Name: İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 23 s
Description: Öğrenin, retroviral vektörler kullanarak yetişkin insan fibroblastlarını insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (hiPSC) yeniden programlama yöntemini. TRA-1-81 antikoru ile canlı boyama ile kolonileri tanımlayın ve genişletin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma FA Araştırma İttifak ve Arnold Aile Vakfı ve Kök Hücreler ve MD Anderson Kanser Merkezi Gelişimsel Biyoloji Merkezi&#39;nden bir pilot hibe ile desteklendi.

1. Virüs üretim ve iletimi <ol><li> DMEM ortamı (DMEM yüksek glikoz,% 10 FBS inaktive ısı, 2 mM L-glutamin, antibiyotik) 10 ml ~ 7-6 8x10 cm başına 10 plakası bir yoğunlukta plakası Phoenix Ampho hücreleri. 37 gece kuvöz ve kültür Yeri ° C,% 5 CO 2. </li><li> 12, bir vektör kodlama ug ya Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, veya GFP geni (Addgene plazmidler 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) ve 35 ul Fugene 6. Kullanılarak sonraki gün transfekte Phoenix hücreleri DMEM ortamı (DMEM yüksek glikoz, 2 mM L-glutamin, hiçbir FBS ve antibiyotikler), 500 ul içinde transfeksiyonuyla karışımı hazırlayın. 20 dakika inkübe edin. Yavaşça% 70-80 konfluent Phoenix hücreleri içeren 10 cm tabak içine DNA kompleksleri Pipeti. </li><li> 8 saat penisilin ve streptomisin içeren DMEM ortamı (DMEM yüksek glikoz,% 10 FBS inaktive ısı, 2 mM L-glutamin) ile birlikte post-transfeksiyon - ortam 6 yerini alır. </li><li> Daha sonra, toplamak virüs içeren 12 medya 4 kez haralıklarla, tüm bölümlerini birleştirmek ve müstakil hücreleri ve enkaz (viral partikülleri içeren ortam da ise dondurulması tavsiye edilmez, bulaşıcı aktivitesini kaybetmeden 2 hafta boyunca buzdolabında muhafaza edilebilir) kaldırmak için filtre 0.45 mikron kullanarak filtrelenmiş. </li><li> Retroviral medya koleksiyonu son gününden önce dondurulmuş bir stok 24 h retroviral iletimi, plaka insan yetişkin fibroblastlarının (pasaj 10, Coriell Laboratories) için. Tohum DMEM yüksek glikoz in oyuk başına yoğunluğu 1x10 5 hücreleri azından 6-de jelatin kaplı levhalar üzerine hücreleri,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, penisilin, streptomisin ve gerekli olmayan amino asitler. </li><li> Phoenix hücrelerden elde edilen viral parçacıklar içeren ortam ile bir sonraki gün ikame DMEM ortamı. Için 1600g azından fibroblast kültürleri ve santrifüj 6-kuyulu plakanın her oyuğuna 6 mg / ml arasında polybrene ile desteklenmiş viral ortamı (1 ml, her Oct4, Sox2, Klf4, ve c-myc ortam, 4 ml toplam) ekleyin 20 de 1 H ° C. Yaklaşık 12 saat after iletimi, fibroblast kültür ortamı ile viral ortamı değiştirin. 24 saat aralıklarla viral enfeksiyon ve santrifüjleme 3 kez gerçekleştirmek. </li><li> Son enfeksiyondan sonra 48 saat DMEM medyada Kültür fibroblastlar. GFP ifade retroviral bir ortam ile paralel transductions ile enfeksiyon kontrol edilmesi. Şekil 1, insan fibroblast santrifüjleme-kolaylaştırılmaktadır retroviral bir enfeksiyon etkinliğini göstermektedir. </li></ol> 2. Yeniden programlama <ol><li> Her sıra jelatin ~ 2x10 5 hücre yoğunluğunda MEF hücreleri tohumlayarak γ-ışınlanmış MEF besleyici katmanları ile 6 oyuklu plakalar hazırlamak fibroblast büyüme ortamında 6 kuyulu plakanın muamele. Ertesi gün fibroblast büyüme ortamında başına iyi ~ yoğunlukta, tripsin / EDTA ve tohum onları 1.2x10 4% 0.05 ile enfekte insan fibroblastları ayrıldı. </li><li> Ertesi gün iEK medya (DMEM/F12,% 20 Nakavt Serum Replacement, non-esansiyel amino asitler, penicilli ile medya yerinen / streptomisin, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 20 ng / ml bazal fibroblast büyüme faktörü (bFGF), yeniden programlanması ilk 7 gün süre ile 0.5 mM sodyum butirat ile desteklenmiş. Günlük medya değiştirin. </li><li> Günlük transdük hücrelerinde morfolojik değişiklikler izleyin. HIPS benzeri hücreler kolonileri yaklaşık 5 oluşmaya başlayacak - 10 gün besleyici hücreler üzerine transdük fibroblastlar aktardıktan sonra. HiPSC koloniler yaklaşık 14 izole edilmeye hazır - 28 gün MEF besleyici hücreler bunları kaplama sonra. </li></ol> 3. HiPSC koloniler izolasyonu <ol><li> HiPSC koloniler almadan önce bir gün fibroblast büyüme ortamında γ-ışınlanmış MEF besleyici hücreler (kuyu başına ~ 4x10 4 hücreleri) ile 24-iyi plakaları hazırlamak. Bu aşamada hiPSC koloniler de Matrigel ve mTeSR1 orta kullanarak besleyici özgür kültür transfer edilebilir. </li><li> HiPSC koloniler izolasyon öncesinde fibroblast büyüme Mediu kaldırarak MEF plakaları hazırlamakm ve FBS izlerini kaldırmak için PBS ile MEFS durulama. Daha sonra her oyuğa 7,8 ila 10 uM ROCK inhibitörü Y27632 ile 0.5 ml iEK ortamı (veya Matrigel kuyucuklar durumunda orta mTeSR1) ilave edilir. </li><li> Gerekirse, laminar flow hood (- C Şekil 2A) monte mikroskop altında 21 gauge iğne ile hiPSC kolonileri çevreleyen fibroblastlar kaldırın. PBS ile plakaları durulayın ve Tra-1-81 StainAlive spesifik antikor (1:200, Stemgent) içeren taze iEK medya ekleyin. Sonra 30 dk., 10 uM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş taze iEK medya ile antikor içeren medya değiştirin. Floresan mikroskop altında plakaları inceleyin ve mark-Tra 1-81 objektif bir belirteç (Şekil 2B) kullanan pozitif koloniler. </li><li> Şekil 2E ve F. gösterildiği gibi 21 gauge iğne ile birkaç küçük parçalar halinde bir laminer kaputu mikroskop altında Tra-1-81 pozitif hiPSC koloniler, Kes </li><li> Ind içine hiPSC kolonilerinin bir otomatik pipet (P200) transferi parçaları kullanarakMEFS veya Matrigel ile 24-kuyulu plakanın ividual kuyu. Olmayan kalça hücrelerinin transferi kaçının. Bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe plakaları yerleştirin ve hiPSC koloniler 24-36 saat boyunca yapışabilen. </li><li> Değişim iEK veya mTeSR1 (Matrigel yetişen koloniler için) medya günlük. Doğru embriyonik kök benzeri morfolojiye sahip hiPSC koloniler 24 sıra tabağa ilk transferini 48 saat sonra görünür olacaktır. </li><li> El geçit hiPSC koloniler her 6 - 12-iyi ve daha sonra bir 6-iyi plaka üzerine 8 gün. </li><li> Klonal genleşme ve hiPSC hatları kurduktan sonra, Şekil 3 'de gösterildiği gibi immünsitokimya kullanılarak pluripotency belirteçler TRA-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, Sox2 ve Nanog ekspresyon analiz. Genomik bütünlük ve karyotip ve teratom oluşumu analizleri 6,9 kullanılarak elde edilen hatların farklılaşma potansiyeli değerlendirin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Retrovirüs içeren medya i ile verimli iletimibaşarılı bir şekilde yeniden programlama için kritik. Bu, Şekil 1 'de gösterildiği gibi etkinliğini izlemek için virüsü her bir deney yeniden programlanması ifade eden bir GFP kullanılarak tamamını transfeksiyon / enfeksiyonu işlemi yürütmek için tavsiye edilir. Tipik olarak 0.5 aralığında olduğu non-konsantre viral ortamı kullanılarak, insan fibroblastlann iletimi yoluyla, 10 içinde açıklandığı gibi GFP eksprese eden virüs titreleri, tespit - 5 x 10 ml (VP / ml) başına 7 viral partiküllerin. Fibroblast son enfeksiyonu sonrası gibi erken 2 gün olarak morfolojisi değiştirin. Tripsinize insan fibroblastları dikkatle MEF besleyici hücreler bunları tohum önce sayılmalıdır. Her hücre hattı farklı büyüme özelliği gösteren ve tohum yoğunluğu yeniden programlama verimliliği için önemlidir çünkü 3 farklı yoğunluklarda (6x10 3, 1.2x10 4, 6 ve plakanın yanı tek başına 2.5x10 4) tohum hücreleri tavsiye edilir. Için kullanılan sodyum butiratİlk 7 - yeniden programlama 14 gün hiPSC formasyonu yaklaşık 5 kat verimliliğini artırır. Sık sık, enfekte fibroblastlar yüksek yoğunlukta ekildi, özellikle fibroblast benzeri hücreler bir kültür çanak sarmak ve Şekil 2A gösterildiği gibi hiPSC koloniler kapsayabilir. Bu durumda, fibroblast tabaka dikkatlice kaldırdı ve hiPSC koloniler (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için kaldırılabilir. Daha sonra, hiPSC koloniler iEK ortam ile durulanmış ve Tra-1-81 antikoru ile boyanmış edilmelidir. Fibroblast hücreleri bağlı olarak, yaklaşık 20 - iPSC benzeri morfolojisi ile gösteren koloniler% 40 Tra-1-81 antikoru ile leke yapmaz. 24 - Belirlenen hiPSC koloniler önümüzdeki 12 içinde bir tabak transfer edilebilir. Uzun süreli inkübasyon hiPSCs hızlı bir farklılaşma neden olacaktır. Koloniler elle MEF besleyici hücre veya Matrigel-kaplı levhalar ya üzerine pasajlanmağa devam edilebilir. Genişleme kurulan sonra hiPSC klonlar pluripoten ifadesi için immünsitokimya (ICC) kullanılarak test edilmelidirŞekil 3'te gösterildiği gibi cy markers. Ayrıca, oluşturulan iPS hücre hatları ayrıntılı bir moleküler karakterizasyonu içermelidir: RT-PCR, 9 susturmak transgenlerin bir pluripotency genler ve analizlerin promotorlerde DNA demetilasyon gösterilmesi kullanarak pluripotency gen ekspresyon analizi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. GFP retroviral medya ile üst üste iki enfeksiyonlarından sonra GFP ifade retrovirüs. (A, B), FA hasta türetilen İnsan yetişkin fibroblast (GM03665, Coriell depo) görüntülenmiştir kullanılarak belirlenir viral iletimi verimliliği. (C, D) İnsan fibroblastlar doğrudan 1600g az 1 saat için 6 oyuklu plakalar üzerine hücrelerinin santrifüj GFP retroviral ortam aynı partiden ile enfekte edilmiştir. Görüntüler enfeksiyondan sonra 48 saat ele geçirildi. <img alt='"Şekil' src='"/' files> Şekil 2. HiPSC koloniler izole edilmesi ve belirlenmesi. (A) fibroblastlar çevrili hiPSCs içeren bir tabak Faz kontrastlı görüntü. Hücreler embriyonik kök medyada 21 gün kültüre edildi. Çevreleyen fibroblast tabakası uzaklaştırıldıktan sonra (B, C) aynı hiPSC koloni. (D) Doğru reprogrammed hiPSC koloniler Tra-1-81 yüzey işaretleyici antikor ile canlı boyama ile tespit edilir, steril bir iğne (E, F) kullanarak kesin ve 24 kuyulu plakanın ayrı kuyu aktarılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Pluripotency belirli bir belirteç Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 ve hiPSCs in Tra-1-60 ekspresyonu immünsitokimya ile tespit edildi.

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28, 713-720 (2011).</li>
<li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+protocols+to+enhance+the+production+and+isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).</li>
<li>Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friedreich%27s+ataxia+induced+pluripotent+stem+cells+model+intergenerational+GAATTC+triplet+repeat+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability.</a> Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).</li>
<li>Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYu%2C+J+%22Essentials+of+Stem+Cell+Biology%22">Essentials of Stem Cell Biology</a>. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+deconstructing+stem+cell+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease.</a> Neuron. 70, 626-644 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Özellikle nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkların insan, okuyan, özellikle yeterli insan hücresel modelleri erişilememesi nedeniyle zor olmuştur. Farklı hücre tiplerine bunları ayırt etmek için oluşturulan pluripotent kök hücreleri ve potansiyel kolayca elde edilebilen somatik hücreleri yeniden programlamayı yeteneği genetik hastalıkların hücresel modeller oluşturmak için bir olasılık açtı. Ayrıca, iPSCs rejeneratif tıp gelecekte bir çok ümit vericidir. Bu nedenle, pluripotency için somatik hücreleri yeniden programl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td></tr><tr><td> KSR </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td></tr><tr><td> Non-esansiyel aminoasit </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Sodyum butirat </td><td> Sigma </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Stemgent </td><td> 03-0002 </td></tr><tr><td> Tra-1-81 antikoru </td><td> Stemgent </td><td> 09-0069 </td></tr><tr><td> Oct3 / 4 antikoru </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8628 </td></tr><tr><td> Nanog antikoru </td><td> Hücre Sinyal Teknoloji </td><td> 4903S &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tra-1-60 antikoru </td><td> Millipore </td><td> MAB4360 </td></tr><tr><td> Sox2 antikoru </td><td> Hücre Sinyal Teknoloji </td><td> 3579S </td></tr><tr><td> SSEA4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td></tr><tr><td> CF1 MEFS </td><td> Globalstem </td><td> GSC-6201G </td></tr><tr><td> Amaç işaretleyici </td><td> Nikon </td><td> MBW10010 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr><tr><td> mTeSR1 </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 05850 </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td></tr><tr><td> Fugene 6 </td><td> Roche </td><td> 11814443001 </td></tr><tr><td> polybrene </td><td> Sigma </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> Nesne belirteci </td><td> Nikon </td><td> MBW10010 </td></tr></tbody></table>

İnsan İsteyerek pluripotent kök hücre seçme ve ayırma kolonileri yetişkin fibroblastlar gelen reprogrammed

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Burada 1-3 sodyum butirat varlığında Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan retroviral vektörlerinin kullanılmasıyla insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (hiPSC) içine insan yetişkin fibroblastlar yeniden programlanması bir protokol sunulmuştur. Biz geç geçit yeniden programlamak için bu yöntem kullanılır (&gt; p10), FA hasta türetilen insan yetişkin fibroblastları (GM03665, Coriell depo). Yeniden programlanması yaklaşım, virüs içeren ortam varlığında fibroblastlann tekrarlanan santrifüj kullanılarak yüksek verimli transdüksiyon protokolü içerir. Reprogrammed hiPSC koloniler Tra-1-81 canlı immun kullanılarak belirlendi, pluripotent hücreler bir yüzey belirteci olmayan reprogrammed fibroblastlar ayrılır ve elle 4,5 pasajlanmağa. Bunlar daha sonra hiPSC Matrigel plakaları aktarılır ve doğrudan yeniden programlanması plakadan, besleyici içermeyen koşullar içinde büyütülmüştür. Birinci geçit başlayarak, hiPSC koloniler iEK-l karakteristiği gösterilmektedirike morfolojisi. Bu protokolü kullanmak seçilen kolonilerin fazla% 70 başarıyla genişledi ve hücre hatları içine kurulabilir. Kurulan hiPSC hatları yüzey işaretleyicileri TRA-1-60 ve SSEA-4, hem de Nükleer belirteçler Oct3 / 4, Sox2 ve Nanog dahil olmak üzere karakteristik pluripotency belirteçler gösterilmiştir. Burada sunulan protokolü kurulmuş ve Friedreich ataksisi hastalar ve kontrol bireyler 6, insan yenidoğan fibroblastlar, yanı sıra insan keratinositleri elde yetişkin fibroblastlar kullanılarak test edilmiştir.

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Burada, ... kodlayan retroviral vektörler kullanılarak insan yetişkin fibroblastlarının insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerine (hiPSC) yeniden programlanmasına yönelik bir protokol sunmaktayız.

Bu video makalesinde, retroviral vektörler kullanılarak insan yetişkin fibroblastları, pluripotent kök hücreler üretmek için yeniden programlanmaktadır. İlk olarak, insan fibroblastları T three four, SOX two, KLF four ve cmic transkripsiyon faktörlerini kodlayan retroviral vektörlerle transdüse edilir.Enfekte fibroblastlar, 14 ila 28 gün boyunca fare embriyonik besleyici hücreler üzerinde kültüre edilir. Oluşan kültürler, yeniden programlanmış hücre kolonilerini tanımlamak için TRA 180 1 antikoru ile boyanır. Pozitif koloniler daha sonra ekspansiyon için MEF içeren plakalara aktarılır.İmmünositokimyasal boyama, pluripotens işaretçilerinin ekspresyonunu ve pluripotent kök hücre hatlarının oluşturulduğunu doğrular. Hatları daha detaylı karakterize etmek için ardından ek çalışmalar yürütülmelidir. Genellikle somatik hücre programlaması ve insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücre kültürlerinde yeni olan kişiler, doğru iPSC kolonilerini tanımlamanın zorluğu nedeniyle güçlük çekeceklerdir.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Sula Pollak gerçekleştirecektir. Bu prosedüre, Phoenix AM FO hücrelerini, 10 santimetrelik plak başına yaklaşık 7 ila 8 milyon hücre yoğ

selecting-isolating-colonies-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Bu video, yetişkin insan fibroblastlarından türetilen indüklenmiş nöral progenitör hücreleri (iNPC'ler) izole etmek için bir tekniği göstermektedir. iNPC kolonilerinin izole edilmesi ve iNPC popülasyonunun sürekli çoğalmasını ve genişlemesini kolaylaştıran uygun kültür ortamının varlığında laminin kaplı çok kuyulu plaka kuyularında kültürlenmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Yetişkin İnsan Fibroblastlarından Türetilen İndüklenmiş Nöral Progenitör Hücre Kolonilerinin İzole Edilmesi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Öğrenin, retroviral vektörler kullanarak yetişkin insan fibroblastlarını insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (hiPSC) yeniden programlama yöntemini. TRA-1-81 antikoru ile canlı boyama ile kolonileri tanımlayın ve genişletin.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Daha fazla video keşfet