Name: Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Öğrenin, iki fotonlu kızılötesi uyarım ve yama kelepçesi kullanarak bozulmamış fare retinasında GFP ifadeli nöronların ışık yanıtlarını ve morfolojisini kaydetmeyi. Bu yöntem görsel hedefleme ile retinal fonksiyon araştırmalarını geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (KD ve RW WE849/16 1 / 2) tarafından desteklenmiştir. Biz ışık uyarımı yazılım QDS Thomas Euler (Töbingen Almanya) teşekkür ediyoruz.

Aşağıdaki açıklama, deneyci, retina yapısı, patch-kelepçe kayıt, ve iki-foton mikroskopi temel bir anlayış olduğunu varsayar. Patch-kelepçe kurulum ve iki foton görüntüleme sistemi kurmak ve işletmek konusunda yararlı bilgiler için refs [7-12]. 1. Hayvan ve doku hazırlama <ol><li> Fare, en az 3 saat süreyle karanlığa uyumlu tutun Bu arada, carbogen ile gazla oluşan ekstrasellüler çözüm 1-2 l (mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 CaCl 2, 1.6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glukoz hazırlamak ve pH 7.4 'e dengelenmesi oda sıcaklığında (% 5 O 2 CO 2). </li> bir <li> CO 2 doz aşımı servikal dislokasyon ile hava geçirmez bir odasında fare Euthanize. Bu prosedür ve aşağıdaki adımları karanlıkta yapılmalıdır. Uzun dalga boyu loş aydınlatma (690 nm-longpas soğuk ışık kaynağı kısa dalga boylarında blok kullanın.hayvanın gözleri koyu (fareler sadece ışık tayfının kırmızı bölümüne kötü bir vizyona sahip) adapte tutarak filtre) kişisel vizyonu desteklemek için. Zifiri karanlığa kullanımı (&gt; 800 nm) kızılötesi aydınlatma çalışmaları ve gece görüş gözlüğü kullanınız. </li><li> Kavisli iris makası çifti ve ekstrasellüler çözüm diseksiyon mikroskobu altında yerleştirilen bir tabak aktarabilirsiniz aydınlatmak gözler. </li><li> Kornea ve bir çift yaylı makas (ilk delmek için kesim için bir başlangıç ​​noktası bir neşter kullanmak) ora serrata (retina ve siliyer cisim arasındaki sınır) birlikte göz ampul açarak siliyer cisim çıkarın. Lens ve retina pigment epiteli dikkatle ayırın. Retinanın yönünü incelemek için önemli ise, Ref gibi göstermektedir [12]. Kes retina pigment epiteli arasında optik sinir ve retina Göz yuvası kaldırmak. Retina yüzeylerin yönde Not: kıvrılmış retinanın iç Gangliyon pil tarafı; dış fotoreseptör tarafı. </li><li> Vitreus iç retina yüzeyinde bir kürdan yardımı ile yavaşça çekerek çıkarın. Bu amaçla, sadece retinanın küçük bir hacim kaplayan ekstrasellüler çözüm kullanın. Vitreus kürdan sopa ve retina kapalı savurma sürüklenebilir. Sonra, doku düzleştirme kolaylaştırmak için retina çevresince kısa kesiler geçerlidir. </li><li> Cam taban üzerine yaymak (biz ince bir fırça kullanın), paslanmaz çelik bir naylon sinirli çerçeve ile hareketsiz, kayıt odasının aşağı fotoreseptör tarafı retina aktarın. Aynı şekilde ikinci retina hazırlayın ve daha sonra kullanmak için carboxygenated ekstrasellüler çözüm koyu adapte tutmak. </li></ol> 2. Kayıtlar <ol><li> Dik bir lazer tarama mikroskop altında karanlıkta kayıt odası yükleyin ve (sürekli retina hazırlık superfuse en az 5 ml / micarboxygenated ekstrasellüler çözüm n) 35 ° C'ye kadar ısıtılır Mikroskop (bir kızılötesi hassas CCD kamera ile donatılmıştır) elektronik koruma için bir Faraday kafesi içinde bir şok emici hava tablo yer almaktadır. Kafes, karanlıkta hazırlık tutmak için şeffaf olmayan bir perde ile kaplayın. Ayrıca, bilgisayar monitörleri ışık kapalı kırmızı şeffaf film ekran. </li><li> Mod-kilitli duruma geçiş, GFP ifade hücreleri görselleştirmek için iki foton uyarma, kızılötesi lazer 850-870 nm ya da daha uzun dalga boylarında ayarlayın. Floresan hücre net olarak tanınması için yeterli bir derece için lazer tarama yazılımı tarafından kontrol nötral yoğunluk filtreleri kullanarak lazer çıktı zayıflatır. </li><li> Oluşan hücre içi çözüm (mM) 125 K-glukonat, 10 KCl, 0.5 EGT dolu akım kelepçe modunu kullanmak cam mikropipetler yama klemp kayıtları (borosilikat cam tüp 1,5 mm dış çapında ve 0,225 mm et kalınlığı)KOH (M yaklaşık 5 pipet direnç veren) ile pH 7.4 'e titre, 10 Hepes. Voltaj-klemp kayıt gibi diğer deneysel koşullar altında, farklı bir çözüm gerektirdiğini unutmayın. Boya enjeksiyonları istenirse, floresan bir prob (10 mM Alexa Fluor 594) veya bir izleme molekülü (3% Neurobiotin) ekleyin. Mikropipet yuvaya yerleştirin ve referans elektrot (klorlu gümüş tel) kayıt odasında ekstraselüler çözümü ile temas halinde olduğundan emin olun. </li><li> Mikropipet basınç uygulayın ve hedef GFP-eksprese eden hücre (40 kat su altında kalacak hedefi, NA 1.25). Amacrine hücre gövdeleri iç nükleer tabakanın proksimal parçası (hazırlık içinde yaklaşık 55-75 mikron derin) ganglion hücre tabakası (doğrudan retinanın yönde yüzeyinin altında) hem de bulunmaktadır. Hedeflenen hücre, iç limitan membran (glial endfeet yapılmış bir kılıf) ile retina mikropipet temasa geçmeden önceyüzeyine nüfuz olmak zorundadır. Başarılı penetrasyon mikropipet ucundan dışarı sürülür ve IR CCD kamera tarafından yakalanan bir kızılötesi görüntü görülebilir olarak altta yatan retina dokusunun iç sınırlayıcı zarı ayırır intrasellüler çözümü ile tanınır. </li><li> IR CCD kamera kayıt mikropipet konumunu gösteren resim ile iki foton görüntü soma pozisyonu karşılaştırarak istediğiniz hücreye Yaklaşım. GFP-eksprese eden hücre mikropipet doğru yönlendirmek için kızılötesi görüntü kabul etmek gerekir, çünkü bu adımı kolayca elde olmadığına dikkat edin ve biraz pratik gerektirir. Doğru hedefleme mikropipet ucu iki foton görüntü görülebilir hücre yüzeyinin dimpling neden olduğunda elde edilir. Bu yönteme alternatif olarak, iki foton görüntü mikropipet konumunu ortaya çıkarmak için intrasellüler çözüm floresan boya kullanın (örneğin, Alexa Fluor 594, 100 mcM). İki foton kızılötesi uyarım bu boya mikropipet ayırt yapmak için yeterli floresan sağlar. Bu amaçla, lazer tarama yazılımı kırmızı floresan de kapsayacak şekilde algılama aralığı ayarlayın. </li><li> Mikropipet baskısı bırakın ve akım kelepçe modunda bir bütün hücre patch-klemp yapılandırma almak. Kullanılabilir bir kayıt, bir zar potansiyeli -50 ile -55 mV ve en azından 20 dakika için son vermelidir. </li><li> Bir bilgisayar monitörü stimülasyon yazılım (QDS: Thomas Euler, Tübingen Üniversitesi, Almanya) 11 tarafından oluşturulan Mevcut görsel uyaranlara . Stimülasyon kaydedilen hücre merkezli mekansal konumunu ayarlayın: IR CCD kamera ve merkezi bir nokta gibi uyaran üzerine iletim görüntü gösteren monitör hücre pozisyonunu işaretleyin. Işın yoluna nötral yoğunluk filtreleri takarak uyaran yoğunluğunu ayarlayın. Ref [14] monitör spektrum ve yoğunluk kalibrasyonu için bkz. Prolonge seçind interstimulus aralığı (örneğin 15 s) uyum önlemek için. Uyaran zamanlama kaydını tutmak için bir ışın yolu içinde fotodiyot ekleyin. </li><li> Stimülasyon protokolü başlatın ve hafif yanıtları (5 kHz-spike olmayan hücreler için filtreleme ile 10 kHz örnekleme oranı kullanır; başak kayıt için 20 kHz gibi yüksek bir örnekleme oranı tavsiye edilir) kayıt. Kayıt yazılımı tetiklemek için ışık uyarımı yazılımı kullanın. </li><li> Boya için dolgu hücre mikropipet dikkatle geri çekilmeden önce, 30-45 dakika süreyle kayıtlı hücreye floresan ajan diffüz izin. Hücre gövdesinden dışarı çekmeye özen gösterin. Floresan olmayan tracer Neurobiotin kullanılmış olsaydı, bir fluorofor konjuge streptavidin (4 gece boyunca streptavidin Cy3, 1:400 ° C bağlanarak görselleştirme ihtiyaçlarını retina paraformaldehid fiksasyon 20 dakika sonra, boya-kaplin çalışmaları streptavidin inkübasyon) 3 d uzatılabilir. Alternatif olarak, enjeksiyonlar da yapılabilir.boya kazığa hücre (0,25-1 nA, 100 ms aralığı 100 ms, toplam süre 3-6 dk dikdörtgen darbeler) iontophoretically tahrik keskin elektrot (M 100). </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Aşağıdaki sonuçlar bir fare üzerinde yapılan bir çalışmada tirozin hidroksilaz 13,14, katekolamin sentezini adım (: GFP fare TH) hız sınırlama katalize enzim organizatörü altında yeşil floresan proteini (GFP) ifade kaynaklanan. GFP sinyal iki farklı hücre popülasyonlarının parlaklık dayanarak ayırt edilebilir (Şekil 2A). Yüksek GFP düzeyde eksprese eden hücrelerin (GCL, Şekil 2B), iç nükleer tabaka (INL, Şekil 2A) bulunan ya da ganglion hücre tabakası yerinden hücre bedenlere sahip ve iç pleksiform tabakasının ortasında tabakalandırmak (IPL, Şekil 2C) . Tip 2 hücreler 14-16 olarak tespit edildi ve morfolojisi açısından sistematik olarak incelenmiştir (Şekil 3) ve seçme olabilirrical aktivite (Şekil 4), nüfus yoğunluğu 250 hücre / mm 2 miktarda bile. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Deney düzeneği şematik. İki foton uyarma (kırmızı noktalı ışık yolu) fluorofor ifade sağlam retina hücre görsel bir mikropipet (yeşil emisyon ışık yolu) hedeflemektedir. Retinanın, mikroskop (sarı ışık yolu) kondansatör aracılığıyla yansıtılan optik uyaranlara maruz kalır ve hücresel ışığı yanıtları kaydedildi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. GFP ifade TH bir retina flatmount hücreleri: GFP fare. Zayıf floresan (A, ok) gösteren INL bulunan tip 1 hücrelerinin (DA hücreleri) ve yoğun etiketli tip 2 hücreleri iki nüfus GFP sinyal parlaklık tarafından ayırt edilebilir.INL (A, oklara bakın) veya GCL (B) ve IPL stratum S3 (C) dendritik tabakalaşma yerinden ya hücre organları ile. Ölçek barlar, 50 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 tracer Neurobiotin enjekte tip 2 hücre morfolojisi. Tracer sonradan streptavidin Cy3 bağlama (eflatun) tarafından görüntülendi. GFP sinyal (yeşil) tasvir mikrografı, görüntü yığınlarının GCL ve IPL kapsayan bir projeksiyon. Ölçek çubuğu, 50 mm. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. GCL bulunan bir tip 2 hücre Işık cevapları. Tepki desen scotopic aralığında artan yoğunluğu beyaz ışık tam saha aydınlatma. Stimulus yoğunluğu çubuk (Rh * / çubuk / s), saniyede ortalama photoisomerizations verilir. 3 sn uzun bir uyaran daha iyi farklı için kullanılanyanıtı uyaran başlangıcı bileşenleri (tepki ON) ve (kapalı yanıtı) ofset iyon.

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+MB+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. Gerfen, C. , Wiley. (1997).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pf%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li>
<li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22maging+in+Neuroscience+and+Development%3A+A+Laboratory+Manual%22">maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).</li>
<li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li>
<li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li>
<li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li>
<li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li>
<li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li>
</ol>

Fare ele ve hayvan refahı için kurumsal kurallar ve hayvan deneyleri Alman hükümeti tarafından çıkarılan kanunları uyarınca ötenazi edildi.

Bu yöntem, retinanın adaptasyonel durumu etkileyen görsel rehberliği altında sağlam retina belirli nöronların elektriksel özellikleri çalışma imkanı sunuyor. Özellikle şu anda hücreleri oldukça kötü amacrine hücrelerinin çoğu popülasyonları gibi düşük nüfus yoğunluğu nedeniyle eğitim karakterizasyonu için uygundur. İki foton uyarma, 17 doku derin kısımlarında, hassas hedefleme için önkoşul ve başarılı hücrelerin özellikle hücre gövdeleri, yüksek yoğunluklu INL yama-sıkma. Bile yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntü izin Izole fare retina deneysel koşullar altında 3-4 saat için geçerli. Ikinci retina sürekli carbogen gazlama altında tamamen karanlıkta saklanan ise, ağartılmamış photopigment mor rengini korur ve ilk retina ile deneyler bitirdikten sonra kullanılabilir. Başlangıçta, hedeflemeKaranlıkta çalışmak, özellikle de retina wholemount mikropipet ile seçili hücre biraz zorlu ve bazı pratik gerektirir. Aynı zamanda hücre ve mikropipet iki foton uyarma altında görünür çünkü mikropipet bir floresan boya dahil olmak üzere, prosedürü kolaylaştırmak. Ancak, hücre içi bir çözüm için bileşenler ekleyerek gigaseal oluşumunu engelleyen veya kayıt kalitesini acı neden olabilir. Bir kez başarıyla, iyi bir kayıt yaklaşık 1 saat sürebilir Oysa kendisi sadece kötü kızılötesi uyarma ışığı retina fotoreseptör tarafından emilir, heyecanlı, GFP ifade spektrumun görünür hücrelerin ışık yayarlar. Ancak, fluorophores sadece retinanın adaptasyonel durumu değiştirmek olası değildir küçük bir odak hacmi heyecan duyuyoruz. Daha fazla, uyarım sadece hedefleme için gereklidir ve ışık yanıtların kayıt sırasında kapatılabilir. Usefulnbu yaklaşımın ess zaten belirli populasyonlar üzerindeki elektrofizyolojik kayıtlar sadece kaza 12 ile aksi mümkün olurdu hangi amacrine hücreleri 14,18 çalışmalar ile gösterilmiştir. Son olarak, bu güçlü teknik bir farmakolojik yaklaşım 14, Ca 2 + görüntüleme 19 dahil ederek ya da enjekte edilen hücrelerin immünositokimyasal çalışmaları veya elektron mikroskobu kullanarak daha uzatılabilir. Bu şekilde, belirli bir hücre tipi retina devresi fonksiyonel pozisyonda sökülmüş olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipmanı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Gece görüş gözlüğü </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Almanya </td><td> Xtron F1 </td><td> 800 nm dalga boyundaki ışık kaynağı içerir </td></tr><tr><td> Optik filtre </td><td> Schott, Mainz, Almanya </td><td> RG9 </td><td> kesim ile 690 nm filtre longpass </td></tr><tr><td> İris makası </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14061-09 </td><td> 22 mm bıçak ile kavisli </td></tr><tr><td> Bahar makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-00 </td><td> 3 mm bıçak düz </td></tr><tr><td> Kayıt odasına </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Almanya </td><td> 2-100 500 0180 A tipi (TC) </td><td> Alt monte edilmiş cam kapak kayma teflon haznesi (yaklaşık 0,15 mm; No: 2-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Akış ısıtıcı </td><td> Çok Kanallı Sistemleri, Reutlingen, Almanya </td><td> PH01, TC01 </td><td> sıcaklığı ile ısıtılabilir perfüzyon kanülüEnsor ve sıcaklık kontrolörü </td></tr><tr><td> Lazer tarama mikroskobu </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> Leica Konfokal Software tarafından kontrol </td></tr><tr><td> Hava tablo </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Lazer </td><td> Spectra-fizik </td><td></td><td> Tsunami Mod-kilitlenmiş Ti: Safir Lazer </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> pco AG, Kelheim, Almanya </td><td> PixelFly QE </td><td> kontrol yazılımı da dahil olmak üzere </td></tr><tr><td> Mikropipet cam kapilerleri </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Almanya </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet çektirmesi </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> floresan boya </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> non-floresan tracer </td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Almanya </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> Mini25 manipülatör birim ile motorlu ekran SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-kelepçe amplifikatör </td><td> NPI elektronik GmbH, Tamm, Almanya </td><td> SEC-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> Sayısallaştırıcı </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Veri toplama yazılımı WinWCP </td><td> John Dempster, Glasgow, İngiltere, İskoçya Üniversitesi </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> Görsel uyaran jeneratör QDS </td><td> Thomas Euler, Tübingen Üniversitesi, Almanya </td><td></td><td> ayrı bir bilgisayara 2 monitör (kullanıcı arabirimi, uyaran monitör) kontrol ameliyat olmak zorunda </td></tr><tr><td> Nötr yoğunluk filtreleri </td><td> Yaninda, Mainz, Almanya </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bozulmamış retina elektrofizyolojik karakterizasyonu gfp-ifade eden hücre popülasyonlarının

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Fizyolojik özellikleri ve sağlam doku belirli nöronların sinaptik bağlantıların incelenmesi göze çarpan morfolojik özellikleri olmayan ya da düşük bir nüfus yoğunluğu bu hücreler için bir meydan okuma. Bu durum özellikle, retina amacrine hücreleri, memeliler 1 kabaca 30 alt tipi oluşturan internöronlar son derece çok şekilli bir sınıf için geçerlidir . Görsel işleme retina çıkış 2 şekillenmesinde çok önemli bir parçası olmanın rağmen bu hücrelerin bir kayıt elektrodu ile karşılaşan nadir bir olay olduğundan, bu alt tiplerinin çoğu artık işlevsel bir bağlamda çalışılmıştır değil. Son zamanlarda, bir çok transgenik fare hatları kullanılabilir ifade floresan membran reseptörlerine ya da belirli bir doku 3,4 nöronların sadece bir alt kümesini özel enzimler için yararlanıcı grupların kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) gibi belirteçler . Bu ön-işaretli hücrelerin bu nedenle accessible in situ fizyolojik özelliklerinin sistematik çalışma izin mikroskobik kontrolü altında hedef yönettiği mikroelektrot. Ancak, floresan belirteçlerin uyarma canlı doku için fototoksisite riski eşlik eder. Retina, bu yaklaşımın ek olarak uyarma ışık fotoreseptörlerin uygun stimülasyon neden olduğu, böylece photopigment inflicting ağartma ve ışık adapte retina devreler transfer sorunu bir engel teşkil etmektedir. Bu sakıncaları femtosecond aralığı kısa darbeler bir mod-kilitli lazer tarafından teslim kızılötesi uyarma kullanarak üstesinden. İki foton uyarma fluorofor uyarma için yeterli enerjiyi sağlar ve aynı zamanda küçük bir doku hacmi fotohasar 5 tehlikeleri en aza indirmek için uyarma kısıtlar. Ayrıca, kızılötesi ışık (850 nm) sadece kötü photopigments 6 tarafından emilir beri görsel uyaranlara duyarlı retina bırakır. &quot;jove_content&quot;&gt; in situ kayıtlarında elektrofizyolojik ulaşmak için bir transgenik fare retinanın kullanımını göstermek GFP ifade görsel iki foton uyarma tarafından hedef hücreleri . Retina hazırlanan ve karanlıkta tutulan ve mikroskop (Şekil 1) kondenser yoluyla tahmin edilmektedir optik uyaranlara maruz olabilir. Boya dolgu morfolojisini ortaya çıkarmak için, hedef hücre farklı deneysel düzeylerde ele böylece, komşu hücreler için kaplin boşluğu kavşağı-aracılı boya kontrol etmek için ışık yanıtları Patch-klemp kayıt ile kombine edilebilir.

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

İntakt dokudaki spesifik nöronların fizyolojik özelliklerini ve sinaptik bağlantılarını incelemek, ... eksikliği olan hücreler için zorlayıcıdır.

Bu prosedürün genel amacı, belirli hücre tiplerinde özel olarak floresan bir marker eksprese eden bir fare hattı kullanarak, sağlam retinadaki tekil nöronların ışık yanıtlarını ve morfolojisini incelemektir. Bu işlem, öncelikle izole bir retina elde etmek için gözün diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinayı bir lazer tarama mikroskobunun altına yerleştirmek ve iki fotonlu kızılötesi eksitasyon yoluyla bir hücreyi görselleştirmektir.Kayıt ve boya doldurma işlemi için ardından bir mikro pipet kullanılarak bütün hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) konfigürasyonu sağlanır. Nihayetinde, bu hazırlık fotostimülasyona verilen hücresel yanıtların kaydedilmesine olanak tanır ve konfokal mikroskopi ile kaydedilen hücrenin morfolojisinin ortaya çıkarılmasını sağlar. Bu tekniğin, retinadan kılavuzsuz yama kenetleme kaydı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, retinayı eksitasyon ışığıyla stimüle etmeden, kaydın görsel olarak floresan işaretli bir hücreye yönlendirilebilmesidir.Bu yöntem, belirli bir hücre popülasyonunun görsel bilgi işlemedeki katkısının ne olduğu gibi, retinal araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; bu durum, hücre popülasyonu düşük yoğunlukta olsa ve tanımlamayı kolaylaştırabilecek belirgin morfolojik özellikler taşımasa dahi geçerlidir. Deneye, fareyi deneyden önce en az üç saat boyunca karanlığa adapte ederek başlayın.Bu sırada, beraberindeki makalede açıklandığı şekilde hücre dışı solüsyonu hazırlayın ve oda sıcaklığında karbogen ile havalandırın. Ardından, fareyi sakrifiye edin ve kavisli iris makası ile gözleri nukle edin. Bunları hücre dışı solüsyon içeren bir kaba aktarın.Ardından, yaylı makas kullanarak örneği bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Göz küresini ora serrata boyunca açarak korneayı ve siliyer gövdeyi çıkarın. Lensi alın ve retinayı pigment epitelyumundan dikkatlice ayırın.Ardından, retina ile pigment epitelyumu arasındaki optik siniri kesin. Retinayı göz çukurundan çıkarın. Kıvrılmış retinanın iç kısmının ganglion hücresi tarafı olduğunu unutmayın.Dış kısım fotoreseptör tarafıdır. Ardından, vitreusu iç retinal yüzeyden bir tahta kürdan yardımıyla nazikçe çekerek uzaklaştırın. Daha sonra, dokunun düzleştirilmesini kolaylaştırmak için retinal çevre boyunca kısa insizyonlar uygulayın.Ardından, retinayı fotoreseptör tarafı aşağı gelecek şekilde kayıt haznesine aktarın. İnce bir fırça yardımıyla cam taban üzerine yayın ve paslanmaz çelikten yapılmış, naylon ipli bir çerçeve ile sabitleyin. Kayıt haznesini, dik konumlandırılmış bir lazer tarama mikroskobu altında karanlığa yerleştirin.Retinal preparatı, dakikada beş mililitreden az olmayacak şekilde sürekli olarak süper perfüze edin. 35 °C'ye ısıtılmış, karbon oksijenli hücre dışı solüsyonu ile birlikte mikroskop, bir faraday kafesi içindeki şok emici hava tablası üzerine yerleştirilir. Elektronik kalkanlama için, preparatı karanlıkta tutmak amacıyla kafesi şeffaf olmayan bir perde ile kapatın.Bilgisayar monitörlerinden gelen ışığı ayrıca kırmızı şeffaf filmlerle engelliyoruz. Kızılötesi lazeri 850 ila 870 nanometre veya daha uzun dalga boylarına ayarlayın. Mod kilitli duruma geçin ve GFP eksprese eden hücreleri görüntülemek için iki foton uyarımı kullanın.Patch clamp kaydı için, borosilikat cam mikro pipetleri, beraberindeki makalede açıklandığı üzere floresan prob içeren hücre içi solüsyonla doldurun. Ardından mikro pipeti tutucuya yerleştirin. Referans elektrodun, kayıt odasındaki hücre dışı solüsyonla temas ettiğinden emin olun.Ardından, 40 kat büyütmeli su daldırmalı objektif kullanarak mikro pipetle A GFP eksprese eden hücreye basınç uygulayın; Omicron hücre gövdeleri, ganglion hücre tabakasının yanı sıra interpleksiform tabakanın proksimal kısmında yer alır. Mikro pipet hedef hücreyle temas etmeden önce, retinal yüzeydeki iç sınırlayıcı membranı penetre edin. Başarılı penetrasyon, mikro pipet ucundan dışarı çıkan hücre içi solüsyon ve iç sınırlayıcı membranın altındaki retinal dokudan ayrılmasıyla anlaşılır. Hücre içi solüsiyondaki floresan boya, istenen hücreye yaklaşırken iki foton görüntüsünde mikro pipetin konumunu ortaya çıkarabilir.Ardından mikropipetteki basıncı serbest bırakın ve tüm hücre patch clamp konfigürasyonunu elde edin. Akım klembi modunda, kullanılabilir bir kayıt eksi 50 ila eksi 55 milivolt arasında bir membran potansiyeli vermeli ve en az 20 dakika sürmelidir. Bundan sonra, bir bilgisayar monitöründe oluşturulan görsel uyarıcıları sunun.Işın yoluna nötr yoğunluk filtreleri yerleştirerek uyarı şiddetini ayarlayın ve uyarımın mekansal konumunu kaydedilen hücrenin merkezine göre düzenleyin. Ardından, uyarım protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Kayıt yazılımını tetiklemek için uyarı oluşturucuyu kullanın.Uyaran zamanlamasının kaydını tutmak için ışın yolu üzerine bir fotodiyot yerleştirin. Mikro pipeti geri çekerken hücre gövdesini yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Boya dolumu tamamlandığında, floresan ajanın kaydedilen hücreye 30 ila 45 dakika boyunca difüze olmasını bekleyin.Burada, promoterları altında GFP eksprese eden hücrelerin bir retinal düz montaj örneği yer almaktadır. Tirozin hidroksilaz için, GFP sinyalinin parlaklığına göre iki popülasyon ayırt edilebilir. Şekil A'daki ok başları ile gösterildiği üzere, interpleksiform tabakada yer alan tip bir dopaminerjik hücreler zayıf floresans eksprese eder. Tip iki hücreler yoğun şekilde işaretlenmiştir ve hücre gövdeleri ya Şekil A'daki oklarla gösterildiği gibi ilgili tabakada ya da Şekil B'de gösterildiği gibi ganglion hücre tabakasında yer değiştirmiş haldedir; Şekil C, tip iki hücrelerin iç pleksiform tabakanın üçüncü stratumundaki dendritik stratifikasyonunu göstermektedir; burada, izleyici neurobiotin enjekte edilmiş bir tip iki hücrenin morfolojisine bir örnek sunulmuştur.İzleyici, burada macenta renginde gösterilen floresan işaretli streptavidine bağlanarak daha sonra görselleştirilmiştir. Burada, ganglion hücre tabakasında yer alan tip iki bir hücrenin beyaz ışığa karşı farklı yanıt modelleri yer almaktadır. Bu prosedürün ardından; uyarım anındaki, başlangıcındaki ve bitişindeki yanıt bileşenlerinin daha iyi ayırt edilebilmesi için üç saniyelik uzun süreli bir uyarım kullanılmıştır.Retinadaki belirli bir hücre tipinin devre üzerindeki fonksiyonel rolü gibi ek soruları yanıtlamak için farmakolojik deneyler, kalsiyum görüntüleme veya immünokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Video, bir tam hücre yama akım kelepçesi kullanarak floresan proteini eksprese eden nöronal hücrelerin uyarılabilirliğini incelemek için bir yöntemi göstermektedir. Akım kelepçesi modunda, nöronal uyarılabilirliği gösteren aksiyon potansiyelleri üretilir.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kullanarak Floresan Nöronların Uyarılabilirliğinin İncelenmesi

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Bu protokol, sinir sistemi gelişimi sırasında H 2 O2'ninfizyolojik sinyal rollerini değerlendirmek için kültürlü zebra balığı nöronlarında ve larvalarında genetik olarak kodlanmış bir hidrojen peroksit (H 2 O2)-biyosensör kullanımını açıklar. Farklı hücre tiplerine uygulanabilir ve genel gelişimde reaktif oksijen türlerini (ROS) incelemek için deneysel tedavilerle değiştirilebilir.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Öğrenin, iki fotonlu kızılötesi uyarım ve yama kelepçesi kullanarak bozulmamış fare retinasında GFP ifadeli nöronların ışık yanıtlarını ve morfolojisini kaydetmeyi. Bu yöntem görsel hedefleme ile retinal fonksiyon araştırmalarını geliştirir.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Daha fazla video keşfet