Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Bu deney, asetat kinazın asetat oluşturma aktivitesinin doğrudan bir ölçümünü amaçlamaktadır. Asetil fosfat ve bir DP substratı içeren bir reaksiyon karışımına enzim ekleyerek reaksiyonu başlatın. Daha sonra kalan asetil fosfatı asetil hidroksilata dönüştürmek için hidroksi lamin hidroklorür ekleyin.

Asetil hidroksilatı ölçülebilen renkli bir ferrik hidroksilat kompleksine dönüştürmek için geliştirme çözeltisi ekleyin. Reaksiyon sonuçlarında tüketilen asetil fosfat substrat miktarına dayalı fotometrik spektro, enzim kinetik parametrelerinin belirlenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre avantajı, bir TP üretiminin bir A DP'nin indirgenmesine bağlanmasından ziyade asetil fosfat tüketiminin doğrudan ölçülmesine dayanmasıdır. Bu tahlil bir TP üretimine dayanmadığından, bir TP yerine güç fosfat üreten yeni bir asetat kinaz grubu için kullanılabilir Altı ila sekiz noktalı standart bir eğri için, asetil fosfat stok çözeltisini 100 milimolar triss içinde 300 mikrolitrelik bir nihai numune hacmine seyreltin, ayrıca asetil fosfat içermeyen bir kontrol numunesi içerir, tüm numuneleri 37 santigrat derece ısı bloğunda dengeleyin. Bir dakika.

Şimdi, 50 mikrolitre iki molar hidroksi lamin hidroklorür ekleyin, üç kez çalkalayarak karıştırın ve 60 santigrat derece ısı bloğunda beş dakika inkübe edin. Daha sonra 100 mikrolitre geliştirme solüsyonu karışımını üç kez çalkalayarak ekleyin ve oda sıcaklığında en az bir dakika rengin gelişmesine izin verin. Spektrofotometre için plastik küvetler kullanarak numuneleri santrifüjleyin.

Numuneleri 540 nanometrede ölçün. Uygun veri analizi ve grafik yazılımı ile asetil fosfat mikromollerine karşı 540 nanometrede standart bir emilim eğrisi oluşturmaya devam edin. r'nin kare değerini hesaplayın.

Mikro santrifüj tüplerine 300 mikrolitrelik reaksiyon karışımı dağıtın. 37 santigrat derecede bir dakika boyunca enzim dengeleme tüpleri içermeyen bir kontrol reaksiyonu eklemeyi unutmayın. Birkaç reaksiyon gerçekleştirilirse, tüplere belirli zaman aralıklarında enzim ekleyin ve her tüpü hemen 37 santigrat derece ısı bloğuna geri döndürün.

Beş dakika sonra, 50 mikrolitre iki molar hidroksi lamin hidroklorür ekleyin, karıştırın ve 60 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Daha sonra 100 mikrolitre geliştirme solüsyonu ekleyin, karıştırın ve renk gelişimi için oda sıcaklığına yerleştirin. Daha sonra numuneleri bir dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin.

540 nanometrede absorbansı ölçmeye devam edin. Asetil fosfat standart eğrisi ile karşılaştırarak mevcut asetil fosfat miktarını belirleyin. Veriler, kinetik parametrelerin belirlenmesi için çizilebilir ve McKayla Cementin denklemine uygun hale getirilebilir.

Bu tahlil, asetat oluşumu yönünde asetat kinaz aktivitesini ölçmek için asetil fosfat substratının tüketimini belirler. Enzimatik reaksiyon sırasında belirli bir süre sonra kalan asetil fosfat, asetil Oksibat'a ve ardından 540 nanometrede ölçülebilen kırmızımsı bir renge sahip ferrik hidroksi at kompleksine dönüştürülür. Mikromol asetil fosfata karşı 540 nanometrede absorbans çizen bu tipik standart eğri, mikromol asetil fosfat başına 1.2332 absorbans birimi eğime sahiptir.

Elde edilen 0,99'luk r kare değeri, verilerin burada gösterildiği gibi doğrusal denkleme iyi uyduğunu gösterir. Bu tahlil, çeşitli enzim preparatları için asetil fosfat için KM'yi belirlemek için kullanılabilir. Metanolden saflaştırılmış rekombinant asetat kinaz olan değişen konsantrasyonlarda asetil fosfat içeren beş milimolar bir DP'de, Sarina termofilik, her substrat için standart McKayla sementin benzeri kinetiği takip eder ve bu da 0.27 artı veya eksi 0.01 milimolar asetil fosfat belirgin bir KM ile sonuçlanır.

Standart birleştirilmiş tahlilden farklı olarak, bu doğrudan tahlil, bir TP dışındaki substratları kullanan asetat kinazların aktivitesini ölçebilir. Örneğin, asetil fosfatın pirofosfat üreten inba histolitica asetat kinaz tarafından kullanılmasında, reaksiyon karışımında bir DP yerine sodyum fosfat ikame edildi. Ortaya çıkan eğri, 0.50 artı veya eksi 0.006 milimolar asetil fosfatın görünür bir KM değerini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, tüketilen asetil fosfat miktarını belirleyerek asetat kinaz aktivitesini doğrudan nasıl ölçeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede önemli bir faktör, her adımda, özellikle enzim eklemede ve karıştırma adımında tutarlı olmaktır.