Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Bu deneysel sistem, spesifik proteinlerin invazyon sürecine olan katkısını karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Hücrelerin ilgilenilen floresan protein ile retroviral transduksiyonu ile başlayın. Ayrıca, transwell insertlerde matrigel proteininden 3D matris oluşturun ve uygun dilüsyonda bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

Matrigel transwell sistemi kullanılarak, test ilaçları veya tedavileriyle birlikte kemoatraktana karşı transmigrasyon yanıtını ölçün; ardından konfokal mikroskopi ile hücre invazyonunu görüntüleyin ve analiz edin. Nihayetinde, sonuçlar üç boyutlu protein matrisine olan hücre invazyonunun büyüklüğünü ve modunu belirleyebilir. Bu tekniğin geleneksel Transwell invazyon testi gibi mevcut yöntemlere göre gücü, üç boyutlu bir protein matrisine olan hücre invazyonu hakkında hem nicel hem de nitel veriler sağlama kapasitesidir.

Çalışma arkadaşım Diane Creighton, şimdi %10 FBS içeren DMEM içerisinde retroviral paketleme hücrelerini 48 saat boyunca kültüre etme yöntemini gösterecektir. Hücreleri, üreticinin talimatlarına uygun olarak retroviral DNA ile transfect edin. 24 saat boyunca inkübe edin, kuyucukları medium ile iki kez durulayın, ardından her kuyucuğa 1,5 milliliters %10 FBS-DMEM ekleyin ve paketlenmiş Retrovirüsü toplamak için 48 saat inkübe edin.

Doku kültürü ortamını iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın, hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin ve süpernatantı temiz bir tüpe toplayın. Bu retrovirüs stokunu eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Retrotransdükte hücreler için, gece boyunca sürdürülen kültürden ortamı uzaklaştırın ve poly green ile desteklenmiş bir mililitre retrovirüs stoku ekleyin.

Altı saatlik inkübasyonun ardından, kuyucuğa iki mililitre %10 F-B-S-D-M-E-M ekleyin ve plakaları 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Gec boyunca medyumu yenileyin ve 24 saat sonra uygun seçici medyum ekleyin; hücreler konfluen hale geldiğinde hücreleri hasat edin ve transduksiyon yapılmamış hücreleri referans alarak floresan için ayıklama yapın. Transduksiyon yapılmamış hücrelerden daha yüksek floresansa sahip hücreleri toplayın ve gelecekte kullanım için alikotları -80 °C'de dondurun.

Bu yöntem, görselleştirme için floresan proteinlerin ekspresyonuna dayanır ve bireysel hücrelerin katkılarının belirlenmesine yönelik içgörüler sağlar. Matrigel'i buz üzerinde çözün ve ardından buz gibi soğuk PBS ile bire bir oranda seyreltin. Şimdi, kaplanmamış transwell'leri 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına yerleştirin.

Ardından, seyreltilmiş matri jelden 100 µL'yi dikkatlice kuyucuklara pipetleyin ve 37 °C'de katılaşmaya bırakın. Bu sırada, floresan işaretli hücre süspansiyonlarını normal büyüme ortamlarında hazırlayın. Matri jel katılaştıktan sonra transwell'leri ters çevirin ve 100 µL hücre süspansiyonunu filtrenin çıkışa bakan alt kısmına pipetleyin.

Transwell'leri, her bir hücre süspansiyonu damlasıyla temas edecek şekilde 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının tabanıyla dikkatlice kapatın. Hücrelerin yapışması için plağı ters çevrilmiş halde dört saat boyunca inkübe edin. Ardından plakları düz konuma getirin ve her bir transwell'i bir mililitre serumsuz medyuma iki kez daldırarak yıkayın.

Ardından transwell'i, herhangi bir ilaç veya tedavi reaktifleri içeren üçüncü bir kuyucuğa yerleştirin. Katılaşmış matrigel PBS karışımının üzerine, transwell içerisine kemoatraktan içeren 100 µL besiyerini nazikçe pipetleyerek ekleyin. Matrigel'e invaze olan floresan olmayan hücreleri görüntülemek için 37 °C'de, %5 karbon dioksit içeren ortamda üç ila beş gün boyunca inkübe edin.

Transwell'leri taze 24 kuyucuklu plaklara yerleştirin ve her bir Matrigel tıkaçının üzerine, yanlardan taşarak üst ve alt kısımları boyamasını sağlayacak şekilde 1 mL 4 µM kalsiyum AM çözeltisi ekleyin. %5 CO2 nemlendirilmiş atmosferde, 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından konfokal mikroskopi ile görüntüleme yapın.

Bu ilk yaşam tarzı boyama yöntemi, istila modlarının görselleştirilmesine olanak tanır. Her bir transwell'i taze bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın, üzerine 1 mL %4 paraformaldehit ve %0,2 Triton X 100 ekleyin ve oda sıcaklığında yarım saat boyunca inkübe edin. 1 mL PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, görselleştirme için 0,01 mg/mL konsantrasyonunda RNase A ekleyip 30 dakika bekletin, ardından PBS ile iki kez yıkayın.

Propidium iodide PBS ile seyreltilir ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta bekletilir. PBS ile üç kez yıkayın. Bu aşamada, propidium iodide ile boyanmış transwell'ler oda sıcaklığında, karanlıkta en az bir ay boyunca saklanabilir.

İkinci hücre boyama yöntemi fiksasyon gerektirir, ancak invazyonun daha hızlı kuantifikasyonuna olanak tanır. Ters konfokal mikroskop kullanarak, transwell'e küçük bir miktar kalıntı PBS ekleyip büyük bir lam üzerine yerleştirin; immersiyon olmayan 20x objektif ile matrigel tıkaçının tabanından itibaren her 10 ila 15 mikronda bir optik kesitler alın. İnvasyonun derecesini tekil optik dilimleri kullanarak quantifiye edin. Ayrıca, velocity gibi uygun bir yazılım kullanarak bu optik dilim serilerinden üç boyutlu nesneler oluşturun; bu çalışmada hücreler calcium am ile boyanmıştır.

Beklendiği üzere, filtreden yukarı doğru invaze olan hücre sayısı mesafe arttıkça azalmaktadır. Bu invazyon nicel olarak belirlenebilir. Hücre invazyonunun üç boyutlu rekonstrüksiyonları, invazyon biçiminin görsel bir tasvirini sunar.

Hücreler floresan proteinlerin ekspresyonu ile işaretlenmişse, her renk hücrenin konumları bu yan görünümde gösterildiği gibi üç boyutlu rekonstrüksiyonlar şeklinde görselleştirilebilir. Ek olarak, rekonstrüksiyon üzerinden alınan kesitler moleküler mekanizmalara dair içgörüler sunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, standart yöntemlerle elde edilebilecekten daha fazla bilgi edinmek için bu hücre invazyon analizinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.