Kalmodulin bağlayıcı Proteinler, Pull-down

Bu prosedürün genel amacı, Cal Modlin'e kalsiyuma bağımlı bir şekilde bağlanan proteinleri test etmektir. Bu, önce ilgilenilen proteinlerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra kalmodulin sero hızları protein bağlanması için hazırlanır.

Daha sonra proteinler kalmodulin sero hızları ile inkübe edilir. Son olarak, kalsiyuma bağımlı bir şekilde bağlanan proteinler ima edilir. Sonuç olarak, batı kan analizi yoluyla kalsiyumun varlığında veya yokluğunda kalmoduline bağlanan proteinleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin sakin kromatografi ve immünoçökeltme gibi diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az protein ve daha az zaman gerektirmesidir. Bu yöntem, modlin sinyalleme alanında, hangi proteinlerin kalsiyuma bağımlı bir şekilde modlinine bağlandığı ve translasyon sonrası modifikasyonların modlinine bağlanmalarını nasıl etkileyebileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü bir boncuk işleme adımları esastır ve boncukların yeniden canlandırılması ve tutulmasının tanımının onu görmeden takip edilmesi zordur.

Homojen doku hazırlamak için, ilgilenilen rekombinant proteini ifade eden bir plazmit içeren bir virüs ile organotipik hipokampal dilimler enjekte edin. Bu örnekte, rekombinant protein GFP etiketli Neuro Grandin'dir. Viral enjeksiyondan yaklaşık 12 ila 18 saat sonra dokunun proteini gece boyunca eksprese etmesine izin verin, bir Petri kabına bir mililitre diseksiyon tamponu ekleyin.

Kültürlenmiş dokuyu insert ile Petri kabına aktarın ve dokuyu bir neşter kullanarak batırmak için inserte iki mililitre diseksiyon tamponu ekleyin. Ters çevrilmiş bir mera pipeti ile dokuyu ek zardan nazikçe kazıyarak beş ila 10 organotipik hipokampal doku dilimi toplayın. Askıya alınan dokuyu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, numuneleri 1500 RCF'de bir dakika santrifüjleyin. Dokuyu diseksiyon tamponundan ayırmak için, süpernatanı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın. Peleti rahatsız etmediğinizden emin olun.

Kullanılan her dilim için, dokuyu kesilmiş uçlu bir mililitrelik pipetle 30 ila 60 mikrolitre homojenizasyon tamponuna ekleyin ve ardından homojenatı orijinal tüpüne geri döndürmeden önce bir havaneli kullanarak iyice homojenize edin. Hücresel kalıntıları gidermek için, kalan homojenatı 1100 RCF'de 10 dakika santrifüjleyin ve peletten kontaminasyonu önlerken aspirasyon yoluyla snat'ı dikkatlice toplayın. Girdinin bir örneği olarak süpernatantın %10'unu alikot.

Cal sero boncuklarının kullanım için hazırlanması sırasında kalan süpernatanı buz üzerinde saklayın. Daha sonra, her bir aşağı çekme pipeti için 400 mikrolitre askıya alınmış kal Modlin Sero hızlarını, yüzey alanını ve inkübasyonlar sırasında çözeltilerin boncuklarla etkileşimini en üst düzeye çıkarmak için nispeten düz bir tabana sahip iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne hızlandırır, boncukları ıslatmak için mikro santrifüj tüpünü yan tarafına çevirin ve ardından boncukları 21'de santrifüjleyin, 000. 30 saniye boyunca RCF.

Ve süpernatanı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın. Boncukları, kalsiyum kal modlin bağlayıcı proteinleri aşağı çekmek için kullanılan boncuklara iki milimolar kalsiyum klorür içeren ilgili homojenizasyon tamponunun 100 mikrolitresinde yıkamak için boncukları rahatsız etmediğinizden emin olun. Veya apokal modlin bağlayıcı proteinleri aşağı çekmek için kullanılan boncuklara bilinen iki milimolar E-D-T-A-A kalsiyum şelatörü.

Resus'a hafifçe vurun. Boncukları askıya alın ve 1500 RCF'de bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyonla dikkatlice çıkarın, proteinleri aşağı çekmek için kalmodulin spheros'a bağlamak için boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin.

SNAT'ı iki eşit birime bölerek başlayın. Alikot başına duruma bağlı olarak, süpernata iki milimolar nihai konsantrasyona uygun miktarda kalsiyum klorür veya EDTA ekleyin. Süpernatanı, uygun homojenizasyon tamponunda yıkanmış boncuklara ekleyin.

Karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. Numuneleri bir çalkalayıcı üzerinde üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bağlama verimliliğini artırmak için boncukları her 30 dakikada bir askıya alıyoruz.

Daha sonra numuneleri 1500 RC F'de üç dakika santrifüjleyin. Bağlanmamış protein örneği olarak 50 mikrolitre süpernatanı çıkarın ve kalan snat'ı aspirasyon ve atma ile dikkatlice çıkarın. Boncukları daha önce olduğu gibi üç kez 100 mikrolitre uygun homojenizasyon tamponu ile yıkayın.

Bu prosedürdeki en zor adım, hedef proteinlerin verimli bir şekilde elde edilmesidir. Başarıyı sağlamanın en iyi yolu, boncuk kaybını en aza indirmek için doğru türde tüp kullanmak ve elüsyon tamponu ısıtmasında boncukları uygun şekilde yeniden süspanse etmektir. Önceden elüsyon tamponu, proteinin 50 mikrolitre elucian tamponunda boncuklara elüsyon edilmesine de önemli ölçüde yardımcı olabilir.

Homojenize edilmiş ve kalsiyum içeren tampona bağlanmış numuneler EDTA içeren tampona ve EDTA içeren tampona sahip numuneler kalsiyum ile ilişkilendirilmiştir. Boncukları bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Her beş dakikada bir tüpe hafifçe vurarak boncukları karıştırın.

Boncukları 1500 RCF'de üç dakika santrifüjleyin ve bağlı protein numunesi için 50 mikrolitre SNAT'ı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın. Boncukları rahatsız etmediğinizden emin olun. İlgilenilen proteini zıt durumda pozitif bir kontrol olarak tanımlamak için SDS sayfası ve batı blotlama yapın.

Prop Pro proteininin Cal Modlin'i bağladığı bilinmektedir. Bu şekil, endojen nöro Grandin'e kıyasla GFP TAG Neuro Grandin'in Cal MODLIN bağlanmasını test eden bir Cal Modlin aşağı çekme testinin bir örneğini göstermektedir. Homojen girdi, GFP nöro Grandin'in, endojen nöro Grandin'in bilinen bağlanmasına bağlı olarak beklendiği gibi endojen nöro grandin ve kalsiyum kalmodulin bağımlı kinaz ikisine ek olarak eksprese edildiğini göstermektedir.

GFP etiketli Neuro Grandin, kalsiyum yokluğunda ima edildi ve kalsiyum varlığında bağlanmadı. Buna karşılık, kontrol kalsiyum kalmoduline bağımlı kinaz iki, sadece kalsiyum varlığında ima edildi ve yokluğunda bağlanmadı. Bu, kalmodulin boncuklarının düzgün çalıştığını ve AEB'nin verimli olduğunu göstermektedir.

En önemlisi, bu, GFP nöro sırıtışının Apoch Cal Modlin'e endojen forma benzer şekilde bağlandığını gösterir, bu da GFP etiketinin rekombinant bir proteinin işlevini değiştirmediğini düşündürür. Bu tekniğe hakim olduktan sonra, SDS sayfası dahil değil ve Western kan analizi, düzgün bir şekilde yapıldığında altı saat içinde tamamlanabilir Bu prosedürü denerken, tüm numuneleri ve tüpleri uygun durum için etiketlemeyi unutmamak önemlidir, çünkü kalsiyum konsantrasyonundaki herhangi bir değişiklik tüm deneyi tehlikeye atabilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli proteinlerin bir CAL modülünü kalsiyuma bağımlı bir şekilde bağlama yeteneğini verimli bir şekilde nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

İlgilenilen proteinleri toplayarak, bunları uygun şekilde hazırlanmış komodülan SRO hızlarıyla inkübe ederek, bağlı proteinleri atlatarak ve bunları Batı kan analizi kullanarak test ederek.