İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kasının proteom profillerindeki farklılıkların cinsiyet özgüllüğünü belirlemektir. Bu, çoğu proteini çıkarmak için önce erkek ve dişi farelerden alınan pazı brakisi göz dokularının kıyılması ve iyice homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, numune bir IEF jel şeridine uygulanır ve proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrılır, ardından bir SDS sayfası gelir, boyuta göre ikinci boyutta ayırma, jellerin boyanması ve görüntülenmesinin ardından, erkek ve dişi kas örneklerinin proteomik profilleri karşılaştırılır ve iki cinsiyet arasında bolluk açısından önemli farklılıklar olan noktalar eksize edilir.

Son olarak, jel tıkaçlarındaki proteinler tripsin ile sindirilir. Elde edilen peptitler jelden ekstrakte edilir ve tanımlama için nano sıvı kromatografisine, kütle spektrometresi analizine tabi tutulur. Sonuç olarak, iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik yoluyla iki veya daha fazla deneysel koşulda proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem kas cinsiyeti özgüllüğü hakkında fikir verebilse de, değişen fizyolojik durumdaki diğer hücrelere, dokulara, organlara veya sıvılara da uygulanabilir. Prosedürü göstermek, Smith College proteomik Merkezi'nin teknik direktörü Dr.Kalina Diva olacak. Fare iskelet kasını 45 mikrolitre ekstraksiyonda izole ettikten ve kıydıktan sonra, doku pergramını tamponlayın, motorlu bir havaneli kullanarak bu ve diğer tüm tampon tarifleri için yazılı protokole bakın, dokuyu her biri 15 saniye boyunca yedi kez homojenize edin dört santigrat derecede her homojenizasyon arasında buz üzerinde iki dakika soğutun.

Numuneleri 15, 800 G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Supernat'ı kaydedin ve hacmini ölçün. Proteinleri üç hacim buzda çökeltmek için peleti atın.

Süpernatan hacmi başına soğuk reaktif dereceli aseton. Tüpleri 15 saniye vorteksleyin, ardından topaklar oluşturmak için 15, 800 Gs'de 10 saniye santrifüjleyin. Supernat'ı atın ve peletleri ve ekstraksiyon tamponunu motorlu havaneli ve polipropilen karıştırma çubukları ile yeniden askıya alın, ek üç hacim aseton ekleyerek proteinleri ikinci kez çökeltin.

Pelet ve ekstraksiyon tamponunu tekrar askıya aldıktan sonra, protein konsantrasyonunu belirleyin ve/veya numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. Proteinlerin izoelektrik odaklamasını gerçekleştirmek için, eksi 20 santigrat derece dondurucudan hazır bir şerit IPG şeridini çıkarın ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika dengelenmesine izin verin. Numuneyi vorteksleyin ve numune rehidrasyon tepsisindeki bir kanalın arka kenarında düz bir çizgide 600 ila 800 mikrogram proteini pipetleyin ve her iki uçta yaklaşık bir santimetre bırakın.

Forseps kullanarak, IPG şeridinin plastik kapağını soyun, şeridin yalnızca uçlarını tuttuğunuzdan ve jel ile herhangi bir temastan kaçındığınızdan emin olun. Şeridin pozitif işaretli ucuna dikkat edin ve tepsinin sol tarafına yerleştirin. IPG şeridini jel tarafı aşağı bakacak şekilde numunenin üzerine yerleştirin.

Altında baloncuklar tutmaktan kaçının. Bir saat boyunca yeniden sulanmasına izin verin. Şeridi 2,5 mililitre mineral yağ ile kaplayın.

Tepsiyi bir kapakla örtün ve gece boyunca yeniden sulanmasına izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, odaklama ticaret kanalının her iki ucuna bir kağıt fitil yerleştirin ve her birini 10 mikrolitre milipor su ile ıslatın. IPG şeridini çıkarın ve yaklaşık 10 saniye dikey olarak tutun.

Yağı boşaltmak için plastik desteği bir Kim mendiliyle kurulayın. IPG şeridini, temel ucu sola bakacak şekilde jel tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Odaklama tepsisinde şeridi 2,5 mililitre mineral yağ ile kaplayın.

Tepsiyi protean IEF hücresine yerleştirin ve 20 santigrat derece varsayılan hücre sıcaklığında, maksimum 50 mikroamper akımda ve rehidrasyon süresi olmadan üç adımlı bir protokol programlayın. Program tamamlandıktan sonra, şerit jel bölgesini 11 santimetre e dengeleme tepsisine kadar aktarın. Kanala dört mililitrelik bir redüksiyon tamponu ekleyin ve şeridi hafif çalkalama ile 10 dakika dengeleyin.

İndirgeme tamponunu çıkarın ve kanala dört mililitre alkilasyon tamponu ekleyin ve şeridi 10 dakika daha çalkalayarak dengeleyin. IPG şeridini, bir XSDS çalışma arabelleğine kısa bir süre batırarak durulayın. Ardından, şerit jel tarafını 11 santimetrelik bir kriterin arka plakasına yerleştirin.

Prekast %10,5 ila %14 tris H-C-L-S-D-S poli akrilamid jel ve SDS jeli ile tam temas edecek şekilde yavaşça içeri itin. İki jel yüzeyi arasında kabarcık sıkışmadığından emin olun. IPG şeridini bir mililitre erimiş agro çözeltisi ile kaplayın ve beş dakika katılaşmasına izin verin.

Sonra single'a beş mikrolitre protein işaretleyici yükleyin. Jeli SDS tamponunda oda sıcaklığında 200 voltta veya dört santigrat derecede çalıştırın. Boya ön kısmı jelin dibine ulaştığında, plastik kalıptan çıkarın ve Kumasi Brilliant mavisi renginde hafifçe sallayarak gece boyunca lekeleyin.

Jeli çalkalayın, bir çözeltiyi her biri üç saat boyunca iki kez alıkoyun ve ikisini gece boyunca alıkoyun. Jeli analiz için% 7 asetik asit içinde saklayın. Jeli görüntüledikten sonra, jeller arasındaki nokta desenlerinin karşılaştırmalı bir analizini yapın ve ilgilenilen noktaları 200 mikrolitre alıkoyma solüsyonunda kestikten sonra, jel tıkaçları girdapla girdap haline getirin ve numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.

Ardından çözeltiyi dikkatlice çıkarın ve atın ve tekrarlayın. Jel tıkaçlarını içeren tüplere 30 mikrolitre taze hazırlanmış indirgeyici tampon ekleyin ve 60 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Numunelerin soğumasını bekleyin.

Ardından arabelleği çıkarın ve atın. 30 mikrolitre Alkilasyon tamponu ekleyin ve numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin Bir saat boyunca alkilasyon tamponunu çıkarın ve atın. Her tüpe 200 mikrolitre tutma solüsyonu ekleyerek jel tapalarını yıkayın ve numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Alıkoyma solüsyonunu çıkarın ve atın ve yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, jel tapalarına 50 mikrolitre aseto nitril ekleyin ve kurumasını sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra aseto nitrili dikkatlice çıkarın ve jel parçalarını tekrarlayın.

Beyaz ve küçük görünmeli. Jel parçalarının bir yoğunlaştırıcıda 10 dakika kurumasını bekleyin. 10 mikrolitre aktif tripsin çözeltisi ekleyerek jel parçalarını şişirin.

Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Tüplere 25 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, sallayarak numuneleri 10 dakika boyunca sonikat edin ve süpernatanı taze bir tüpe aktarmadan önce döndürün.

Peptitleri daha fazla çıkarmak için, tapalara 10 mikrolitre% 0.1 formik asit ekleyin ve numuneleri 10 dakika boyunca sallayarak oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Süpernatanı toplayın ve daha önce kaydedilmiş süpernatan ile birleştirin. Proteinler daha sonra tuzdan arındırılabilir ve HPLC bağlantılı kütle spektrometresi için hazırlanabilir, erkek ve dişi egzersizsiz aynalama iskelet kası ekstrakte edildi ve iki boyutlu bir haritaya ayrıldı.

Kas karşılaştırmalı proteomunun ilk seviyesi, yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme kullanılarak görselleştirildikten sonra, burada görüldüğü gibi her birinde yaklaşık 800 protein noktası tespit edildi. Erkek proteom haritasını temel olarak kullanarak, dişi proteomda bol miktarda değişen çok sayıda nokta olduğu açıktır: dişilerde iki kata eşit veya daha fazla artan noktalar kırmızı daire içine alınır ve iki kata eşit veya daha fazla azalan noktalar mavi daire içine alınır. İki kattan fazla yukarı veya aşağı değişen ve beş farenin N'si ile istatistiksel olarak anlamlı olan protein lekelerinin kimlikleri, sıvı kromatografisine bağlı kütle spektrometresi kullanılarak amino asit dizi analizi ile belirlenir.

Bu çizimde, x ekseni dişi farelerin egzersiz öncesi çalışmasını temsil eder ve Y ekseni tek bir sıfır saatlik zaman noktası grubunu temsil eder. Sonuçlar, dişilerin şeker enerji metabolizmasında, enzimlerde bol miktarda azalma gösterdiğini ve kreatin kinaz enziminde kaslarda farklı bir enerji tedarik sistemi izoform ettiğini göstermektedir. Hem insanlar hem de hayvanlar, istirahatte ve egzersizi takiben daha yüksek erkek serum CK seviyeleri gösterir, ancak serum CK seviyeleri mutlaka myo fibriller miktarı ile ilişkili değildir.

Miren biceps brachii kasındaki CK'nin hücresel bolluğundaki bu cinsiyet dimorfizmi yeni bir bulgudur ve fizyolojik olarak farklı serum CK seviyelerine cevap verebilir. Bu prosedürü takiben, sonuçları doğrulamak için kantitatif immünoblotlama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel proteom profillemesi için numunelerin nasıl hazırlanacağını ve ayrılacağını iyi anlamış olmalıyız.