İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Bu video makalesinde, insan yetişkin fibroblastları, retroviral vektörler kullanılarak pluripotent kök hücreler üretmek üzere yeniden programlanmıştır. İlk olarak, insan fibroblastları, transkripsiyon faktörlerini kodlayan retroviral vektörlerle dönüştürülür. T üç dört, SOX iki, KLF dört ve cmic.

Enfekte fibroblastlar, 14 ila 28 gün boyunca fare embriyonik besleyici hücreleri üzerinde kültürlenir. Elde edilen kültürler, yeniden programlanmış hücrelerin kolonilerini tanımlamak için TRA 180 1 antikoru ile boyanır. Pozitif koloniler daha sonra genişleme için MEF içeren plakalara aktarılır.

İmmünosito kimyasal boyama, pluripotens belirteçlerinin ekspresyonunu ve pluripotent kök hücre hatlarının oluşumunu doğrular. Daha sonra çizgileri daha fazla karakterize etmek için ek çalışmalar yapılmalıdır. Genel olarak, somatik hücre hücre programlamasına ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre kültürlerine yeni olan bireyler, doğru IPSC kolonilerini tanımlamak zor olduğu için mücadele edecektir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan Doktor O Üyesi sonrası Dr.Sula Pollak olacak. Bu prosedüre, Phoenix FO hücrelerini 10 santimetre plaka başına yaklaşık yedi ila 8 milyon hücre yoğunluğunda kaplayarak, inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca kültüre 10 mililitre yüksek glikoz DMEM yerleştirin. Ertesi gün, L glutamin ile toplam 500 mikrolitre serum serbest yüksek glikoz DMEM hacminde T üç dört SOX, iki klf, dört cmic veya GFP geni ve 35 mikrolitre birkaç gen altı kodlayan 12 mikrogram bir vektörden oluşan transfeksiyon karışımları hazırlayın.

Karışımları 20 dakika inkübe edin. Daha sonra anka kuşu hücrelerini transfekte etmek için, DNA komplekslerini, %70 ila 80 birleşik olması gereken anka kuşu hücreleri içeren plakalara nazikçe pipetleyin. Hücreleri altı ila sekiz saat sonra 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ortamı aspire edin ve antibiyotikli sekiz mililitre yüksek glikoz DMEM ile değiştirin. Daha sonra plakaları inkübasyonu takip eden 12 saat boyunca inkübatöre geri koyun. Virüs içeren ortamı aspire etmek ve toplamak için bir pipet kullanın.

Daha sonra ortamı değiştirin ve ortam dört kez toplanana kadar bu işlemi her 12 saatte bir tekrarlayın. Ortamı dört santigrat derecede saklayın. Ortamın tamamı toplandıktan sonra, tüm kısımları birleştirin, ardından ayrılmış hücreleri ve kalıntıları temizlemek için 0,45 mikrometrelik bir tüp üst filtreden 50 mililitrelik bir konik tüpe dökün.

Viral partiküller içeren filtrelenmiş ortam, bulaşıcı aktiviteyi kaybetmeden buzdolabında iki hafta boyunca saklanabilir. Dondurma tavsiye edilmez. Transdüksiyon prosedüründen bir gün önce, yetişkin insan fibroblastlarının donmuş stokunu çözün ve altı kuyucuklu jelatin kaplı plakanın her biri için beşinci hücrelere 10 kez ekleyin.

Ertesi gün 50 mililitrelik konik bir tüpte, her biri 3.5 mililitre T dört SOX iki, klf dört ve cmic viral ortamı birleştirin ve kontrol olarak litre başına altı mikrogramlık bir nihai konsantrasyona poli beyin ekleyin. Mililitre başına altı mikrogramlık bir son konsantrasyonda bir mililitre GFP viral ortamı, üç mililitre kültür, orta ve poli beyin hazırlayın. Ortamı insan fibroblastları içeren plakadan aspire edin.

Daha sonra dört mililitre karışık viral ortam veya kontrol ortamı ekleyin, santrifüjlemeyi takiben plakaları 1600 G'de bir saat boyunca 20 santigrat derecede santrifüjleyin. Plakaları yaklaşık 12 saat inkübe edin. Daha sonra viral ortamı fibroblast kültür ortamı ile değiştirin ve 12 saat daha inkübe edin.

Bu işlemi enfeksiyondan fibroblast ortamındaki kültüre kadar, son enfeksiyondan sonra iki kez daha tekrarlayın. Fibroblastları DMEM'de 48 saat boyunca kültürleyin. Daha sonra paralel transdüksiyonların GFP retroviral ortamı ile enfeksiyonunun etkinliğini kontrol edin.

Somatik hücrelerden pluripotent hücrelere yeniden programlamayı başlatmak için. Enfekte fibroblastlar, insan embriyonik kök hücre ortamında veya HES ortamında, tohum fare embriyoniklerinde, fibroblastlarda veya MEF'lerde, muamele edilen jelatinin oyuğu başına yaklaşık iki kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda kültürlenir. Ertesi gün fibroblast büyüme ortamında altı kuyulu plaka.

Enfekte olmuş insan fibroblastlarını% 0.05 tripsin EDTA kullanarak bölün ve fibroblast büyüme ortamındaki kuyu başına yaklaşık 1.2 kez 10 ila dördüncü yoğunlukta tohumlayın. Ertesi gün. Yeniden programlamanın ilk yedi günü için ortamı 0.5 milimolar sodyum bütirat içeren HES ortamıyla değiştirin.

Ortamı günlük olarak değiştirin. Ortamı sodyum bütirat içermeyen HES ortamıyla değiştirin ve yedi ila 21 gün daha yeniden programlamaya devam edin. Ortamı her gün günlük olarak değiştirin.

Morfolojik değişiklikler için dönüştürülmüş hücreleri kontrol edin. Hücre kolonileri, transdüksiyona uğrayan fibroblastların besleyici hücrelere aktarılmasından yaklaşık 10 gün sonra ortaya çıkmaya başlayacaktır. Yeniden programlanmış hücreleri içeren koloniler artık insan kaynaklı pluripotent kök hücreler veya insan IPS hücreleri olarak adlandırılmaktadır.

İnsan IPS hücre kolonileri, MEF besleyici hücrelerine yerleştirildikten sonra 14 ila 28 gün içinde izole edilmeye hazır hale gelecektir. Bu aşamada, insan IPS hücre kolonileri burada MEF içeren veya matrigel kaplı plakalara aktarılabilir. MEF içeren plakalara transfer, insan IPS hücre kolonilerinin toplanmasından bir gün önce gösterilmiştir Fibroblast büyüme ortamında gama ışınlı MEF besleyici hücreleri içeren 24 oyuklu tohum plakaları.

İnsan IPS hücre kolonilerinin toplanacağı gün% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Fibroblast büyüme ortamını ME Fs'den aspire edin ve FBS izlerini gidermek için PBS ile durulayın. Daha sonra, 10 mikromolar kaya inhibitörü Y 2 7 6 3 2 içeren 0.5 mililitre insan embriyonik kök hücresi veya HES ortamı ekleyin, sonraki her bir kuyucuğa, laminer akış başlığına monte edilmiş bir mikroskop kullanarak, insan IPS hücre kolonisi oluşumu için yeniden programlama plakalarını inceleyin.

Gerekirse, insan IPS hücre kolonilerini çevreleyen fibroblastları 21 gauge iğne ile çıkarın. Plakaları PBS ile durulayın ve TRA 180 1 leke canlı spesifik antikoru içeren taze HES ortamı ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübatöre geri koyun.

30 dakika sonra, ortamı 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş taze HES ortamı ile değiştirin. Ardından kolonileri floresan mikroskobu altında görüntüleyin. TRA'yı bir ila 81 pozitif koloni olarak işaretleyin.

21 gauge iğne kullanarak objektif bir işaretleyici kullanma. TRA 180 1 pozitif insan IPS hücre kolonilerini birkaç küçük parçaya bölün. Daha sonra, otomatik bir pipet kullanarak, insan IPS hücre kolonilerinin parçalarını ME Fs ile 24 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.

Plakaları inkübatöre yerleştirin ve insan IPS hücre kolonilerinin günlük olarak 24 ila 36 saat boyunca ortam değiştirmesine izin verin. Doğru HE benzeri morfolojiye sahip insan IPS hücre kolonileri, 24 oyuklu bir plakaya ilk transferden 48 saat sonra görünür olacaktır, insan IPS hücre kolonilerini her altı ila sekiz günde bir 21 gauge iğne plakası ile keserek manuel olarak geçecektir. Kültürlerin 12 kuyucuğa ve ardından klonal genişlemeden sonra altı kuyucuklu bir plakaya genişletilmesi.

Ve insan IPS hücre hatlarının oluşturulması, hatlar oluşturulduktan sonra immünokimya kullanarak TRA bir, 60 SSEA dört, T üç, dört SOX iki ve nanog pluripotens belirteçlerinin ekspresyonunu analiz eder. Ayrıntılı karakterizasyon in vitro ve in vivo gerektirebilir. Farklılaşma analizleri, karyotip analizleri, transgen susturucu metilasyon çalışmaları ve gen ekspresyon çalışmaları.

Retrovirüs içeren besiyeri ile verimli transdüksiyon, viral transdüksiyonun etkinliğini belirlemek için başarılı bir yeniden programlama için kritik öneme sahiptir. Bir Friedrichs ataksi hastasından türetilen insan yetişkin fibroblastları, fibroblastlar viral ortam ile basit inkübasyon ile enfekte olduğunda, hücrelerin% 20'sinden daha azı transdüksiyon edildiğinde, GFP retroviral ortamı ile iki ardışık enfeksiyondan sonra görüntülendi. Bununla birlikte, GFP retroviral ortamının eklenmesi hemen ardından transdüksiyon etkinliği önemli ölçüde artmıştır.

Burada, hücrelerin %80'inden fazlası, izole edilmiş insan IPS hücre kolonilerinin ilk karakterizasyonunu yapmak için dönüştürülür. İnsan ES hücrelerinin karakteristik pluripotens belirteçlerinin ekspresyonu, burada gösterildiği gibi immünokimya ile değerlendirildi. İzole edilmiş insan IPS hücre kolonileri, pluripotent belirteçler için pozitifti.

T: üç, dört, SOX, iki nano, SSEA, dört ve TRA bir, 60 DNA. Üst panellerde gösterilen DPI ile Cos lekelenmesi hem insan IPS hücre kolonilerinde hem de besleyici hücrelerde tespit edilir. Bu sonuçlar, bu yeniden programlama protokolü kullanılarak elde edilen insan IPS hücrelerinin, farklılaşmamış insan pluripotent kök hücreleri için karakteristik olan uygun pluripotens belirteçlerini eksprese ettiğini göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, retroviral işlem tanımlanmış doğru insan indükleyici, pluripotent kök hücre kolonileri kullanılarak insan fibroblastının pluripotent kök hücrelere nasıl başarılı bir şekilde yeniden programlanacağını ve HI PC'lerin ilk karakterizasyonunu nasıl yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız.