Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Bu prosedürün genel amacı, yalnızca belirli hücre tiplerinde bir floresan işaretleyiciyi ifade eden bir fare çizgisi kullanarak, sağlam retinadaki tek nöronların ışık tepkilerini ve morfolojisini incelemektir. Bu, izole bir retina elde etmek için önce gözün diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, retinayı bir lazer tarama mikroskobu altına koymak ve bir hücreyi iki foton kızılötesi uyarımı ile görselleştirmektir.

Daha sonra, kayıt ve boya dolumu için bir tam hücre yama kelepçesi konfigürasyonu elde etmek için bir mikro pipet kullanılır. Sonuç olarak, bu hazırlık, foto stimülasyona hücresel tepkilerin kaydedilmesine izin verir ve kaydedilen hücrenin morfolojisini konfokal mikroskopi ile ortaya çıkarır. Bu tekniğin retinadan kılavuzsuz yama kelepçesi kaydı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kaydın retinayı uyarma ışığı ile uyarmadan görsel olarak floresan olarak işaretlenmiş bir hücreye yönlendirilebilmesidir.

Bu yöntem, belirli bir hücre popülasyonunun görsel bilginin işlenmesine katkısı gibi retina araştırmalarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Hücre popülasyonu düşük yoğunluğa sahip olsa ve tanımlamayı kolaylaştırabilecek herhangi bir belirgin morfolojik özellik taşımasa bile. Bu deneye, deneyden en az üç saat önce fareyi karanlıkta geçirerek başlayın.

Bu arada, hücre dışı çözeltiyi ekteki el yazmasında anlatıldığı gibi hazırlayın ve oda sıcaklığında karbojen ile köpürtün. Ardından, fareyi feda edin ve bir çift kavisli iris makasıyla gözleri çekirdeklendirin. Onları hücre dışı bir çözelti kabına aktarın.

Daha sonra bir çift yaylı makasla diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Aura serrata boyunca göz ampulünü açarak kornea ve siliyer gövdeyi çıkarın. Lensi çıkarın ve retinayı pigment epitelinden dikkatlice ayırın.

Bundan sonra, retina ve pigment epiteli arasındaki optik siniri kesin. Retinayı göz kabından çıkarın. Kıvrılmış retinanın iç kısmının ganglion hücresi tarafı olduğuna dikkat edin.

Dışarısı fotoreseptör tarafıdır. Daha sonra tahta bir kürdan yardımıyla nazikçe çekerek vitreusu iç retina yüzeyinden çıkarın. Daha sonra dokunun düzleşmesini kolaylaştırmak için retina çevresi boyunca kısa kesiler uygulayın.

Ardından, retinayı fotoreseptör tarafı aşağı bakacak şekilde kayıt odasına aktarın. İnce bir fırça ile camın altına yayın ve naylon gergin paslanmaz çelik bir çerçeve ile hareketsiz hale getirin. Kayıt odasını dik bir lazer tarama mikroskobu altında karanlıkta yerleştirin.

Retina preparatını dakikada en az beş mililitrede sürekli olarak süper kaynaştırın. 35 santigrat dereceye kadar ısıtılmış araba oksijenli hücre dışı çözelti ile mikroskop, bir faraday kafesi içindeki şok emici bir hava tablasına yerleştirilmiştir. Elektronik koruma için, hazırlığı ve karanlığı korumak için kafesi şeffaf olmayan bir perde ile örtün.

Ayrıca bilgisayar monitörlerinden gelen ışığı kırmızı şeffaf filmlerle perdeliyoruz. Kızılötesi lazeri 850 ila 870 nanometre veya daha uzun dalga boylarına ayarlayın. Mod kilitli duruma geçin ve GFP ifade eden hücreleri görselleştirmek için iki foton uyarımı kullanın.

Yama kelepçesi kaydı için, boro silikat cam mikro pipetleri, ekteki el yazmasında açıklandığı gibi bir floresan probu içeren hücre içi çözelti ile doldurun. Ardından mikro pipeti tutucuya yerleştirin. Referans elektrodunun kayıt odasındaki hücre dışı çözelti ile temas halinde olduğundan emin olun.

Ardından, 40 kat suya daldırma kullanarak mikro pipet hedefi GFP eksprese eden bir hücreye basınç uygulayın Amaç, Omicron hücre gövdeleri, mikro pipet hedeflenen hücre ile temas etmeden önce ganglion hücre tabakasında ve ara şeffaf tabakanın proksimal kısmında bulunur. Başarılı penetrasyon, mikro pipet ucundan dışarı atılan hücre içi solüsyon ve iç sınırlayıcı zarın alttaki retina dokusundan ayrılması ile tanınır. Hücre içi çözeltideki floresan boya, istenen hücreye yaklaşırken iki foton görüntüsündeki mikropipet konumunu ortaya çıkarabilir.

Ardından mikro pipetteki basıncı boşaltın ve tam hücre yama kelepçesi konfigürasyonu elde edin. Mevcut kelepçe modunda, kullanılabilir bir kayıt eksi 50 ila eksi 55 milivolt arasında bir membran potansiyeli vermeli ve en az 20 dakika sürmelidir. Bundan sonra, bir bilgisayar monitöründe oluşturulan görsel uyaranları sunun.

Işın yoluna nötr yoğunluk filtreleri yerleştirerek uyaran yoğunluğunu ayarlayın ve uyarımın uzamsal konumunu kaydedilen hücrenin merkezine göre ayarlayın. Ardından, stimülasyon protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Kayıt yazılımını tetiklemek için uyaran üretecini kullanın.

Uyaran zamanlamasının kaydını tutmak için ışın yoluna bir foto diyot ekleyin. Mikro pipeti geri çekerken hücre gövdesini dışarı çekmemeye dikkat edin. Boya dolgusu için yapıldığında, floresan ajanın kaydedilen hücreye 30 ila 45 dakika boyunca yayılmasına izin verin.

Burada, promotörlerinin altında bir retinal düz montajda GFP eksprese eden hücrelerin bir örneği Tirozin hidroksilaz için, GFP sinyalinin parlaklığı ile iki popülasyon ayırt edilebilir. Ara şeffaf katmanda bulunan bir dopaminerjik hücre yazın, ok uçları tarafından gösterildiği gibi zayıf floresan ifade eder. Şekil A'da.Tip iki hücre yoğun bir şekilde etiketlenmiştir ve hücre gövdeleri ya şekil A'daki oklarla gösterildiği gibi katmanda ya da şekil B'de gösterildiği gibi ganglion hücre katmanında yer değiştirmiştir, şekil C, iç pleksiform tabakanın üçüncü tabakasında tip iki hücrelerin dendritik bir tabakalaşmasını göstermektedir, burada gösterilen izleyici nöro biotin ile enjekte edilen bir tip iki hücrenin morfolojisinin bir örneğidir.

İzleyici daha sonra, burada macenta olarak gösterilen floresan etiketli streptavidine bağlanarak görselleştirildi. İşte ganglion hücre tabakasında bulunan bir tip iki hücrenin beyaz ışığa farklı tepki modelleri. Bu prosedürü takiben, uyaran, başlangıç ve ofsetteki yanıt bileşenlerinin daha iyi ayırt edilmesi için üç saniyelik uzun süreli bir uyaran kullanıldı.

Farmakolojik deneyler, kalsiyum görüntüleme veya immünokimya gibi diğer yöntemler, retina devresindeki belirli bir hücre tipinin işlevsel rolü gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.