Encapsulated Hücre Agregalar içinde Takip Hipoksik Sinyalizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, PEG kapsüllenmiş hücre agregatlarında hipoksiye hücresel yanıtı izlemektir. İlk adımda, dağılmış hücreler işaretleyici virüs ile enfekte edilir ve daha sonra agrega oluşumuna izin vermek için bir çalkalayıcı üzerinde kültürlenir. Daha sonra lineer peg işlevsel hale getirilir ve PEG DM rimer saflaştırılır.

Daha sonra hücre agregatları bir PEG DM hidrojel içinde kapsüllenir. Son olarak, hidrojeller, hipoksi belirteç sinyali için floresan olarak izlenirken çeşitli oksijen koşullarında kültürlenir. Sonuç olarak, canlı kapsüllenmiş hücre agregatları içindeki hipoksi ile indüklenebilir faktör aktivitesinin yeri ve kapsamı, basit floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.

Bu yöntem, hücre kapsülleme ve hücre bazlı terapötik dağıtım alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: 3D kültürlerde hipoksi nerede ortaya çıkar ve hücre sağkalımını ve işlevini nasıl etkiler? Bu tekniğin etkileri, hipoksi'nin agrega ve kapsüllenmiş dokulardaki büyük etkisi nedeniyle rejeneratif tıp yaklaşımlarına ve stipend diyabet gibi hormon eksikliklerinin tedavisine kadar uzanır. Hipoksi ile indüklenebilir faktör bir aktivitesinin, beta hücrelerinden büyük ölçüde azalmış insülin sekresyonu ile ilişkili olduğu, birincil delikleri ayırma ve onları yalancı deliğe dönüştürme girişimlerini motive ettiği gösterilmiştir.

Çapı azaltan agregalar. İşaretleyicimiz, herhangi bir gevşetilmiş kapsülleme materyali içinde hücresel düzeyde bir agrega ile hipoksi ile indüklenebilir faktör aktivitesini gösterebilir. PEG, uygun transfer özellikleri, sito uyumluluğu ve işlevsel olarak değiştirilebilme kolaylığı nedeniyle bir kapsül malzemesi olarak seçilmiştir.

40 mililitrelik bir cam şişede iki gram PEG'i yaklaşık 308 mikrolitre metamfetamin, akrilik, anhidrit olarak tarttıktan sonra şişeyi sert plastik bir kapakla gevşek bir şekilde kapatın. Şişeyi standart bir ev tipi mikrodalgada iki dakika yüksekte mikrodalgada pişirin. Daha sonra ısıya dayanıklı eldivenler giyin, şişeyi iyice delinin ve solüsyonu beş dakika daha yüksekte mikrodalgada pişirin.

Kısa bir süre için şişenin işlenecek kadar soğumasına izin verin ve ardından şişeyi döndürürken kapağını açın. Metilen klorürü yavaşça karıştırın, çözelti berrak ve homojen görünene kadar numuneyi gerektiği gibi girdaplayın. Daha sonra, PEG dm'yi çökeltmek için çözeltiyi damla damla 200 mililitre karıştırılmış soğuk datil etere ekleyin.

Daha sonra PEG DM'yi vakumlu filtrasyon ile toplayın ve kurumasını bekleyin. PEG DM kuruduktan sonra, yaklaşık 100 ila 150 mililitre deiyonize su içinde çözün. Daha sonra, diyalizden sonra 1000 Dalton'luk bir moleküler ağırlık kesimi ile diyaliz tüpünde beş gün boyunca deiyonize suya karşı çözeltiyi diyaliz edin.

Çözeltiyi uygun kaplara dökün ve gece boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurun. Daha sonra, hücreleri muamele edilmiş kültür şişesi yüzeyinden serbest bırakmak için saflaştırılmış bir beyaz PEG DM tozu oluşturmak için çözeltiyi dört gün boyunca liyofilize edin. İlk olarak, ortamı aspire edin, hücreleri 37 derece CELs kalsiyum, magnezyum içermeyen HBSS ile durulayın ve HBSS'yi aspire edin.

Şimdi iki mililitre 37 santigrat derece trip ve EDTA çözeltisi ekleyin ve hücrelerin üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Ardından, hücreleri şişeye orta olan sekiz mililitre 37 santigrat derecede serbest bırakmak için şişenin kenarını sıkıca sarın ve hücre süspansiyonunu kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcık sokmamaya dikkat edin.

Hücre çözeltisini steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, enfekte olacak toplam hücre sayısını belirlemek için hücreleri hemo sitometre ile sayın. 1.8 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne enfekte edilecek hücrelerin oyuğu başına 50 mikrolitre HBSS'yi içeren altı kuyulu bir süspansiyon kültür plakasının kuyucuklarına kuyu başına 400.000 hücre elde etmek için gerekli hücre süspansiyonu hacmini ekleyin. Daha sonra, hazırlanan HBSS'ye uygun miktarda virüs süspansiyonunu dikkatlice pipetleyin.

Şimdi, istenen MOI'yi elde etmek için her bir oyuğa uygun hacimde seyreltilmiş virüs ekleyin ve ardından toplam hacmi 1.7 mililitreye çıkarmak için her bir oyuğa orta ekleyin. Son olarak, plakayı bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin İnkübatörün içinde, çalkalayıcıyı yaklaşık 100 RPM gibi düşük bir ayara getirin, böylece ortam kuyu etrafında nazikçe yıkanır ve hücrelerin 24 ila 36 saat boyunca toplanmasına izin verir. Bir mililitrelik plastik şırınganın konik ucunu keserek ve hidrojelin oluşturulacağı bir kap oluşturmak için bir rafa açık bir şekilde yerleştirerek başlayın.

Ardından, 20 mikrolitre foto aktif PEG DM solüsyonunu şırınganın açık ucuna pistonun üzerine pipetleyin ve hacmin tüm piston yüzeyini kapladığından emin olun. Düz bir sıvı yüzeyi elde etmek için pistonu küçük artışlarla ayarlayın. Şimdi pipeti tekrar rafa yerleştirin ve hidrojel çapraz bağlamasına izin vermek için rafı yaklaşık sekiz dakika boyunca bir UV lambasının altına yerleştirin.

Bu süre zarfında, istenen sayıda hücre ve agrega içeren pipet hacmini 1.8 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne koyun. Tüpü kapatın ve ardından hücreleri ve agregaları 130 gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra bir mikro pipetleyici kullanarak, tüpün ucundaki hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Ortam kafası pelete yaklaşırken, daha ince bir 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın Hücre agregalarını jel öncü çözeltisi boyunca eşit şekilde dağıtırken tamamen kapsüllendiklerinden emin olun. Bu prosedürün en zor kısmı budur. Bu adımı gerçekleştirirken, peleti nazikçe yeniden zımparalamaya ve aktarmaya özen gösterin.

Şimdi, hücre peletini 20 mikrolitre foto aktif PEG DM çözeltisinde nazikçe yeniden süspanse edin. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak ve hücre süspansiyonunu çapraz bağlı hidrojel kısmının üzerine şırıngaya ekleyin, hidrojelin yapısını tamamlamak için şırıngayı sekiz dakikalık ek bir UV ışığına maruz bırakın. Bittiğinde, hücreler silindirik hidrojel içinde tamamen kapsüllenmelidir.

Son olarak, 24 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna bir mililitre HBSS ve diğerine bir mililitre ortam ekleyin. Daha sonra, jeli kısaca yıkamak için hidrojeli şırıngadan HBSS'ye çıkarın. Jeli ortama aktarın ve plakayı istenen koşullar altında kültürleyin.

Kültür sırasında herhangi bir noktada, hücreler, hipoksik sinyal yerinin, 24 oyuklu plakanın mikroskop aşamasına başlamasını izlemek için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir ve kuyuyu objektif altındaki hidrojel ile merkezleyebilir. Sinyal, tek tek sinyal hücrelerini tanımlamak için yeterince spesifiktir, ancak çözünürlük, hücre içi sinyal lokalizasyonunu belirlemek için yetersiz olabilir. Sinyal hücrelerinde, sinyal tipik olarak sitoplazma boyunca düzgün bir şekilde gözlenir.

Bu şekil, jel hücresi içinde bir PEG hidrojel içinde kapsüllenmiş minx agregalarının temsili bir örneğini göstermektedir. Agregalar, burada görüldüğü gibi daha iyi besin taşınmasına izin vermek için matris içinde tamamen kapatılmalı ve homojen bir şekilde dağıtılmalıdır. Çapraz bağ jelinin, reaksiyonun gerçekleştirildiği kabın şeklini alarak nasıl katı olduğuna dikkat edin.

Bu şekilde, bir PEG DM hidrojel içindeki toplanmış min altı hücrede temsili floresan hipoksi sinyali, kapsüllenen ve daha sonra 44 saat boyunca% 20 oksijende inkübasyona yerleştirilen hücreler gösterilmektedir. Soldaki resimde hipoksi sinyali gösterilmezken, kapsüllenen hücreler daha sonra 44 saat boyunca% 2 oksijen içinde inkübe edilir. Sağ ekranda gösterildiği gibi, her yerde net sinyal hipoksisi diğer hücre tiplerinde de izlenebilir.

Bu şekil, kapsüllenmiş mezenkimal kök hücre agregatlarında temsili hipoksik sinyallemeyi göstermektedir. En soldaki şekilde görüldüğü gibi, floresan sinyali% 2 oksijende 12 saatte tespit edilemez, daha sonra ortadaki şekilde görüldüğü gibi% 2 oksijen% 2 sonra daha belirgindir. Ve son olarak, sağda görüldüğü gibi 96 saat sonra yüksek oranda ifade edilir ve% 2 oksijen Bu prosedürü takiben.

Hipoksik sinyallemeyi hücre fenotipi ile ilişkilendirmek için Eliza, salgılanan proteinlerin analizi ve hücre canlılığı deneyleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu gelişmeyle birlikte, bu teknik, doku mühendisliği ve hücre bazlı terapötik dağıtım alanlarındaki araştırmacıların, iskeleler ve kapsülleme malzemeleri içindeki hücrelerin hayatta kalma işlevini ve farklılaşmasını keşfetmelerinin yolunu açabilir.