Encapsulated Hücre Agregalar içinde Takip Hipoksik Sinyalizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, PEG kapsüllü hücre agregatlarındaki hipoksiye karşı hücresel yanıtı izlemektir. İlk adımda, dağılmış hücreler marker virüs ile enfekte edilir ve ardından agregatların oluşmasına izin vermek için bir çalkalayıcıda kültüre edilir. Sonrasında lineer PEG fonksiyonelleştirilir ve PEG DM primer saflaştırılır.

Ardından hücre agregatları bir PEG DM hidrojeli içine enkapsüle edilir. Son olarak, hidrojeller çeşitli oksijen koşullarında kültüre edilirken hipoksi belirteç sinyali floresan yöntemle izlenir. Nihayetinde, enkapsüle edilmiş canlı hücre agregatları içindeki hipoksiyle indüklenebilir faktör aktivitesinin konumu ve kapsamı basit floresan mikroskobu aracılığıyla görselleştirilebilir.

Bu yöntem, hücre enkapsülasyonu ve hücre tabanlı terapötik iletim alanlarındaki; 3B kültürlerin neresinde hipoksi oluşur ve bu durum hücre sağkalımı ile fonksiyonunu nasıl etkiler gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hipoksinin agregate ve enkapsüle dokular üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, bu tekniğin doğurguları rejeneratif tıp yaklaşımlarına ve diyabet gibi hormon eksikliklerinin tedavisine kadar uzanmaktadır. Hipoksiyle indüklenebilir faktör 1 aktivitesinin, beta hücrelerinden salgılanan insülin miktarındaki belirgin azalma ile ilişkili olduğu gösterilmiştir; bu durum, primer adacıkları ayrıştırma ve onları psödo-adacıklara dönüştürme girişimlerini teşvik etmiştir.

Azalmış çaplı agregatlar. Markörümüz, herhangi bir gevşemiş kapsülleme materyali içindeki hücresel düzeydeki agregatlar ile hipoksiyle indüklenebilir faktör aktivitesini belirtebilir. PEG; uygun transfer özellikleri, sitouyumlu olması ve fonksiyonel olarak kolayca modifiye edilebilmesi nedeniyle kapsül materyali olarak seçilmiştir.

40 mililitrelik bir cam viyale iki gram PEG tarttıktan sonra yaklaşık 308 mikrolitre metakrilik anhidrit ekleyin ve viyali sert plastik bir kapakla gevşekçe kapatın. Viyali standart bir ev tipi mikrodalga fırında yüksek ayarda iki dakika boyunca ısıtın. Ardından, ısıya dayanıklı eldivenler giyerek viyali iyice vorteksleyin ve çözeltiyi yüksek ayarda beş dakika daha mikrodalga fırında ısıtın.

Viyalin elle tutulabilecek kadar soğuması için kısa bir süre bekleyin ve ardından viyali dairesel hareketlerle sallayarak kapağını açın. Çözelti berrak ve homojen görünene kadar, gerektiğinde numuneyi vorteksleyerek, metilen klorürü yavaşça karıştırın. Daha sonra, PEG dm'yi çöktürmek için çözeltiyi, karıştırılan 200 mililitre soğuk datil etere damla damla ekleyin.

Ardından PEG DM'yi vakumlu filtrasyon ile toplayın ve kurumaya bırakın. PEG DM kuruduktan sonra, yaklaşık 100 ila 150 mililitre deiyonize su içerisinde çözün. Daha sonra çözeltiyi, moleküler ağırlık kesme sınırı 1000 Dalton olan bir diyaliz tüpü kullanarak beş gün boyunca deiyonize suya karşı diyalize edin.

Çözeltiyi uygun kaplara aktarın ve gece boyunca -80 °C'de dondurun. Ardından, hücreleri işlem görmüş kültür flask yüzeyinden ayırmak için kullanılacak saflaştırılmış beyaz PEG DM tozu elde etmek amacıyla çözeltiyi dört gün boyunca liyofilize edin. İlk olarak besiyerini aspire edin, hücreleri 37 °C'deki kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile durulayın ve HBSS'yi aspire edin.

Şimdi iki mililitre 37 °C'ye ısıtılmış tripsin ve EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücrelerin serbest kalmasını sağlamak için erlenmeyin yan tarafına sertçe vurun; erlenmeye sekiz mililitre 37 °C'de besiyeri ekleyin ve hücre süspansiyonunu pipetle kuvvetlice aşağı yukarı çekin. Bu işlem sırasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Hücre solüsyonu steril bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarıldıktan sonra, enfekte edilecek toplam hücre sayısını belirlemek için hücreleri hemositometre ile sayın. Altı kuyucuklu bir süspansiyon kültür plağının kuyucuklarına, kuyucuk başına 400, 000 hücreye ulaşacak şekilde gerekli hacimde hücre süspansiyonu ekleyin; enfekte edilecek hücrelerin bulunduğu kuyucuklardan 50 microliters HBSS'yi 1.8 milliliter mikro santrifüj tüpüne alın. Ardından, uygun miktardaki virüs süspansiyonunu hazırlanan HBSS içerisine dikkatlice pipetleyin.

Şimdi, istenen MOI değerini elde etmek için her kuyucuğa uygun hacimde seyreltilmiş virüs ekleyin ve ardından toplam hacmi 1,7 mililitreye tamamlamak için her kuyucuğa besiyeri ekleyin. Son olarak, plakayı inkübatör içindeki bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin; besiyerinin kuyucuk içinde hafifçe yıkanmasını sağlamak için çalkalayıcıyı yaklaşık 100 RPM gibi düşük bir ayara getirin ve hücrelerin 24 ila 36 saat boyunca agregasyon yapmasına izin verin. Bir mililitrelik plastik bir şırınganın konik ucunu keserek ve hidrojelin oluşturulacağı bir kap yaratmak için açık ucu yukarı gelecek şekilde bir rafa yerleştirerek işleme başlayın.

Ardından, hacmin tüm piston yüzeyini kapladığından emin olarak, fotoaktif PEG DM çözeltisinin 20 µL'sini şırınganın açık ucundan pistonun üzerine pipetleyin. Düz bir sıvı yüzeyi elde etmek için pistonu küçük artışlarla ayarlayın. Şimdi pipeti tekrar rafına yerleştirin ve hidrojelin çapraz bağlanmasını sağlamak için rafı yaklaşık sekiz dakika boyunca bir UV lambasının altına konumlandırın.

Bu süre zarfında, istenen sayıda hücre ve agregatı içeren hacmi 1,8 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin. Tüpü kapatın ve ardından hücreler ile agregatları 130 gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, bir mikro pipet kullanarak, tüpün ucundaki hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın.

Medya başı pelete yaklaştığında, hücre agregatlarını jel öncül çözeltisi boyunca eşit şekilde dağıtarak tamamen kapsüllenmelerini sağlamak için daha ince bir 10 µL pipet ucu kullanın. Bu, prosedürün en zor kısmıdır. Bu adımı gerçekleştirirken, peleti nazikçe yeniden askıya almaya ve transfer etmeye dikkat edin.

Şimdi, hücre peletini 20 µL fotoaktif PEG DM çözeltisi içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak hücre süspansiyonunu şırıngadaki çapraz bağlı hidrojel kısmının üzerine ekleyin ve hidrojel yapımını tamamlamak için şırıngayı sekiz dakika daha UV ışığına maruz bırakın. İşlem tamamlandığında, hücreler silindirik hidrojel içinde tamamen kapsüllenmiş olmalıdır.

Son olarak, 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 1 mL HBSS ve diğerine 1 mL besiyeri ekleyin. Ardından, jeli kısaca yıkamak için hidrojeli şırıngadan HBSS içerisine boşaltın. Jeli besiyerine aktarın ve plakayı istenen koşullar altında kültüre edin.

Kültür süresince herhangi bir aşamada, hipoksik sinyalizasyonun başlangıcını takip etmek için hücreler floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir; bunun için 24 kuyucuklu plaka mikroskop tablasına yerleştirilir ve hidrojelli kuyucuk objektifin altına ortalanır. Sinyal, tekil sinyalizasyon hücrelerini tanımlayacak kadar spesifiktir, ancak hücre içi sinyal lokalizasyonunu belirlemek için çözünürlük yetersiz kalabilir. Sinyalizasyon hücrelerinde sinyal, genellikle sitoplazma boyunca homojen olarak gözlemlenir.

Bu şekil, jel hücre içindeki bir PEG hidrojeline kapsüllenmiş minx agregatlarının temsili bir örneğini göstermektedir. Burada görüldüğü gibi, besin taşınımının daha iyi sağlanabilmesi için agregatlar matris içinde tamamen kapalı ve homojen bir şekilde dağılmış olmalıdır. Çapraz bağlı jelin, reaksiyonun gerçekleştirildiği kabın şeklini alarak her yerinde katı olduğuna dikkat edin.

Bu şekilde, bir PEG DM hidrojelinde agregat halindeki min six hücrelerinde temsilci floresan hipoksi sinyalleri gösterilmektedir; hücreler enkapsüle edilmiş ve ardından 44 saat boyunca %20 oksijen ortamında inkübe edilmiştir. Soldaki görselde hipoksi sinyali görülmezken, enkapsüle edildikten sonra 44 saat boyunca %2 oksijen ortamında inkübe edilen hücreler sağdaki görselde olduğu gibi net ve yaygın bir sinyal sergilemektedir; hipoksi diğer hücre tiplerinde de takip edilebilir.

Bu şekil, kapsüllenmiş mezenkimal kök hücre agregatlarındaki temsili hipoksik sinyali göstermektedir. En soldaki şekilde görüldüğü üzere, %2 oksijen ile 12 saatte floresan sinyali tespit edilememiş; orta şekilde görüldüğü üzere, %2 oksijen ile 24 saat sonra sinyal daha belirgin hale gelmiş ve son olarak sağdaki şekilde görüldüğü üzere, bu prosedür takip edildiğinde %2 oksijen ile 96 saat sonra yüksek düzeyde eksprese olmuştur.

Hipoksik sinyallemenin hücre fenotipi ile ilişkilendirilmesi amacıyla ELISA, salgılanan proteinlerin analizi ve hücre canlılığı deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu gelişmeyle birlikte, söz konusu teknik; doku mühendisliği ve hücre tabanlı terapötik taşıma alanlarındaki araştırmacıların, iskeleler ve enkapsülasyon materyalleri içindeki hücrelerin sağkalım fonksiyonunu ve farklılaşmasını incelemelerine yol açabilir.