Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Bu prosedürün genel amacı, belirli hücre tiplerinde münhasıran floresan bir işaretleyici eksprese eden bir fare hattı kullanarak, sağlam retinadaki tekil nöronların ışık yanıtlarını ve morfolojisini incelemektir. Bu işlem, öncelikle izole bir retina elde etmek için gözün diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinayı bir lazer taramalı mikroskobun altına yerleştirmek ve iki fotonlu kızılötesi eksitasyon yoluyla bir hücreyi görselleştirmektir.

Ardından, kayıt ve boya doldurma işlemi için bütün hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) konfigürasyonu oluşturmak amacıyla bir mikro pipet kullanılır. Nihayetinde bu hazırlık, foto-stimülasyona verilen hücresel yanıtların kaydedilmesine olanak tanır ve konfokal mikroskopi ile kaydedilen hücrenin morfolojisini ortaya çıkarır. Bu tekniğin, retinadan kılavuzsuz yama kenetleme kaydı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, retinayı eksitasyon ışığı ile stimüle etmeden, kaydın floresanla işaretlenmiş bir hücreye görsel olarak yönlendirilebilmesidir.

Bu yöntem, belirli bir hücre popülasyonunun görsel bilgi işlemedeki katkısının ne olduğu gibi, retinal araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; bu durum, hücre popülasyonunun yoğunluğu düşük olsa ve tanımlamayı kolaylaştırabilecek belirgin morfolojik özellikler taşımasa bile geçerlidir. Bu deneye, fareyi deneyden önce en az üç saat boyunca karanlığa adapte ederek başlayın.

Bu sırada, ekteki makalede açıklandığı şekilde hücre dışı çözeltiyi hazırlayın ve oda sıcaklığında karbogen ile havalandırın. Ardından, fareyi sakrifiye edin ve kavisli iris makası kullanarak gözleri çıkarın. Bunları hücre dışı çözelti içeren bir kaba aktarın.

Ardından, bir yaylı makas yardımıyla örneği bir disseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Göz küresini ora serrata boyunca açarak korneayı ve siliyer cismi çıkarın. Lensi alın ve retinayı pigment epitelyumundan dikkatlice ayırın.

Ardından, optik siniri retina ile pigment epiteli arasından kesin. Retinayı göz çukurundan çıkarın. Kıvrılmış retinanın iç tarafının ganglion hücresi tarafı olduğunu unutmayın.

Dış taraf fotoreseptör tarafıdır. Ardından, bir tahta kürdan yardımıyla nazikçe çekerek vitreusu iç retinal yüzeyden uzaklaştırın. Daha sonra, dokunun düzleşmesini kolaylaştırmak için retinal çevre boyunca kısa insizyonlar uygulayın.

Ardından, retinayı fotoreseptör tarafı aşağı gelecek şekilde kayıt haznesine aktarın. İnce bir fırça yardımıyla cam tabana yayın ve paslanmaz çelikten yapılmış, naylon ipli bir çerçeve ile sabitleyin. Kayıt haznesini, dik bir lazer tarama mikroskobu altında karanlığa yerleştirin.

Retina preparatını sürekli olarak dakikada beş mililitreden az olmayacak şekilde süper perfüze edin. 35 °C'ye ısıtılmış, karbondioksit ile oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon kullanılarak, mikroskop bir faraday kafesi içerisindeki sarsıntı önleyici hava tablası üzerine yerleştirilir. Elektronik kalkanlama sağlamak, preparatı korumak ve karanlığı sürdürmek için kafesi şeffaf olmayan bir perde ile örtün.

Ayrıca, bilgisayar monitörlerinden gelen ışığı kırmızı şeffaf filmlerle engelliyoruz. Kızılötesi lazeri 850 ila 870 nanometre veya daha uzun dalga boylarına ayarlayın. Mod kilitli duruma geçin ve GFP eksprese eden hücreleri görüntülemek için iki foton uyarımı kullanın.

Patch clamp kaydı için, beraberindeki makalede açıklandığı üzere, borosilikat cam mikro pipetleri floresan prob içeren hücre içi solüsyonla doldurun. Ardından mikro pipeti tutucuya yerleştirin. Referans elektrodun kayıt haznesindeki hücre dışı solüsyonla temas ettiğinden emin olun.

Ardından, 40 kat büyütmeli su daldırmalı objektif kullanarak mikro pipetle GFP eksprese eden hedef A hücresine basınç uygulayın; Omicron hücre gövdeleri, ganglion hücre tabakasının yanı sıra interpleksiform tabakanın proksimal kısmında yer alır. Mikro pipet hedef hücreyle temas etmeden önce, retinal yüzeydeki iç sınırlayıcı membrana penetrasyon gerçekleştirin. Başarılı penetrasyon, mikro pipet ucundan dışarı çıkan hücre içi solüsyon ve iç sınırlayıcı membranın alttaki retinal dokudan ayrılmasıyla anlaşılır. Hücre içi solüsyondaki floresan boya, istenen hücreye yaklaşırken iki foton görüntüsünde mikro pipetin konumunu ortaya çıkarabilir.

Ardından mikro pipetteki basıncı serbest bırakın ve bütün hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) konfigürasyonunu elde edin. Akım kenetleme modunda, kullanılabilir bir kayıt eksi 50 ila eksi 55 milivoltluk bir membran potansiyeli vermeli ve en az 20 dakika sürmelidir. Bundan sonra, bir bilgisayar monitöründe oluşturulan görsel uyaranları sunun.

Işın yoluna nötr yoğunluk filtreleri yerleştirerek uyaran yoğunluğunu ayarlayın ve stimülasyonun uzamsal konumunu kaydedilen hücrenin merkezine göre düzenleyin. Ardından, stimülasyon protokolünü başlatın ve ışık yanıtlarını kaydedin. Kayıt yazılımını tetiklemek için stimulus jeneratörünü kullanın.

Stimülasyon zamanlamasını kaydetmek için ışın yolu üzerine bir fotodiyot yerleştirin. Mikro pipeti geri çekerken hücre gövdesini yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Boya dolumu tamamlandığında, floresan ajanın kaydedilen hücreye 30 ila 45 dakika boyunca difüze olmasına izin verin.

Burada, promotörleri altında GFP eksprese eden hücrelerin bir retinal düz montaj örneği yer almaktadır. Tirozin hidroksilaz için, GFP sinyalinin parlaklığına göre iki popülasyon ayırt edilebilir. İç pleksiform tabakada yer alan tip bir dopaminerjik hücreler, Şekil A'da ok uçlarıyla gösterildiği gibi zayıf floresans eksprese eder. Tip iki hücreler ise yoğun şekilde işaretlenmiştir ve hücre gövdeleri ya Şekil A'daki oklarla gösterildiği gibi ilgili tabakada ya da Şekil B'de gösterildiği gibi ganglion hücre tabakasına kaymış durumdadır; Şekil C, tip iki hücrelerin iç pleksiform tabakanın üçüncü stratumundaki dendritik stratifikasyonunu göstermektedir; burada izleyici neuro biotin enjekte edilmiş bir tip iki hücrenin morfoloji örneği sunulmuştur.

İzleyici, daha sonra burada macenta renginde gösterilen floresan işaretli streptavidine bağlanarak görselleştirilmiştir. Burada, ganglion hücre tabakasında yer alan tip iki bir hücrenin beyaz ışığa verdiği farklı yanıt paternleri görülmektedir. Bu prosedürü takiben, uyaran başlangıcındaki ve sonundaki yanıt bileşenlerinin daha iyi ayırt edilebilmesi için üç saniyelik uzun süreli bir uyaran kullanılmıştır.

Retina devrelerinde belirli bir hücre tipinin fonksiyonel rolü gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla farmakolojik deneyler, kalsiyum görüntüleme veya immünokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.