Name: İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Keşfedin, iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometrisi kullanarak iskelet kasında cinsiyete özgü protein ekspresyon farklılıklarını analiz etme yöntemini. Bu teknik, yaklaşık 800 protein noktasının izolasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Yutian Gan Şekil 3 için teşekkür ederiz. Smith College Blakeslee, Wilens ve Holmes fonları; Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı 0420971 tarafından desteklenen ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü.

1. Örnek hazırlama <ol><li> Başlangıç ​​malzemesi olarak farelerden elde edilen taze, flaş dondurulmuş veya RNAlater ile tedavi edilen doku kullanın. Devam etmeden önce bir Kimwipe ile herhangi bir aşırı koruyucu kurutun. </li><li> Çevresindeki tüm tendon ve kas fasya çıkarın ve doku doku, iyi kıyılmış veya toz kadar bir soğuk oda (4 ° C) 2 dakika süreyle soğuk cam plakalar üzerine tek kenarlı Jilet ile kıyma. Önceden tartılmış mikrofuge'ye tüp örnek toplayın ve doku ağırlığı belirlemek. Başlangıç ​​materyali olarak en fazla 10 mg doku kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 mg kıyılmış doku başına 45 mcL ekstraksiyon tamponu (8 M üre, 50 mM DTT,% 4 ahbap,% 0.2 taşıyıcı ampholytes 5 / 8, 0.0002% Bromophenol Mavi) ekleyin. Hacmi 350 mcL daha büyükse, başlangıçta 350 mcL ekleyin ve homojenize (adım 1.4), daha sonra sıçramasına en aza indirmek için tampon geri kalanını ekleyin. </li><li> 15 saniye için doku motorlu havaneli (Kontes Corp) ile yedi kez homojenize4 ° C, iki dakika her homojenizasyon arasındaki buz üzerinde soğutma ile. </li><li> 4 30 dakika 15.600 xg örnekleri Santrifüj ° C Süpernatantı kaydedin ve hacmini ölçmek. Hücre enkaz pelet atılır. </li><li> Buz gibi reaktif dereceli aseton (v oranı 3 kat v) süpernatantı proteinlerin çöktürün. 15 saniye vorteksleyin. Pelet formu ve Kontes motor ve polipropilen karıştırma çubukları (BioSpec Remix) ekstraksiyon tamponu ile tekrar süspansiyon 15.600 xg 10 saniye süreyle santrifüj </li><li> Adım 1.6 tekrarlayın. </li><li> Ya örneklerin protein konsantrasyonu tahmini ile devam ya da -20 ° C'de saklayın </li></ol> 2. Protein konsantrasyonu tahmini Yaklaşık 4,5 mg ml -1 amacı; Lowry tahlil 7 veya BCA tahlil 8 (Pierce) kullanın. 3. Odaklama İzoelektrik <ol><li> ReadyStrip IPG şeridi çıkarın (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)-20 ° C ve 10-15 dakika süreyle RT gelmesini sağlayınız. </li><li> Vorteks protein örnek örnek örnek rehidrasyon tepsisini bir kanal arka kenarında düz bir çizgide ve pipet 600-800 mg (toplam hacmi 200 mcL), yaklaşık 1 cm bırakarak her iki ucunda. </li><li> Forseps kullanarak, IPG şerit plastik kapak kalkmasına şerit uçları sadece sap ve jel ile herhangi bir teması önlemek için emin olun. Not ve şerit temel tepsisinin sol tarafındaki pozisyon. Örnek üstünde aşağı IPG şerit jel tarafı yerleştirin, yakalama kabarcıkları altında kaçının. Bir saat rehidrate izin ver. </li><li> 2.5 mL mineral yağı (BioRad) Overlay. Tepsisi kapağı, kapak ve oda sıcaklığında bir gece rehidrate bırakın. </li><li> Odaklama tepsi kanalın her iki ucunda bir kağıt fitil yerleştirin ve her biri 10 mcL Millipore su ile ıslak. </li><li> Şerit IPG çıkarın ve yağ tahliye için yaklaşık 10 saniye dikey olarak tutun. Leke plastik bKimwipe ile acking. </li><li> IPG şerit jel yan odaklama tepsisinde aşağı ve sola temel sonuna yerleştirin. Şerit 2.5 mL mineral yağı ile kaplayın. </li><li> Protean IEF hücreli (Bio-Rad) ve program varsayılan 20 hücre sıcaklığında 3 aşamalı bir protokol (Tablo 1) tepsiye yerleştirin ° C, 50 uA / şerit ve rehidrasyon süresi maksimum akım. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Gerilim </td><td> Zaman </td><td> Volt-Saat </td><td> Rampa </td></tr><tr><td> Adım 1 </td><td> 250 </td><td> 20 dk. </td><td></td><td> Doğrusal </td></tr><tr><td> Adım 2 </td><td> 8.000 </td><td> 2.5 saat </td><td></td><td> Doğrusal </td></tr><tr><td> Adım 3 </td><td> 8.000 </td><td></td><td> 40.000 </td><td> Hızlı </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td> 6.5 saat </td><td> 40.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Üç adım 11 cm şeritler IPG Protean IEF hücre protokolü. </li><li> IPG şeritler forseps kullanarak IEF hücre dışına çekin. Kimwipe ile plastik desteğini Blot ve IPG şerit jel tarafı, temiz bir rehidrasyon tepsiye yerleştirin. Rehidrasyon tepsi örtüsü ve plastik wrap ve mağaza ile sarın - 80 ° C veya devam edin. </li></ol> 4. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi <ol><li> Şerit (jel tarafı yukarı) 11 cm dengeleme tepsisine aktarın. </li><li> Kanala azalma tamponu (6 M üre,% 2 SDS, 0.05 M Tris / HCl, pH 8.8,% 20 gliserol,% 2 DTT) 4 mL ekleyin ve hafif sallayarak 10 dakika için şerit dengeye. </li><li> Azaltılması tamponu çıkarın, alkilleme tamponu (6 M üre,% 2 SDS, 0.05 M Tris / HCl, pH 8.8,% 20 gliserol,% 2,5 iodoacetamide) 4 mL ekleyin ve hafif sallayarak 10 dakika için şerit dengeye. </li><li> Stri daldırma IPG şerit durulayın1 X SDS çalışan tampon p kısa bir süre (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, pH 8.2). </li><li> 11 cm arka plaka üzerine şerit jel yan yatırın Kriter prekast 10.5% -14% Tris-HCl SDS-poliakrilamid jel (Bio-Rad) ve SDS jel ile tam temas edinceye kadar yavaşça itin; iki jel yüzeyler arasında sıkışıp hava kabarcığı emin olun. </li><li> 1 ml (% 0.5 agaroz, 25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, Bromophenol Mavi) erimiş agaroz çözüm IPG şerit Yerleşimi ve agaroz 5 dakika boyunca katılaşmaya izin. </li><li> Molekül ağırlığı standartları olarak tek bir kuyunun içine protein marker 5 mcL 10-225 kDa (76.740 USB, P / N) yükleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 200 V veya jel elektroforez izlemek için Bromophenol Mavi boya ön göç kullanarak bir soğuk oda (4 ° C) SDS tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, pH 8.2) çalıştırın. </li><li> Plastik dökme jel çıkarın ve geceleme Coomassie Brillant Blue hafifçe sallayarak lekeR-250 (% 45.5 metanol,% 45.5 dH2O,% 9.0 asetik asit,% 0.25 Coomassie Brillant Blue R-250) leke. </li><li> 3 saat gecede her bir ve Destain 2 (% 5 metanol,% 90 dH 2 O,% 5 asetik asit) için jel Destain 1 solüsyonu (% 45.5 metanol,% 45.5 dH 2 O,% 9.0 asetik asit) iki kez çalkalayın . Analiz için% 7 asetik asit jel saklayın. </li></ol> 5. Jel görüntüleme ve analiz <ol><li> VersaDoc görüntüleme sistemi (BioRad) faaliyet Miktar Bir yazılım programı kullanarak jeller, görüntüler yakalayın. Denemenizi tüm jeller için düzgün görüntü alanları kırpın. </li><li> Bir deney seti oluşturmak için kırpılmış görüntüleri PDQuest 8.0 yazılım programı yükleyin. Nokta tespiti ve jeller arasında eşleştirme nokta için parametreleri tanımlamak için Deney kurulum sihirbazı izleyin. Kontrol edin ve gerekirse elle sonuçları eşleşen spot rafine. </li><li> Tw ile eşleşen protein noktaları tespit etmek için jeller nicel ve istatistiksel analiz yapıniki jel grupları arasında ifade o kat veya daha yüksek istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar. Bu ilgi çekici noktalar ile bir analiz oluşturun ve tripsin sindirim ve LC-MS-tabanlı protein belirlenmesi için bir EXQuest spot kesici (BioRad) kullanarak bunları kesip. </li></ol> 6. Jel triptik sindirim Bu adımı modifiye Pierce-Gel Triptik Digest Kit (# 89871X, Pierce) protokolü kullanılır. <ol><li> Jel fişler destaining çözüm (25 mM amonyum bikarbonat,% 50 asetonitril) 200 mcL ekleyin. Vortex ve 37 ° örnekleri inkübe ° C ile 30 dakika boyunca sallayarak. Çözüm dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> 6.1 adımı tekrarlayın. </li><li> Taze hazırlanmış azaltarak tamponu (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfin, 22.5 mM amonyum bikarbonat), 60 ° C'de 10 dakika jel fişler ve inkübe içeren tüplere 30 mcL ekle </li><li> Örnekleri soğutmak için izin ver; sonra çıkarın ve indirgeyici tampon atın.</li><li> Alkilleme tamponu (folyo sarılı tüpler içinde hemen önce hazırlanan 100 mM iodoacetamide, 20 mM amonyum bikarbonat, 30 mcL ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta örnekleri inkübe edin. </li><li> Alkilleme tamponu çıkarın ve atın. Her tüp çözüm destaining 200 mcL ekleyerek jel fişler yıkayın. 37 örnekleri ° C'de 15 dakika boyunca. </li><li> Destaining çözüm çıkartın ve atın ve yıkama tekrarlayın. </li><li> Jel fişler asetonitril 50 mcL ekleyin ve onları kuru küçültmek için izin oda sıcaklığında 10 dakika inkübe sonra asetonitril dikkatlice çıkarın. </li><li> Adım 6.8 kez daha tekrarlayın. Jel adet beyaz ve küçük bir bakmak gerekir. </li><li> Jel parçaları 10 dakika Centrivap Konsantratörü (Labconco Model EX1245) kurumasını bekleyin. </li><li> 10 mcL aktif tripsin çözeltisi (10 ng / ml tripsin, 25 mM amonyum bikarbonat) eklenerek jel parçaları şişer. 15 m için oda sıcaklığında inkübeinutes. </li><li> Tüpler 25 mcL sindirim tamponu (25 mM amonyum bikarbonat) ekleyin. Örnekleri sallayarak bir gecede oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 10 dakika örnekleri sonikasyon (Branson, banyo sonikatör modeli 2510) ve yeni bir tüp süpernatant çıkarmadan önce onları aşağı doğru döndürün. Süpernatantı kaydedin. </li><li> Peptidler daha ayıklamak için, titreme 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 formik asit ve inkübe 10 mcL ekleyin. Örnekleri 10 dakika boyunca sonikasyon süpernatantı toplamak ve adım 6.13 kaydedilir süpernatant ile birleştirmek. </li></ol> 7. Peptid özler Mikro tuzsuzlaştırma <ol><li> Üretici talimatlarına göre PepClean C-18 Spin Kolonlar (ThermoFisher) yardımı ile peptid özleri amonyum bikarbonat ve diğer tuzlar çıkarın. </li><li> Zehir peptidler 20 mcL% 70 asetonitril ile iki kez, 1 saat ve tekrar süspansiyon için Centrivap Konsantratörü santrifüj kuru örnekleri buharlaşmasıMS analizi için 10 mcL% 0.1 formik asite peptidler. </li></ol> 8. HPLC-coupled kütle spektrometresi tarafından Protein tanımlama <ol><li> PS-DVB Pepswift yekpare bir sütun (Dionex)% 0.2 formik asit peptid karışımı 40 dakika boyunca yüksek bir performans likid kromatografi (HPLC), doğrusal bir 2-50% asetonitril degrade kullanarak ayrı ayrı 5 mcL, bir Nanospray akuple I ucunda 400 nL / dak akış hızında bir iyon tuzağı kütle spektrometresi (LÖA Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) üzerine kaynağıdır. </li><li> 1400 m / z ve dinamik bir dışlama ile CID MS2 sıralaması için izole edilmesi için 3 en yoğun iyon doruklarına izin - 400 arasında peptid MS1 sinyallerini algılar. </li><li> Protein tanımlanması için bir statik alkillenmiş sistein modifikasyonu ve fosforilasyon için dinamik değişiklikler (serin, treonin, tirozin), methyla Sequest fare referans veritabanı arama (BioWorks yazılım, Thermo Fisher Scientific) ile peptid sonuçları analizğünü (histidin), oksidasyon (metionin), ADP-ribosylation (arginin) ve N-terminal asetilasyon. Muhafazakar eşleştirme ölçütleri (örneğin, proteinler, Xcorr vs Şarj Devlet filtresi geçen en az 2 peptidler içeren 2 AMU ve 1.00 parçası hoşgörü, peptid hoşgörü uygulayın [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00 ve p &lt;0.05) 5 ve elle emin protein tanımlanması için MS spektrumları incelemek bir olasılık. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Erkek ve kadın unexercised, fare iskelet kası (biceps brachii'nin) ayıklanır ve iki boyutlu harita 5 kas karşılaştırmalı proteom (Şekil 2), ilk seviye ayrılır. Bir kez yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme kullanılarak görüntülendi; her birinde yaklaşık 800 protein noktalar tespit edildi. Erkek proteom harita kullanarak bir temel olarak, birçok noktalar kadın proteom bolca değişim olduğu açıktır. Spot şiddetleri protein miktarları değişiklik önlemler (Şekil 3). Iki kat (yukarı ya da aşağı) 'den daha fazla değişim ve protein noktalar kimlikleri istatistiksel olarak anlamlı (p &lt;0.05) n = 5 fare ile amino asit dizi analizi, sıvı kromatografisi-birleştiğinde kütle spektrometresi ile belirlenir. Bu sonuçlar göstermektedir ki kadın şeker enerji metabolizması, enzimler, kreatin kinaz enzim (CK) izoformları, kasları farklı bir enerji arz sistemi bir bolluk azalma göstermektedir. Insan ve hayvanların, hem de dinlenme ve aşağıdaki egzersiz 9,10 daha yüksek erkek serum CK düzeyleri ekran, ancak serum CK düzeyleri mutlaka 11,12 myofibrillar kesinti miktarı ile ilişkili değildir. Bu cinsiyet dimorfizm fare biceps brachii'nin kas CK hücresel bolluk içinde bir roman finding5 ve fizyolojik olarak farklı serum CK düzeyleri cevap verebilirsiniz. Şekiller: g1.jpg "/&gt; Şekil 1 karşılaştırmalı proteomik protokol genel bir şematik. Numunesinin analiz; ve protein kimlik numune hazırlama protokolü üç gruba ayrılmıştır; Genel protokol durmadan yürütülmektedir, en iyi sonuçları aldı olmasına rağmen protokolleri bu üç grubun her uçları, aynı zamanda makul bir duraklatma yerlerdir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 dişi fare pazı brachii'nin protein Karşılaştırma erkek pazı brachii'nin aynı noktalar (yeşil çevrelerin o) noktalar. Kadınlarda iki kat daha büyük ya da eşit artış Spotlar daire kırmızı (o) ve iki katına eşit veya daha az düştüğü o mavi (o) daire bulunmaktadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Jel Spot Yoğunluk Analizi: X-ekseni, kadınegzersiz öncesi (kontrol, n = 5), Y-ekseni, 0 sa bir zaman noktasında grup maçı kadın tek (n = 5). Regresyon doğrusu: korelasyon katsayısı = 0,919; eğim = 0,976; önünü = -0,0293. - Kırmızı çizgi mavi çizginin üstünde ve altında iki kat Spotlar + / daha fazla değiştirebilir.

<ol><li>Fehrenbach, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFehrenbach%2C+E+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22">Molecular and Cellular Exercise Physiology</a>. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Cell.</a> Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 3-18 (2005).</li>
<li>Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repeated+bout+effect+and+heat+shock+proteins%3A+intra-muscular+HSP27+and+HSP70+expression+following+two+bouts+of+eccentric+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans.</a> Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).</li>
<li>McHugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+repeated+bout+effect%3A+the+protective+effect+against+muscle+damage+from+a+single+bout+of+eccentric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Med.+Sci.+Sports%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise.</a> Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).</li>
<li>Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Dimorphism+in+the+Exercise-Na%C3%AFve+Murine+Skeletal+Muscle+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Molec.+Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome.</a> Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).</li>
<li>Lopez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+in+proteome+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis.</a> J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+creatine+kinase+activity+and+body+composition+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum creatine kinase activity and body composition in males and females.</a> Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).</li>
<li>Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+isoenzyme+profiles+after+exercise+in+the+rat%3A+sex-linked+differences+in+leakage+of+CK-MM%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM.</a> Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).</li>
<li>Kendall, B., Eston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+muscle+damage+and+the+potential+protective+role+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen.</a> Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).</li>
<li>Tiidus, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+oestrogen+influence+skeletal+muscle+damage%2C+inflammation%2C+and+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair?</a> Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan LC / MS proteomik yöntemi iskelet kas proteom ilk seviye hızlı bir analizi için en güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokoldür. Bu makul bir çare bir karşılaştırma için cinsiyet özgüllük sağlar. Düşük bolluk proteinleri, kas örnek bir fraksiyonasyon böylece artan düşük bolluk proteinler, mümkün olduğunca kontraktil proteinler gibi birçok kaldırmak için gerektirecektir. Istenirse proteom profil Terzilik farklı pH aralığında IPG şeritler ve alternatif yüzde degrade jeller ile yapılabilir. Daha hassas floresan lekeleri vardır, ama biz her laboratuar sistem bu lekeler doğrusallık belirlemek öneririz. Protein ekspresyonu daha titiz bir analizi için Dige sistemi (İki Boyutlu Elektroforez sistemi-Jel, GE Healthcare Yaşam Bilimleri) kullanılabilir, ancak bu karmaşıklık düzeyine metodoloji eklese. Ayrıca, burada açıklanan en ani protokolü ile kullanılabilirörtüşen enzimatik parçalarının yanı sıra yüksek saflıkta enzimler kullanılarak oluşturulan olabilir çünkü bir genom gibi herhangi bir kaynaktan gelen bir protein de novo sıralama olarak, sıralı edildiği için normal dokuların sürece, iki boyutlu bir jel üzerinde çözülecektir . tripsin için. Hidrofobik membran ve proteinler için arayan, ancak, biz bu protokolü kullanarak, kalp, karaciğer, böbrek ve beyin dokularında ile iyi sonuçlar vardı, özellikle diğer doku kaynaklarından alınan numuneler, ekstraksiyon yöntemi bazı değişiklikler gerekebilir. Diğer post-translasyonel modifikasyonlar tayf veritabanı arama kriterlerini değiştirerek tespit edilebilir. Özetle, biz makul proteom profil analizi için detaylı bir başlangıç ​​protokolü sundu.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Tip </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Sütunlar </td><td> Sarf </td><td> ThermoFisher Bilimsel </td><td> PI-89.870 </td><td></td></tr><tr><td> Monolitik Pepswift sütun (100um x 5 cm) </td><td> Sarf </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Kriter pre-cast 10.5% -14% Tris-HCl SDS poliakrilamid jeller </td><td> Sarf </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> IPG şeritler Readystrip </td><td> Sarf </td><td> BioRad </td><td> PH Değişen aralıkları </td><td></td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> Reaktif </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Aseton </td><td> Reaktif </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Asetonitril </td><td> Reaktif </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reaktif </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Kaplama çözüm </td></tr><tr><td> Amonyum bikarbonat </td><td> Reaktif </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td> Reaktif </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte Ampholytes </td><td> Reaktif </td><td> BioRad </td><td></td><td> PH Değişen aralıkları </td></tr><tr><td> Chaps </td><td> Reaktif </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie mavi R-250 </td><td> Reaktif </td><td> ThermoFisher Bilimsel </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Reaktif </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Formik asit </td><td> Reaktif </td><td> ThermoFisher Bilimsel </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glisin </td><td> Reaktif </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Reaktif </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> Madeni yağ </td><td> Reaktif </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris baz </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfin </td><td> Reaktif </td><td> ThermoFisher Bilimsel </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin Endoproteinase TPCK tedavi, MS notu </td><td> Reaktif </td><td> Delmek </td><td> 90055 </td><td> modifiye </td></tr><tr><td> Üre </td><td> Reaktif </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> Su </td><td> Reaktif </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivap Konsantratörü </td><td> Tool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest nokta makası </td><td> Araç </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LÖA Deca XP Max iyon tuzağı kütle spektrometresi </td><td> Araç </td><td> ThermoFisher Bilimsel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorlu havaneli </td><td> Araç </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırma Polipropilen </td><td> Araç </td><td> BioSpec Üretim </td><td></td><td></td></tr><tr><td> çubuklar </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Protean IEF hücre </td><td> Araç </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonikatör </td><td> Araç </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Surveyor Plus, HPLC sistem </td><td> Araç </td><td> ThermoFisher Bilimsel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc görüntüleme sistem </td><td> Araç </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İskelet kası cinsiyet proteomik dimorfizm

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Brüt iskelet kas kasılması öncelikle kontraktil proteinlerin görece küçük bir sayı tarafından belirlenir, ancak bu doku da önemli direnç egzersiz ve kullanmama atrofisi hipertrofisi gibi çevresel faktörler 1 uyarlanabilir. Böylece stresörler (ısı, iskemi, ağır metaller, vb.) 2,3 şekillenmesi ve uyarlamalar sergiler. , Sözde eksantrik kasılma 4 uzatma ederken Hasar kas kas kuvvet tarafından uygulamakla oluşabilir. Kontraktil proteinler gibi exertions hasarlı ve bozulmuş ve / veya resynthesized, tamir edilecek; bu işlevleri kontraktil proteinlerin parçası değildir, ama diğer daha az bol proteinleri hücre. Hasar bu tür ıslah ne katılan proteinlerin alt belirlemek için diferansiyel belirlemek için küresel bir proteom 5 egzersiz önce kurulmuş olmalı ve ardından egzersiz sonrasında takipprotein ekspresyonu ve böylece hasarı ve onarım uyarlamalar aday proteinleri vurgulamak. Ayrıca, iskelet kası çalışmaların çoğu türlerin erkek yapılmıştır ve dolayısıyla kadın kas temsilcisi olmayabilir. Biz bu makalede, erkek ve kadın kas proteinleri tekrarlanabilir açılan ve yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme 6 takiben iki boyutlu jel elektroforezi ile ayırarak için bir yöntem sunar . Bu gösteren noktalar (ve sonradan tespit proteinler) için bir protokol istatistiksel olarak anlamlı (p &lt;0.05) iki kat artış veya azalma, görünür ya da kontrolü devletin kaybolur. Bunlar daha sonra, eksize tripsin ile sindirilir ve protein tanımlama (LC / MS / MS) 5 için kütle spektrometresi (LC / MS) ile birleştiğinde yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile ayrılır. Bu metodoloji (Şekil 1) (karaciğer, beyin, duymak hiç değişiklik ile birçok dokuda kullanılabilirt vb.)

, Izole ve en bol bulunan proteinlerin iskelet kası ifade kimliğini belirlemek için yöntemler ileri düz bir set. Yaklaşık 800 noktalar 10 mg kas iki boyutlu bir jel üzerinde ayırt bu cinsiyete özgü protein ifade belirlenmesi için olanak sağlar. Bu yöntemler çoğu dokularda eşdeğer sonuçlar verecektir.

İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

İskelet kasındaki kaba kasılma öncelikle nispeten az sayıda kontraktil protein tarafından belirlenir; ancak bu doku aynı zamanda dikkat çekici derecede...

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kasının proteom profillerindeki farklılıkların cinsiyete özgülüğünü belirlemektir. Bu işlem, öncelikle çoğu proteinin ekstrakte edilmesi amacıyla erkek ve dişi farelerden alınan biceps brachyı dokularının kıyılması ve tamamen homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, örnek bir IEF jel şeridine uygulanır ve proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılır; bunu takiben SDS-PAGE ile boyutlarına göre ikinci boyutta ayrıştırma yapılır. Jellerin boyanması ve görüntülenmesinin ardından, erkek ve dişi kas örneklerinin proteomik profilleri karşılaştırılır ve iki cinsiyet arasında bolluk açısından anlamlı farklar gösteren spotlar kesilerek çıkarılır.Son olarak, jel tıkaçlarındaki proteinler tripsin ile sindirilir. Oluşan peptitler jelden ekstrakte edilir ve tanımlama için nano sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi analizine tabi tutulur. Nihayetinde, iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometrisi tabanlı proteomik aracılığıyla, iki veya daha fazla deneysel koşulda proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, kasların cinsiyete özgü özellikleri hakkında bilgi sağlayabilse de; farklı fizyolojik durumlardaki diğer hücrelere, dokulara, organlara veya sıvılara da uygulanabilir. Prosedürü, Smith College Proteomik Merkezi teknik direktörü Dr. Kalina Diva gerçekleştirecektir. Fare iskelet kasını izole edip temizledikten ve doku başına 45 µL ekstraksiyon tamponu kullanarak doğradıktan sonra (bu ve diğer tüm tampon tarifleri için yazılı protokole bakınız), motorlu bir havan eli kullanarak, her biri 15 saniye süren yedi kez homojenizasyon işlemini 4 °C'de, her homojenizasyon arasında buz üzerinde iki dakikalık soğutma süreleri bırakarak gerçekleştirin.Numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.800 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı saklayın ve hacmini ölçün. Proteinleri üç hacim buzda çöktürmek için peleti atın.Süpernatan hacmi kadar soğuk reaktif saflıkta aseton ekleyin. Tüpleri 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından pellet oluşturmak için 15.800 G'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve pelletleri motorlu havan eli ve polipropilen karıştırma çubukları ile ekstraksiyon tamponu içinde yeniden süspande edin; proteinleri ikinci kez çöktürmek için ek olarak üç hacim aseton ekleyin.Pelleti ve ekstraksiyon tamponunu resüspanse ettikten sonra, protein konsantrasyonunu belirleyin ve/veya örnekleri -20 °C'de saklayın. Proteinlerin izoelektrik odaklamasını gerçekleştirmek için, dondurucudan hazır bir IPG şeridi çıkarın ve 10 ila 15 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Örneği vorteksleyin ve 600 ila 800 µg proteini, numune rehidrasyon tepsisindeki bir kanalın arka kenarına, her iki uçta yaklaşık bir santimetre boşluk bırakacak şekilde düz bir hat halinde pipetleyin.Forseps kullanarak, şeridin sadece uçlarından tutmaya ve jel ile herhangi bir temas kurmamaya dikkat ederek IPG şeridinin plastik kapağını soyun. Şeridin pozitif işaretli ucunu belirleyin ve bunu tepsisinin sol tarafına yerleştirin. IPG şeridini, jel tarafı numunenin üzerine gelecek şekilde yerleştirin.Alt kısımda hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Bir saat boyunca rehidrasyona bırakın. Şeridin üzerini 2,5 mililitre mineral yağ ile kaplayın.Tepsiyi bir kapakla kapatın ve gece boyunca yeniden hidrate olmasına izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, odaklama kanalının her iki ucuna birer kağıt fitil yerleştirin ve her birini 10 µL millipore su ile ıslatın. IPG şeridini çıkarın ve yaklaşık 10 saniye boyunca dikey konumda tutun.Yağı süzmek için, plastik desteklemi bir Kim wipe ile kurulayın. IPG şeridini, temel ucu sola gelecek şekilde jel tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirin. Odaklama tepsisinde, şeridin üzerini 2,5 milliliters mineral yağı ile kaplayın.Tepsiyi protean IEF hücresine yerleştirin ve varsayılan hücre sıcaklığı 20 °C, şerit başına maksimum akım 50 µA ve rehidrasyon süresi olmadan üç adımlı bir protokol programlayın. Program tamamlandıktan sonra, şeridi jel tarafı yukarı gelecek şekilde 11 cm'lik bir dengeleme tepsisine aktarın. Kanala 4 mL redüksiyon tamponu ekleyin ve şeridi hafifçe çalkalayarak 10 dakika boyunca dengeleyin.Redüksiyon tamponunu uzaklaştırın, kanala dört mililitre alkilasyon tamponu ekleyin ve şeridi 10 dakika daha çalkalayarak dengeye getirin. IPG şeridini, bir XSDS çalıştırma tamponuna kısa süreliğine daldırarak durulayın. Ardından, şeridi jel yüzeyi yukarı bakacak şekilde 11 santimetrelik bir criterion arka plakasına yerleştirin.Önceden hazırlanmış %10,5 ila %14'lük tris H-C-L-S-D-S poliakrilamid jeli ve SDS jeli ile tam temas sağlayacak şekilde nazikçe bastırın. İki jel yüzeyi arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. IPG şeridinin üzerine bir mililitre erimiş agar çözeltisi dökün ve beş dakika boyunca katılaşmaya bırakın.Ardından, tek kuyucuğa beş µL protein markörü yükleyin. Jeli, SDS tamponu içerisinde, oda sıcaklığında veya 4 °C'de 200 volt ile yürütün. Boya önü jelin altına ulaştığında, jeli plastik kalıptan çıkarın ve Coomassie Brilliant Blue içerisinde nazikçe çalkalayarak gece boyunca boyayın.Jeli, her biri üç saat sürecek şekilde iki kez detein 1 çözeltisinde çalkalayın ve ardından detein 2 çözeltisinde gece boyunca bekletin. Analiz için jeli %7 asetik asitte saklayın. Jelin görüntülenmesinin ardından, jeller arasındaki spot paternlerinin karşılaştırmalı analizini gerçekleştirin ve ilgilenilen spotları kesin; jel tıkaçlarına 200 µL detaining çözeltisi ekleyerek vorteksleyin ve örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.Ardından çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırıp atın ve işlemi tekrarlayın. Jel tıkaçlarını içeren tüplere, taze hazırlanmış 30 µL indirgeme tamponu ekleyin ve 60 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Numunelerin soğumasını bekleyin.Ardından tamponu uzaklaştırın ve atın. 30 µL Alkylation buffer ekleyin ve örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin; ardından alkilasyon tamponunu uzaklaştırın ve atın. Her tüpe 200 µL detaining solution ekleyerek jel plug'larını yıkayın ve örnekleri 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Tutma çözeltisini uzaklaştırıp atın ve yıkama işlemini tekrarlayın. Ardından, jel tıkaçlarına 50 µL asetonitril ekleyin ve büzülerek kurumalarını sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sonrasında asetonitrili dikkatlice uzaklaştırın ve jel parçalarını tekrar toplayın.Beyaz ve küçük görünmelidir. Jel parçalarının bir konsantratörde 10 dakika boyunca kurumasına izin verin. 10 µL aktive edilmiş tripsin çözeltisi ekleyerek jel parçalarını şişirin.15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tüplere 25 µL sindirim tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında, çalkalayarak gece boyunca inkübe edin; numuneleri 10 dakika boyunca sonike edin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarmadan önce santrifüjle çöktürün.Peptitleri daha fazla ekstrakte etmek için, tıkaçlara 10 µL %0,1 formik asit ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin, ardından örnekleri 10 dakika boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Süpernatantı toplayın ve daha önce saklanan süpernatant ile birleştirin. Proteinler daha sonra tuzdan arındırılabilir ve HPLC bağlantılı kütle spektrometrisi için hazırlanabilir; egzersiz yapmamış erkek ve dişi aynalı iskelet kası ekstrakte edilmiş ve iki boyutlu bir haritaya ayrılmıştır.Yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme kullanılarak görselleştirilen kas karşılaştırmalı proteomunun ilk seviyesinde, burada görüldüğü üzere her birinde yaklaşık 800 protein spotu tespit edilmiştir. Erkek proteom haritası temel olarak alındığında, dişi proteom spotlarında bolluğu değişen çok sayıda spot olduğu açıkça görülmektedir; dişilerde iki kat veya daha fazla artanlar kırmızıyla, iki kat veya daha fazla azalanlar ise maviyle daire içine alınmıştır. Beş fareden oluşan bir grup (N=5) ile istatistiksel olarak anlamlı olan ve iki kat veya daha fazla artış ya da azalış gösteren protein spotlarının kimlikleri, sıvı kromatografisi ile eşleştirilmiş kütle spektrometrisi kullanılarak amino asit sekans analizi ile belirlenmiştir.Bu grafikte, x ekseni egzersiz öncesindeki dişi fareleri, Y ekseni ise tek seferlik sıfırıncı saat zaman noktası grubunu temsil etmektedir. Sonuçlar, dişilerin şeker enerji metabolizmasında, enzimlerde ve kaslardaki farklı bir enerji besleme sistemi olan kreatin kinaz enzim izoformlarında belirgin bir azalma gösterdiğini ortaya koymaktadır. Hem insanlarda hem de hayvanlarda, dinlenme halindeyken ve egzersiz sonrası erkek serum CK seviyeleri daha yüksek seyretmektedir; ancak serum CK seviyeleri, miofibriller miktarıyla mutlaka korelasyon göstermemektedir.Miren biceps brachii kasındaki CK hücre bolluğunda görülen bu cinsiyet dimorfizmi yeni bir bulgudur ve fizyolojik olarak farklı olan serum CK seviyelerini açıklayabilir. Bu prosedürün ardından, sonuçları doğrulamak amacıyla kantitatif immünoblotlama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel proteom profilleme için örneklerin nasıl hazırlanacağı ve ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıyız.

skeletal-muscle-gender-dimorphism-from-proteomics

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Bu video, Weil-Blakesley konkotomu kullanılarak insan vastus lateralisinin perkütan kas biyopsisi tekniğini göstermektedir.

İnsan<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Weil-Blakesley Conchotome kullanılması İskelet Kası Biyopsi

MyoD, birçok tamamen farklılaşmış kas dışı hücre hattının miyojenik transdiferansiasyonunu indükleme kapasitesine sahip miyojenik bir transkripsiyon faktörüdür. Bu transdiferansiyasyonda yer alan epigenetik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, MyoD ortaklarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kütle spektrometresi ile takip edilen bir çift afinite saflaştırma yöntemini açıklıyoruz.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

Drosophila uçuş kası transkripsiyonel düzenleme, alternatif birleştirme, metabolizma ve mekanobiyoloji çalışma güçlü bir modeldir. Biz proteomics ve derin sıralama için ideal son derece zenginleştirilmiş örnekler oluşturmak için canlı pupa floresan etiketli uçuş kası diseksiyon için bir protokol salıyoruz. Bu örnekler kas gelişiminin çeşitli yönleri ne önemli mekanistik anlayışlar sunabilir.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA'ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Bu protokol, küçük hayvanlarda iskelet kası ve iç organ dokusu, yağ dokusu ve iskelet dokusu dahil olmak üzere yağsız kütlenin uygun maliyetli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için mikro bilgisayarlı tomografi kullanır. Biyomedikal araştırmalar için, özellikle küçük hayvanlarda yapılan translasyonel araştırmalarda önemli avantajlar sunan yağsız ve yağ dokusu arasında ayrım yapar.

Mikro Bilgisayarlı Tomografi Kullanılarak Küçük Hayvanlarda Non-İnvaziv İskelet Kası Miktar Tayini

Keşfedin, iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometrisi kullanarak iskelet kasında cinsiyete özgü protein ekspresyon farklılıklarını analiz etme yöntemini. Bu teknik, yaklaşık 800 protein noktasının izolasyonunu sağlar.

İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Daha fazla video keşfet