<li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Konvansiyonel optik cımbız bir refraktil nesne üzerinde sabit bir kuvvet uygulamak için analog ya da bilgisayar kontrollü geribildirim güvenmek. Bu aktif geri besleme sistemleri, bir protein bağlama gelen DNA ya da bir filaman boyunca bir moleküler motorun hızlı bir atlama için, örneğin, zorluk numune bir uzantısı olarak ani değişiklikler meydana koşullar altında icra var. Sabit kuvvetlerinin uygulanması için çeşitli pasif yöntemler son zamanlarda geliştirilmiştir. Basepair çözünürlükte RNA polimeraz atlama çözmek için ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Nd: YVO4 lazer </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106c </td><td></td></tr><tr><td> Acousto-optik saptırıcı </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç </td><td> Olimpos </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1.4 </td></tr><tr><td> Piezo sahne </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> XYZ sahne </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Fotodetektör </td><td> Elektro-Optik Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polistiren Boncuk </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin kaplı </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin </td><td> Roche </td> 11333089001 <td> Koyun Gönderen </td></tr><tr><td> Astarlar </td><td> MWG operon </td><td> Özel Oligolar </td><td> Bir astar: biotin Diğer: digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR </td><td> New England Biolabs </td><td> Taq polimeraz, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diğer kimyasallar için tampon </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Yardımcı Malzemeler A. Hidrodinamik Sürtünme Katsayısı Bir yüzeyine yakın bir mikrosfer bir hidrodinamik sürtünme katsayısını belirlemek için bir genişleme aşağıdaki 5,10 kullanılabilir: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Denklem 1"> burada aşağıdaki kısaltma solarak ortaya konmuştur: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Denklem 2"> Sürtünme katsayısı yüzeyi üzerinde bir mesafede yer alır η mikrosfer merkezine sahip, sıvı viskozite η ve mikroküre çapının bakımından tanımlanmıştır. Yaklaşık on şartları genişletilmiş zaman toplamı gayet iyi yakınsar. Sertlik Kalibrasyonu Eksenel Pozisyon B. Etkisi Sertlik kapanı ayarlama yüzeyinden artan uzaklık ile artar kalibrasyon doğruluğu, ve tuzak deneysel olarak kullanılan gerçek bir eksenel pozisyon arasında bir değiş tokuş içerir. Genel olarak, tuzak gerçek deneysel koşul daha yüksek yüzey gelen 800-1000 nm etrafında kalibre edilmiştir. C. Worm-beğendiniz Zincir (WLC) Model Modifiye Kuvvet-uzama eğrileri modifiye WLC m için uygun olabilirodel aşağıda gösterildiği gibi sıfır optik kuvvetinde hacmi dışlama etkileri hesapları: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Denklem 3"> F opt optik kuvvet nerede, x o sıfır kuvvete uzantısı için uygun bir parametre olduğunu, x opt kuvvet altında uzantısı, l DNA kontur uzunluğu, ve l * p "etkili ikinci bir uygun parametre "sebat uzunluğu. F WLC zamanki WLC modeli 11 ile verilir <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Denklem 4"> burada ε bağıl DNA uzantısıdır.

sabit kuvvet eksenel optik cımbız ile dna kısa diziler stretching

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Az kilobaz daha kontur uzunluklarda DNA germe için Tek molekül tekniklerin deneysel güçlüklerle doludur. Bununla birlikte, bu gibi histon ve DNA bağlayıcı protein, 1,2-aracılı döngü olarak çok ilginç biyolojik etkinlikleri, bu uzunluk ölçek üzerinde meydana gelir. Son yıllarda, DNA mekanik özelliklerini kompakt nükleozom ve kromatin ipliklerinin 3,4 içine DNA paketleme gibi temel hücresel süreçler önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, DNA&#39;nın kısa menziller mekanik özelliklerini anlamak için o önemlidir. Bu yazıda, biz birkaç yüz basepairs gibi kısa kontur uzunluktaki DNA&#39;nın mekanik davranışlarını incelemek için geliştirmiş olduğumuz tek-molekül optik tweezing tekniği için pratik bir kılavuz sağlamak. DNA&#39;nın kısa segmentlerinde gerilmelerde büyük engel, geleneksel optik cımbız genellikle directio kuvvet uygulamak için tasarlanmış olann, aşama 5,6 yanal, (bakınız Şek. 1). Bu geometri olarak, boncuk ve lamel arasındaki açı olan DNA gergin olduğu, mikron uzunlukta DNA için çok dik hale gelir. Eksenel pozisyonunu artık uzatma yakın lamel mikroküre sürükler yana, sterik etkiler geliştirilmiştir, bir meydan okuma olabilir, sorumluydu, ve olmalıdır. Buna ek olarak, mikro asimetri bir sonucu olarak, yan uzantılar oluşturur uzantı boyunca reaktif güç yönü değişirse beri optik tuzak içinde nedeniyle mikrosfer dönme momenti, değişen. Germe Mikronaltı DNA için alternatif yöntemlerin kendilerine özgü engellerin karşı çalıştırın. Örneğin, bir çift-kiriş optik tuzak hangi iki tuzak arasında ve mikroküreler arasında ışık saçılması ikinci nokta parazit etkileri önemli bir sorun teşkil başlar, bir dalga boyu yaklaşık DNA germe ile sınırlıdır. Tuzakları biri DeğiştirilmesiBir mikropipet ile büyük olasılıkla benzer sorunlar muzdarip olacaktır. Biri doğrudan DNA germek için eksenel potansiyel kullanabilirsiniz iken, aktif bir geribildirim düzeni sabit bir kuvvet ve bu bant genişliği özellikle düşük güçlerine, oldukça sınırlı olacaktır uygulamak için gerekli olacaktır. Biz doğrudan sabit bir kuvvet eksenel optik cımbız 7,8 kullanarak lamel uzak DNA çekerek bu temel sorunları aşmak. Bu, optik gücü sabit güç olan lazer gücü ayarlamak suretiyle ayarlanabilir olan optik potansiyel bir doğrusal bölgesinde, boncuk yakalama ile elde edilir. Doğrusal bölgede bindirme ayrıca eksenel yönde yaklaşık 350 nm boyunca uzanan DNA üzerinde bir bütün optik güç kelepçe olarak hizmet vermektedir. Lamel yapışmış bir referans mikroküre, aynı konumda ve odak kalır, böylece Biz aynı anda ince sahne konumunu ayarlayarak termal ve mekanik sürüklenme telafi birneredeyse sınırsız gözlem dönemi için llowing.

Daha kısa DNA moleküllerinin mekanik özelliklerini incelemek için sabit bir kuvvet eksensel optik cımbız kullanımını göstermektedir. Eksenel DNA germe, biz bize ~ 100 nm gibi kısa DNA molekülleri çalışmaya izin sterik engel ve konvansiyonel yanal manipülasyon doğan eserler minimize.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Kontur uzunlukları bir kilobazdan az olan DNA'ların gerilmesi için kullanılan tek molekül teknikleri, birçok deneysel zorluk içermektedir. Bununla birlikte, birçok...

Bu prosedürün genel amacı, 100 nanometre uzunluğundaki kısa DNA moleküllerini, sabit ve iyi kalibre edilmiş optik kuvvetlerle manipüle etmektir. Bu işlem, DNA'nın bir ucunun bir örtü camına, diğer ucunun ise bir polistiren mikroküreye bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, optik cımbızlar hizalanır ve kalibre edilir.Ardından, mikroküreye etki eden gradyan kuvvetleri ve saçılma kuvvetlerinin kombinasyonu ile DNA yüzeyden uzaklaştırılır. Son olarak, boncuk potansiyelin lineer bölgesinde hapsedilerek DNA genişletilir. Bu protokol, DNA'nın mekanik özelliklerini ve DNA-protein bağlanma kinetiğini incelemek için kullanılmış ve ayrıca kısa DNA konstrüktlerinin elastikliği üzerinde sınır koşullarının öneminin aydınlatılmasında faydalı olmuştur.Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sabit kuvvetli optik cımbızların hizalanması ve kalibrasyonunun zor ve karmaşık olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Optik cımbızlar, iki ortogonal polarize ışına ayrılan 1064 nanometre lazerden gelen bir ışını içerir. Bunlardan biri biyomolekülü manipüle etmek için, diğeri ise kalibrasyon amaçları için kullanılır.Manipülasyon ışınının yoğunluğu, bir AO optik deflektör veya bir OD ile kontrol edilir. Işınlar daha sonra başka bir polarize ışın ayırıcı ile yeniden birleştirilir. Işınlar, bir plan APO 60 x 1.4 yağ daldırma mikroskop objektifi ile örnek hücresi üzerine sıkıca odaklanır. Bu cımbız düzeneği, bir kondansatör aracılığıyla örnek haznesine odaklanan halojen lambadan aydınlatma sağlayan, laboratuvar bünyesinde yapılmış bir parlak alan mikroskobu ile birleştirilmiştir.Aydınlık alan görüntüsü, dikroik bir ayna aracılığıyla lazer ışığından ayrılır ve ardından iki CCD kameraya aktarılarak görüntülenir. CCD'lerden biri, veri toplamanın temel yöntemi olarak işlev görür ve hassas örnekleme hızları sağlamak için yazılım tarafından tetiklenir. Diğer CCD ise, konumu mikroskoptaki kaymaları telafi etmek için bir geri besleme kontrol sistemi olarak kullanılan, sabitlenmiş tek bir referans mikrokürenin görüntülenmesi için kullanılır.Numune, bir XY tablası ile objektife göre kaba olarak konumlandırılır ve ardından gömülü üç boyutlu bir piezo tablası ile hassas bir şekilde konumlandırılabilir. İleri saçılan ve iletilen lazer ışığı, parlak alan kondansatörü tarafından toplanır ve boncuğun boyutunu kalibre etmek için bir foto dedektöre odaklanır; fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş, 800 nanometre çapında polistiren mikrokürelerin dağılmış bir çözeltisi ile bir numune haznesi doldurun. 10 ila 15 dakika bekletin ve ardından tamponla hafifçe yıkayın.Fazla mikroküreleri uzaklaştırmak için, lamel camına rastgele yapışmış bir mikroküre belirleyin ve mikroküre odak noktasının yaklaşık bir mikrometre altına gelene kadar örnek haznesinin yüksekliğini ayarlayın. LabVIEW kullanarak görüntünün görünür boyutunu ölçmek amacıyla defokuslanmış bir görüntü oluşturmak için öncelikle geometrik desen eşleme işlevini kullanarak mikrokürenin merkezini bulun. Ardından, 360 derece üzerinden ortalama alarak mikrokürenin radyal yoğunluk profilini oluşturun.Her bir enine kesitin merkezi çevresinde, parlak alan görüntülerinin her birindeki beyaz halkaya karşılık gelen radyal profile kuadratik bir fonksiyon uydurulur. Parlaklık zirvesini bulmak için, bu zirve ile merkez arasındaki mesafe, boncuğun görünür boyutunun bir ölçüsü olarak kullanılabilir; kalibre edilmiş piso tablasını kullanarak mikrokürenin eksenel konumunu kademeli olarak artırın ve her eksenel konumda CCD kamera ile bir görüntü alın. Mikrokürenin görünür boyutunu eksenel konumuyla ilişkilendirmek için görüntü analizini her bir ardışık görüntü için tekrarlayın.Bu yöntemle elde edilen eksenel çözünürlük, manipülasyon ışınının optik potansiyelini haritalamak için yaklaşık 1,4 nanometredir; manipülasyon ışını kapalıyken, manipülasyon ışını ile kalibrasyon ışınını koline ederek hizalamayla başlayın. Serbest bir mikro küreyi, kalibrasyon ışınının çok daha sert olan tuzağına hapsedin. Şimdi manipülasyon ışınını açın.Kalibrasyon ışınından çok daha zayıf olduğu için, mikrokürenin eksensel konumu hafifçe değişecektir. Eksenel konumda meydana gelen bu değişim, daha önce açıklandığı üzere defokuslanmış parlak alan görüntülerinden ölçülebilir. Eksenel odağı kaydırın ve tekrarlayın; yer değiştirme delta X'i, kalibrasyon ışınının odağının eksensel konumuna karşı grafiğe dökün.Mikrosferin en büyük yer değiştirmesine karşılık gelen eksenel konum, optik tuzağın doğrusal bölgesinin merkezini belirler. Bir DNA örneğini germek için, yüzeye bağlı DNA molekülleri içeren hazneyi yerleştirin ve parlak alan görüntüsünü gözlemlerken, teleskobu ayarlayarak manipülasyon demetinin odağını gerilmemiş mikrosferlerin biraz üzerine getirin, ardından mikrosferlerden biri yakalanana kadar sahnenin konumunu ayarlayın. Mikrosferi optik tuzağın XY düzleminin merkezine yaklaşık olarak konumlandırın, LabVIEW'da bir dizi kare dalga oluşturun ve lazer demetini tekrarlayan şekilde açıp kapatmak için bunları A OD'ye gönderin.Tuzak tekrar tekrar açılıp kapatılırken mikro küreyi izleyin. Ve X ve y yönlerinde mikro küre konumunu iteratif olarak ayarlarken, lazerin mikro kürenin hareketine herhangi bir tercih edilen yön kazandırıp kazandırmadığını not edin. Piso tablası kontrol edilerek, lazer açıkken belirgin şekilde kısıtlansa da mikro kürenin rastgele hareketinin X-y düzleminde izotropik hale gelmesi sağlanmalıdır.Ardından, boncuğu Z yönünde hizalayın. Lazer ışınını tekrar kısa aralıklarla açıp kapatın; ancak bu kez mikro kürelerin eksenel yer değiştirmesini gerçek zamanlı olarak eş zamanlı ölçün.Sahneleri, DNA rampasını germek için Z yer değiştirmenin en fazla olduğu nokta olan doğrusal bölgeye ortalayın; A OD'ye sıfır volttan 0,5 volta kadar 0,025 voltluk adımlarla voltaj sinyali göndererek lazer yoğunluğunu ayarlayın. Saniyede 100 kare olacak şekilde 400 kare kaydedin ve eksenel yer değiştirmeyi elde etmek için bunları ortalayın. Son olarak, kuvvet-uzama eğrilerini çizin ve bunları modifiye edilmiş solucan benzeri zincir modeline uydurun.Burada, kısa DNA dizileri için 1, 298 baz çifti ve 247 baz çifti uzunluğundaki 2D NA dizilerine ait kuvvet-uzama eğrileri gösterilmektedir. Geleneksel solucan benzeri zincir veya WLC modeli, kuvvet-uzama ilişkisini tam olarak açıklamamaktadır; çünkü bu uzunluk ölçeklerinde, sonlu boyut etkileri ve sınır kısıtlamalarından kaynaklanan sıfır kuvvet uzaması hesaba katılmalıdır. Bu nedenle, kuvvet-uzama ölçümlerinin, ek materyallerde daha ayrıntılı olarak açıklanan etkili bir kalıcılık uzunluğu ve sıfır kuvvet uzamasının uyum parametreleri olduğu modifiye bir WLC modeli kullanılarak uydurulması gerekmektedir.D-S-D-N-A'nın büyük kontur uzunlukları için etkili kalıcılık uzunluğu, basitçe yaklaşık 50 nanometre olan nominal kalıcılık uzunluğudur ve sıfır kuvvet uzaması modifiye edilmiş WLC uyarlamalarında ihmal edilebilir. Etkili kalıcılık uzunlukları, geliştirilmesinin ardından 298 baz çiftli DNA için 35 nanometre ve 247 baz çiftli DNA için 25 nanometredir. Bu yöntem, düzenleyici protein aracılı DNA döngülerinin oluşum ve yıkım kinetiğinin incelenmesi dahil olmak üzere, DNA ve DNA-protein kompleksleri üzerinde bir dizi nanomekanik ölçümün önünü açmıştır.

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Biz kısmen akson zarı yapışık bir optik-tuzak prob yapılan eş zamanlı kuvvet spektroskopisi ölçümü ile bir lazer disektör ile lezyonlanmıştır olan bir akson gerginlik serbest ölçtük. Geliştirilen Deneysel protokol, kültür alt tabakaya yapışma akson değerlendirir.

Lazer Bağlı Akson Lezyon sırasında Gerilim Film ölçümü Piconewton ve Milisaniye Çözünürlük de Yüzey için aksonal yapışma değerlendir

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Optik cımbız, tek tek molekülleri 5' ve 3' uçlarından gererek RNA katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Burada, cımbızlama için RNA moleküllerini sentezlemek, aletin kalibrasyonu ve tek molekülleri manipüle etmek için yöntemler için yaygın prosedürler açıklanmaktadır.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, telomerik DNA bağlayıcı proteinler (Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 [TRF1] ve TRF2) ile insan hücrelerinden ekstrakte edilen uzun telomerler arasındaki etkileşimleri incelemek için tek moleküllü manyetik cımbızların kullanılmasını göstermektedir. Telomerler ve telomerik tekrar bağlama faktörleri için hazırlık adımlarını, tek moleküllü deneylerin yürütülmesini ve veri toplama ve analiz yöntemlerini açıklar.

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Öğrenin, sabit kuvvet eksenel optik cımbız kullanarak ~100 nm kısa DNA moleküllerini germe ve mekanik özelliklerini inceleme yöntemini. Bu teknik, DNA-protein etkileşimleri ve biyofizik araştırmaları için güçlü bir araçtır.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Daha fazla video keşfet