Name: Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Öğrenin, asetat kinaz aktivitesini doğrudan ölçmek için spektrofotometrik bir yöntem kullanarak asetil fosfat tüketimini belirleyin. Bu teknik, enzim kinetiği parametrelerini doğru şekilde hesaplamanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NSF ödül # 0920274 ve Güney Carolina Deney İstasyonu Projesi (SC-1.700.340) KSS tarafından desteklenen oldu. Bu makale, Clemson Üniversitesi Experiment Station 5929 Teknik Katkı No.

Bu protokolün genel şeması Şekil 1'de özetlenmiştir. 1. Standart Eğriler ve Tahliller Çözüm Hazırlığı <ol><li> Hidroksilamin-HCl 2 mol / L çözelti 100 mL hazırlayın. Hidroksilamin hidroklorür 13,9 g (MW 69.49 g / mol) tartılır ve yaklaşık 50 ml distile deiyonize su (GKD 2 O) içinde çözülür. Potasyum hidroksit pelet veya konsantre bir çözüm kullanarak 7.0 pH ayarlayın. Son hacim 100 mL 'ye getirin. Çözüm 30 gün kadar ya da 4 ° C'de 90 gün öncesine kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> 100 mL demir klorür / hidroklorik asit solüsyonu hazırlayın. 13.5 gr ferrik klorür (MW 270,32 g / mol) tartılır ve yaklaşık 50 ml GKD 2 O içinde çözülür 41.3 ml konsantre hidroklorik asit (12.1 mol / L) ekleyin ve bir son hacim 100 mL getirmek. Ferrik klorür son konsantrasyonu 0,5 mol / L ve hidroklorik asit konsantrasyonu son 5 mol olacak olacak/ L. Çözüm oda sıcaklığında saklanır. </li><li> Trichoroacetic asit 1.84 mol / L çözelti 100 ml hazırlayın. Trikloroasetik asit (MW 163,39 g / mol) 30.0 gr tartılır, GKD 2 O içinde çözülür ve son hacim 100 mL getirmek. Çözüm oda sıcaklığında saklanır. </li><li> 5 ml 0.1 mol / L asetil fosfat çözüm hazırlayın. Tartılır, 0,092 gr asetil fosfat (MW 184,06 g / mol) GKD 2 O içinde çözülür ve son hacim 5 ml getirmek. Kısım mikrosantrifüj tüpler (tüp başına 0.25 ml) çözüm ve kullanıma kadar -20 ° C'de dondurma. Çözülmüş bir çözüm buz konulmalıdır ve yaklaşık 1 saat için de kullanılabilir. Çözülmüş oldu Asetil fosfat çözüm refrozen ve yeniden kullanılan olmamalıdır. </li><li> ADP 0.1 mol / L çözelti 5 ml hazırlayın. ADP 0.24 g (MW 472,5 g / mol) tartılır, GKD 2 O içinde çözülür ve son hacim 5 ml getirmek. -20 Kısım mikrosantrifüj tüpler çözeltisi (tüp başına 0,5 ml) ve donma ° C 'ye kadarkullanın. Kullanana kadar buz çözülmüş çözüm tutun. </li><li> Tris, 1 mol / L çözelti 50 mL hazırlayın. 6.06 g Tris (MW 121,14 g / mol) tartılır ve 40 ml GKD 2 O. içinde çözülür Çözeltinin pH 7.0 hidroklorik asit kullanarak ayarlayın ve son hacim 50 ml getirmek. Oda sıcaklığında saklayın çözüm. </li><li> 10 ml, 1 mol / L magnezyum klorür solüsyonu hazırlayın. 2.03 gr magnezyum klorür (MW 203,31 g / mol) tartılır, GKD 2 O içinde çözülür ve son hacim 10 ml getirmek. Çözüm oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Ferrik klorür / hidroklorik asit çözeltisi ve trikloroasetik asit çözeltisi eşit hacimlerde karıştırılması ile 25 ml geliştirme çözümü hazırlayın. Geliştirme çözümü, her gün taze olarak hazırlanır ve oda sıcaklığında muhafaza edilmelidir. </li></ol> 2. Asetil Fosfat Standart Eğrisi hazırlanması <ol><li> Asetil fosfat standart eğri bilinen miktarda asetil fosfat kullanılarak oluşturulur. Ha altı standart eğrit noktaları uygundur. Standartları 0.03 μmoles 0.9 μmoles son 0,1-3 mmol / L konsantrasyonları ile ilişkilidir başına 300 mcL, aralık 300 mcL son hacim 100 mM Tris çözüm uygun konsantrasyonlarda asetil fosfat stok solüsyonu sulandırınız. Asetil fosfat içermeyen bir kontrol örneği de hazırlıklı olmalısınız. </li><li> Her standart ve kontrol için 37 ° C ısı bloğu 1 dakika inkübe edin. </li><li> Her bir standart hidroksilamin hidroklorür çözüm ve üç kez sallayarak kontrolü ve mix 50 mcL ekleyin. Standart 60 ° C ısı bloğu içine yerleştirin ve beş dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 100 standartlarına geliştirme çözümü mcL ve kontrol, üç kez sallayarak karıştırmak ekleyin ve renk oda sıcaklığında en az bir dakika geliştirmek için olanak sağlar. </li><li> 1 dakika 18.000 xg mikrosantrifüj tüm standartları ve kontrol santrifüjleyin. </li><li> Spektrofotometrik bir örnekleri ölçünspektrofotometri için boş olarak kumanda kullanılarak, 1 ml plastik küvetler kullanılarak t 540 nm. </li><li> Uygun veri analizi ve grafik yazılımı (örn. Kaleidagraph, Sinerji Yazılım) kullanarak standart bir eğri oluşturur. R 2 değerleri 0.99 ya da daha fazla arzu edilir. Veri asetil fosfat mevcut μmoles karşı 540 nm'de absorbans olarak çizilir. </li></ol> 3. Asetat Kinaz Aktivitesi için Testi <ol><li> Açıklanan çözümlerini kullanarak, nihai konsantrasyonu 0,1 mol / L Tris tampon, 10 mmol / L magnezyum klorür, 5 mmol / L ADP ve 2 mmol / L asetil fosfat içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın. 10 ml reaksiyon karışımı 8.2 ml GKD 2 O, 1.0 ml Tris çözüm, 0.1 ml magnezyum klorür çözeltisi, 0.5 mL ADP çözüm, ve 0.2 mL asetil fosfat çözümü gerekecektir. Mikrosantrifüj tüpleri ile 300 ul alikotları reaksiyon karışımı dağıtın. Kinetik parametreleri ve optimizasyon substrat konsantrasyonlarının belirlenmesi için, bir substratçeşitli ve diğer reaksiyonlarda bir sabit konsantrasyonda düzenlenen. </li><li> 37 az 1 dakika süreyle reaksiyonlar Ön-inkübe ° C ısı bloğu. </li><li> İstediğiniz bir reaksiyon enzim miktarını ekleyin ve tüp 37 ° C ısı bloğu hemen dönün. Ayrıca, herhangi bir enzim eklenir kontrol reaksiyon içerir. Çeşitli reaksiyonlar yapılır ise, belirli zaman aralıklarında tüplerine enzim ekleyin. Zaman takip etmek için emin olun. (NOT: kullanılacak enzim miktarı asetil fosfat veya ADP substrat tükenmiş olmayacaktır sağlamak için optimize edilmiş olması gerekecektir - Tartışma bölümüne bakın) </li><li> 5 dakika sonra, her bir reaksiyon ve kontrolü, mix hidroksilamin hidroklorür çözüm 50μl ekleyin, ve tüpler 60 ° C ısı bloğu. Çeşitli reaksiyonlar yapılmaktadır enzim eklendi, bu aynı zaman aralığında olmalıdır. </li><li> 5 dakika reaksiyonlar ve kontrol inkübe, 60 ° C </li><li> 100 &amp; ekleyinizmu, her tepki ve kontrol laboratuarlarında tüp rafa, mix, yer ve geliştirme çözümü L. Renk, en az 1 dakika geliştirmek. Sağlayın </li><li> 1 dakika 18.000 xg mikrosantrifüj bütün tüpler santrifüjleyin. </li><li> Ölçü örnekleri 1mL plastik küvetler kullanılarak 540 nm'de spektrofotometrik ve asetil fosfat standart eğri ile karşılaştırıldığında, asetil fosfat mevcut miktarını belirlemek. </li><li> Tükenmiş asetil fosfat substratı miktar kontrolü enzim eksikliği bulunan asetil fosfat miktarı enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat miktarı çıkarılarak tespit edilebilir. Uygun veri ve grafik yazılımı (örn. Kaleidagraph, Sinerji Yazılım) kullanarak veri analizi yapın. R 2 değerleri 0.97 'den daha fazla arzu edilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Bu testin amacı, doğrudan asetat kinaz aktivitesini ölçmek içinasetat oluşumu iyon. Bu asetat üretimi için hiçbir kolay, doğrudan ölçüm, asetil fosfat substratı tüketimi ölçerek yapılır. Asetil fosfat enzimatik reaksiyon sırasında belirli bir zaman sonra kalan asetil hydroxamate ve daha sonra 540 nm dalga boyunda ölçülür (Şekil 2) kırmızımsı bir renk olan ferrik hydroxamate kompleksi, dönüştürülür. Standartlarda μmoles asetil fosfat mevcut komplo karşı absorbans standart eğri Her reaksiyon kalan asetil fosfat miktarını belirlemek için kullanılır. Standart eğri sıfır noktası üzerinden doğrusal olmalıdır. Şekil 3'te gösterildiği bir temsilci standart eğrisi verileri de lineer denklem uygun belirten μmole asetil fosfat bugünü ve R 2 değeri 0.99 başına 1,2332 absorbans birimi bir eğime sahiptir. Lineer oturması için standart eğri veri denklemi reaksiyon kalan asetil fosfat miktarını hesaplamak için kullanılır. Μmolestüketilen asetil fosfat kontrol reaksiyon enzim ve enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat μmoles yoksun bulunan asetil fosfat μmoles arasındaki fark olarak belirlenir. Saflaştırılmış, rekombinant M. thermophila asetat kinaz açıklanan protokolü kullanılarak analiz edildi. Şekil 4'te gösterildiği deney için 5 mmol / L, ADP konsantrasyonu sabit tutulur ve reaksiyon asetil fosfat konsantrasyonu asetil fosfat için K m belirlemek için farklı oldu. Beklendiği gibi, bu deney her substrat enzim için standart Michaelis-Menten gibi kinetiği takip eder ve hiperbolik bir doyma eğrisi asetil fosfat konsantrasyonu karşı komplo faaliyet göstermektedir. Asetil fosfat için görünür K m değeri 0.27 ± 0.47 yayınlanan K m değeri ile karşılaştırıldığında olumlu 0.01 mmol / L ± akuple olarak kullanarak 0.01 mmol / L13 söylüyorlar. Doğrudan analiz aynı zamanda, standart birleştiğinde tahlil kullanarak mümkün değildir ATP daha başka yüzeylerde kullanmak asetat kinaz aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Rekombinant E. Saf asetat oluşturan yönde PP i yerine ATP üretir histolytica asetat kinaz 16, sodyum fosfat ADP yerine kullanarak bu testte maruz kaldı. Reaksiyon sodyum fosfat konsantrasyonu 0.2 mol / L olarak sabit tutuldu ve asetil fosfat konsantrasyonu çeşitlilik oldu. M. thermophila asetat kinaz, E. histolytica asetat kinaz asetil fosfat için Michaelis-Menten gibi kinetiği takip ve hiperbolik bir doygunluk eğri (Şekil 5) gözlendi. Asetil fosfat için görünür K m değeri 0.50 ± 0.006 mmol / L Reeves ve Guthrie 15 doğal enzim asetil fosfat için 0,06 mmol / L K m değeri tespit; hiç enzim sadece kısmen saflaştırılmış ve tahlil da sadece kısmen arıtılmış dört kaplin enzimler dahil oldu. Bu nedenle, doğrudan bu değerleri karşılaştırmak zordur. Protokol Programı <ol><li> Asetil fosfat standart eğri oluşturma </li><li> Istenen konsantrasyona enzim sulandırınız </li><li> Mikrosantrifüj tüpler için reaksiyon karışımı ve kısım 300 ul hazırlayın </li><li> 1 dakika için 37 Preincubate reaksiyonlar ° C </li><li> Reaksiyonlar, belirli zaman aralıklarında enzim ekleyerek başlatın </li><li> Reaksiyonları durdurmak ve 60 yaşında inkübe aynı aralıklarla hidroksilamin ° C 5 dakika </li><li> Ferrik klorür / renk gelişimi için trikloroasetik asit çözeltisi ekle </li><li> 1 dakika 18.000 xg tüpler Santrifüj </li><li> 540 nm dalga boyunda absorbansı ölçülür </li><li> Standart eğrisine göre tüketilen asetil fosfat miktarını belirlemek. </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/&gt; Şekil 1: Protokol Programı <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Asetil fosfat standartları . Artan konsantrasyonlarda asetil fosfat ile reaksiyona açıklandığı gibi hidroksilamin ve renk geliştirilmiştir. Asetil fosfat eksik kontrolü, parlak sarı, ve asetil fosfat artan miktarda içeren reaksiyonlar gittikçe koyu renkli. Bu renk değişimi, 540 nm dalga boyunda ölçülür. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Örnek asetil fosfat standart eğri. Asetil fosfat değişen miktarlarda hidroksilaminle tepki ve renk geliştirme çözümü ve absorbans 540 nm'de ölçüldü. Μmoles asetil fosfat karşı 540 nm'de absorbans çizilen ve veri doğrusal bir uyum uygulanmıştır./ P&gt; <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 ATP üreten M. asetil fosfat kullanımı thermophila asetat kinaz. Asetil fosfat değişen konsantrasyonları ile 5 mmol / L ADP varlığı asetat oluşumu yönünde enzimatik aktivite tespit edilmiştir. Asetil fosfat tüketilen miktar tepki asetil fosfat başlangıç ​​tutarı ve enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat miktarı arasındaki fark olarak tespit edildi. Tahliller gösterilen hata barları ile üç nüsha halinde yapılmıştır. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 PP asetil fosfat kullanımı i üreten E. histolytica asetat kinaz. Asetat oluşumu yönünde enzimatik aktivite 0 varlığı tespit edildi.Asetil fosfat konsantrasyonları değişen 2 mol / L sodyum fosfat. Asetil fosfat tüketilen miktar tepki asetil fosfat başlangıç ​​tutarı ve enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat miktarı arasındaki fark olarak tespit edildi. Tahliller gösterilen hata barları ile üç nüsha halinde yapılmıştır.

<ol><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins%2C+sugar+kinases%2C+actin%2C+and+hsp70+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li>
<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds%3A+the+hexokinase%2C+ribokinase%2C+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li>
<li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urkinase%3A+structure+of+acetate+kinase%2C+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li>
<li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+kinase%2Fheat+shock+protein+70%2Factin+superfamily%3A+implications+of+conserved+structure+for+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li>
<li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ATP-binding+fold+in+actin%2C+hexokinase+and+Hsc70%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase%3A+not+just+a+bacterial+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li>
<li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li>
<li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+sequence+analysis%2C+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li>
<li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li>
<li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+transition+state+analog%2C+MgADP-aluminum+fluoride-acetate%2C+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li>
<li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li>
<li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase+%28pyrophosphate%29.+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li>
<li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li>
<li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li>
<li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li>
<li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+phosphorylation+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li>
<li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li>
<li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity%3A+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li>
<li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu testte asetil fosfat algılama hidroksilamin hidroklorür yeterli konsantrasyon ve ferrik klorür çözeltisi konsantrasyonu ve asit bağlıdır. Bu bileşenlerin her iki testin hacmi değişiklik yeniden gözden geçirilmesini gerektirebilir. Enzimatik reaksiyonları burada açıklanan 37 ° yapıldı ° C, 5 dakika 60 ° C hidroksilamin sonlandırma. Bu yüksek sıcaklık asetil hydroxamate kalan asetil fosfat hızlı dönüşüm için izin verecek kritik öneme sahiptir. Absorbans renk geliştirme adım ve ölçüm zamanlaması daha az kritik olduğunu ...

<table border="1"><tr><td width="160"> Reaktifi Adı </td><td width="108"> Şirket </td><td width="134"> Katalog numarası </td><td width="103"> Yorumlar </td></tr><tr><td> Asetil fosfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 01409 </td><td> Lityum tuz (% 97) </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat tekbazlı (kurutmak) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum fosfat dibazik (susuz) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum klorür (hekzahidrat) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Ferrik klorür (hekzahidrat) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Trikloroasetik asit </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroksilamin hidroklorür </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> Adenozin 5&#39;-difosfat sodyum tuzu </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate III Spektrofotometre </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> Standart UV / Vis spektrofotometre </td></tr></table>

enzim asetat kinaz asetat oluşturan faaliyet doğrudan algılama

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Asetat kinaz, asetat ve şeker kinaz-HSP70-aktin (ASKHA) enzim süperailesinin 1-5 bir üyesi, bir substrat olarak ATP kullanan asetil fosfat asetat geri dönüşümlü fosforilasyon için sorumludur. Asetat kinazlar Archaea bir cins bulundu, Bakteriler her yerde, ve aynı zamanda ökaryotlarının 6 mikroplar bulunmaktadır. En iyi karakterize asetat kinaz olduğunu metan üreten archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Sadece asetil fosfat oluşturan yönde ATP i PP yararlanmak ancak bir asetat kinaz Entamoeba histolytica, amip dizanteri etkeni izole edilmiş ve şimdiye kadar sadece bu cinsin 15,16 olmuştur. Asetil fosfat oluşum doğrultusunda, asetat kinaz aktivitesini genellikle ilk Lipmann tarafından açıklanan, hydroxamate tahlil kullanarak ölçülür.17-20, enzimler piruvat kinaz ve laktat dehidrogenaz 21,22 ADP ATP dönüşüm NAD NADH oksidasyonu birleştiğinde olduğu bir birleştiğinde tahlil + veya asetil fosfat ürün reaksiyon sonra inorganik fosfatın serbest ölçen bir test hidroksilamin 23. Etkinlik tam tersi, asetat oluşturan yönü ADP NADP azaltılması + enzimler heksokinaz ve glukoz 6-fosfat dehidrogenaz 24 NADPH, ATP oluşumu birleştirilmesi ile ölçülür . Burada kaplin enzimler gerektirmez asetat oluşumu yönünde asetat kinaz aktivitesinin tespiti için bir yöntem tarif, ama onun yerine asetil fosfat tüketimi doğrudan belirlenmesi üzerine dayanır. Enzimatik reaksiyon sonra, kalan asetil fosfat hydroxamate tayini için spektrofotometrik olarak ölçülmüş olabilir ferrik hydroxamate karmaşık dönüştürülür. Böylece, I. aksineADP ATP üretimine bağımlı bu yönde andard birleştiğinde tahlil, doğrudan bu testi ATP veya PP i üretmek asetat kinazlar için kullanılabilir.

Asetat kinaz aktivitesinin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu testte, asetat oluşturan yönde asetat kinaz enzim aktivitesi ve kinetiği farklı fosforilasyonunu alıcıları belirlemek için doğrudan bir tepki kullanır. Ayrıca, bu yöntem diğer asetil fosfat ya da asetil-CoA kullanan enzimler assaying için kullanılabilir.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Asetat ve şeker kinaz-Hsp70-aktin (ASKHA) enzim süperailesinin1-5 bir üyesi olan asetat kinaz, ...'nın tersinir fosforilasyonundan sorumludur.

Bu deney, asetat kinazın asetat oluşturma aktivitesinin doğrudan ölçülmesini amaçlamaktadır. Enzimi, asetil fosfat ve DP substratları içeren bir reaksiyon karışımına ekleyerek reaksiyonu başlatın. Ardından, geri kalan asetil fosfatı asetil hidroksilata dönüştürmek için hidroksilamin hidroklorür ekleyin.Asetil hidroksilatı, ölçülebilir renkli bir ferrik hidroksilat kompleksine dönüştürmek için geliştirme çözeltisi ekleyin. Reaksiyonda tüketilen asetil fosfat substrat miktarına dayalı spektrofotometrik sonuçlar, enzim kinetik parametrelerinin belirlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre avantajı, ATP üretiminin ADP redüksiyonuna eşlenmesi yerine, doğrudan asetil fosfat tüketiminin ölçülmesine dayanmasıdır. Bu analiz ATP üretimine dayanmadığı için, ATP yerine inorganik fosfat üreten yeni bir asetat kinaz grubu için kullanılabilir. Altı ila sekiz noktalı bir standart eğri için, asetil fosfat stok çözeltisini 100 millimolar Tris içinde 300 µL son numune hacmine kadar seyreltin; ayrıca asetil fosfat içermeyen bir kontrol numunesi de ekleyin. Tüm numuneleri 37 °C'lik bir ısıtıcı blokta bir dakika boyunca dengeleyin.Şimdi, 50 µL 2 M hidroksilamin hidroklorür ekleyin, üç

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, proteinlerin sirtuinler için spesifik deasetilasyon substratları olarak rolünü belirlemek ve translasyon sonrası bir modifikasyon olarak tersinir - lizin asetilasyonunun rolünü daha fazla incelemek için in vitro ve in vivo deasetilasyon testlerini yürütmek için gerekli adımları açıklar.

Deasilasyon Tahliller Sirtuins arasında karşılıklı etkileşim (SIRT2) ve Özgül Protein yüzeylerde Unravel için

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Genetik kod genişleme biyolojik süreçler, protein asetilasyon dahil olmak üzere geniş bir çalışma için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Burada biz homojen oluşturmak için bu teknik yararlanma facile bir protokol proteinler, Escherichia coli hücreleri belirli sitelerdeki acetylated göstermek.

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Bu yazıda, neotropikal anuran türlerinde biyobelirteçlerin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış ekotoksikolojik yöntemler sunulmuştur. Spesifik olarak, bu makale genetik, hücresel-histolojik, biyokimyasal, morfolojik ve bireysel seviyeler gibi farklı ekotoksikolojik değerlendirme ölçeklerinde çeşitli metodolojileri detaylandırmaktadır.

Neotropik Anuranlarda Biyobelirteçleri Farklı Ölçeklerde Değerlendirmek için Ekotoksikolojik Metodolojiler

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Öğrenin, asetat kinaz aktivitesini doğrudan ölçmek için spektrofotometrik bir yöntem kullanarak asetil fosfat tüketimini belirleyin. Bu teknik, enzim kinetiği parametrelerini doğru şekilde hesaplamanıza olanak tanır.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Daha fazla video keşfet