Kalmodulin bağlayıcı Proteinler, Pull-down

Bu prosedürün genel amacı, Cal Modlin'e kalsiyum bağımlı bir şekilde bağlanan proteinleri test etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen proteinlerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, protein bağlanması için kalmodulin sero hızları hazırlanır.

Ardından proteinler, kalmodulin sero hızları ile inkübe edilir. Son olarak, kalsiyuma bağımlı şekilde bağlanan proteinler belirlenir. Nihayetinde, western blot analizi yoluyla kalsiyum varlığında veya yokluğunda kalmoduline bağlanan proteinleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, kalsiyum kromatografisi ve immünopresipitasyon gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, daha az protein ve daha az zaman gerektirmesidir. Bu yöntem, kalsiyuma bağımlı şekilde cow modlin'e hangi proteinlerin bağlandığı ve translasyon sonrası modifikasyonların cow modlin'e bağlanmalarını nasıl etkileyebileceği gibi, cow modlin sinyal yol alanı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Boncukların kullanım aşamaları çok önemli olduğundan ve boncukların süspansiyon haline getirilmesi ve tutulmasının açıklaması görmeden takip edilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir.

Homojen enjeksiyonlu organotipik hipokampal dilimleri, ilgilenilen rekombinant proteini eksprese eden bir plazmid içeren bir virüs ile hazırlamak için. Bu örnekte rekombinant protein, GFP etiketli Neuro Grandin'dir. Viral enjeksiyondan sonra proteinin eksprese olması için dokuya yaklaşık 12 ila 18 saat boyunca gece boyunca süre tanıyın, bir Petri kabına bir mililitre diseksiyon tamponu ekleyin.

Kültürlenmiş dokuyu insert ile birlikte Petri kabına aktarın ve dokuyu tamamen batırmak için bir skalpel yardımıyla insertin içine iki mililitre diseksiyon tamponu ekleyin. İnvert bir pastör pipeti kullanarak dokuyu insert membranından nazikçe sıyırarak beş ila 10 adet organotipik hipokampal doku kesiti toplayın. Süspansiyondaki dokuyu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, örnekleri 1500 RCF'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Dokuyu diseksiyon tamponundan ayırmak için süpernatanı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Peletin dağılmamasına özen gösterin.

Kullanılan her bir kesit için, dokuyu ucu kesilmiş bir mililitrelik pipet yardımıyla 30 ila 60 µL homogenizasyon tamponuna ekleyin ve ardından homogenatı orijinal tüpüne geri aktarmadan önce bir havan eli kullanarak iyice homogenize edin. Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için, kalan homogenatı 1100 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve peletten kontaminasyonu önleyerek süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice toplayın. Giriş örneği olarak süpernatantın %10'unu alikotlayın.

cal sero boncuklarının kullanıma hazırlanması sırasında kalan süpernatantı buz üzerinde saklayın. Daha sonra, her bir çöktürme (pull down) işlemi için, inkübasyonlar sırasında yüzey alanını ve çözeltilerin boncuklarla etkileşimini maksimize etmek amacıyla nispeten düz tabanlı iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 400 microliters süspanse cal Modlin Sero boncukları pipetleyin, boncukları ıslatmak için mikro santrifüj tüpünü yan tarafına doğru döndürün ve ardından boncukları 21, 000 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı aspirasyonla dikkatlice uzaklaştırın. Boncukları rahatsız etmediğinizden emin olarak, kalsiyum kalmodulin bağlayan proteinleri çöktürmek için kullanılan boncuklar için 2 mM kalsiyum klorür veya apo kalmodulin bağlayan proteinleri çöktürmek için kullanılan boncuklar için bilinen bir kalsiyum şelatörü olan 2 mM EDTA içeren ilgili homojenizasyon tamponunun 100 µL'si ile boncukları yıkayın.

Boncukları yeniden süspansiyon haline getirmek için tüpe hafifçe vurun. Boncukları süspansiyon halinde tutun ve 1500 RCF'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Proteinleri çöktürme (pull down) işlemi için kalmodulin sferoslarına bağlamak amacıyla, boncukları yerinden oynatmamaya dikkat ederek süpernatanı aspirasyonla dikkatlice uzaklaştırın.

İşe, SNAT'ı iki eşit hacme bölerek başlayın. Alikot başına belirlenen koşula göre, süpernatanta uygun miktarda kalsiyum klorür veya EDTA ekleyerek nihai konsantrasyonu iki millimolar yapın. Süpernatantı, uygun homojenizasyon tamponu içindeki yıkanmış boncuklara ekleyin.

Karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. Numuneleri bir çalkalayıcı üzerinde, dört derece santigrat sıcaklıkta üç saat boyunca inkübe edin. Bağlanma verimliliğini artırmak için boncukları her 30 dakikada bir süspande ediyoruz.

Ardından, örnekleri 1500 RC F'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Bağlanmamış protein örneği olarak 50 microliters süpernatant alın ve geri kalan süpernatantı aspirasyonla dikkatlice uzaklaştırıp atın. Boncukları, daha önce olduğu gibi uygun homojenizasyon tamponuyla 100 microliters kullanarak üç kez yıkayın.

Bu prosedürdeki en zor adım, hedef proteinlerin verimli bir şekilde elüe edilmesidir. Başarıyı sağlamanın en iyi yolu, boncuk kaybını en aza indirmek için doğru tüp tipini kullanmak ve boncukları önceden ısıtılmış elüsyon tamponunda uygun şekilde yeniden süspande etmektir. Elüsyon tamponunun önceden ısıtılması da proteinin elüsyonuna önemli ölçüde yardımcı olabilir; boncukların üzerine 50 µL elüsyon tamponu ekleyiniz.

Kalsiyum içeren tamponda homojenize edilen ve bağlanan örnekler, EDTA içeren tamponla; EDTA içeren tampona sahip örnekler ise kalsiyum ile seyreltilmiştir. Boncukları, bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Yaklaşık her beş dakikada bir tüpe hafifçe vurarak boncukları karıştırın.

Boncukları 1500 RCF'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve bağlanmış protein örneği için 50 µL SNAT'ı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Boncukları rahatlatmadığınızdan emin olun. Karşıt koşulda pozitif kontrol olarak ilgili proteinin tanımlanması için SDS-PAGE ve western blotting işlemlerini gerçekleştirin.

Prop Pro proteinin Cal Modlin ile bağlandığı bilinmektedir. Bu şekil, GFP TAG Neuro Grandin ile endojen neuro Grandin'in Cal MODLIN bağlanmasını test eden bir Cal Modlin pull-down deneyi örneğini göstermektedir. Homojen giriş, endojen neuro Grandin'in bilinen bağlanmasına dayanarak beklendiği üzere, endojen neuro grandin ve kalsiyum kalmodulin bağımlı kinaz ikiye ek olarak GFP neuro Grandin'in de eksprese edildiğini göstermektedir.

GFP etiketli Neuro Grandin, kalsiyum yokluğunda elüye edilmiş ve kalsiyum varlığında bağlanmamıştır. Buna karşılık, kontrol grubu olan kalsiyum kalmodulin bağımlı kinaz iki, yalnızca kalsiyum varlığında elüye edilmiş ve yokluğunda bağlanmamıştır. Bu durum, kalmodulin boncuklarının düzgün çalıştığını ve EEU'ların etkili olduğunu göstermektedir.

En önemlisi bu durum, GFP nörogirinle işaretlenmiş proteinin Apoch Cal Modlin'e endojen formla benzer şekilde bağlandığını göstermekte ve GFP etiketinin rekombinan proteinin fonksiyonunu değiştirmediğini ortaya koymaktadır. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, SDS page ve Western blot analizleri hariç olmak üzere, prosedür doğru şekilde uygulandığında altı saat içinde tamamlanabilir. Bu işlemi gerçekleştirirken, kalsiyum konsantrasyonundaki herhangi bir değişikliğin tüm deneyi riske atabileceği nedeniyle, tüm numunelerin ve tüplerin ilgili koşullara göre etiketlenmesinin hatırlanması önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli proteinlerin kalsiyuma bağımlı bir şekilde CAL modülüne bağlanma yeteneğinin nasıl verimli bir şekilde belirleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

İlgilenilen proteinler toplanıp uygun şekilde hazırlanmış ko-modülan SRO boncuklarıyla inkübe edilerek, bağlanan proteinler elüe edilir ve Western blot analizi kullanılarak test edilir.