İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kasının proteom profillerindeki farklılıkların cinsiyete özgülüğünü belirlemektir. Bu işlem, öncelikle çoğu proteinin ekstrakte edilmesi amacıyla erkek ve dişi farelerden alınan biceps brachyı dokularının kıyılması ve tamamen homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, örnek bir IEF jel şeridine uygulanır ve proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılır; bunu takiben SDS-PAGE ile boyutlarına göre ikinci boyutta ayrıştırma yapılır. Jellerin boyanması ve görüntülenmesinin ardından, erkek ve dişi kas örneklerinin proteomik profilleri karşılaştırılır ve iki cinsiyet arasında bolluk açısından anlamlı farklar gösteren spotlar kesilerek çıkarılır.

Son olarak, jel tıkaçlarındaki proteinler tripsin ile sindirilir. Oluşan peptitler jelden ekstrakte edilir ve tanımlama için nano sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi analizine tabi tutulur. Nihayetinde, iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometrisi tabanlı proteomik aracılığıyla, iki veya daha fazla deneysel koşulda proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, kasların cinsiyete özgü özellikleri hakkında bilgi sağlayabilse de; farklı fizyolojik durumlardaki diğer hücrelere, dokulara, organlara veya sıvılara da uygulanabilir. Prosedürü, Smith College Proteomik Merkezi teknik direktörü Dr. Kalina Diva gerçekleştirecektir. Fare iskelet kasını izole edip temizledikten ve doku başına 45 µL ekstraksiyon tamponu kullanarak doğradıktan sonra (bu ve diğer tüm tampon tarifleri için yazılı protokole bakınız), motorlu bir havan eli kullanarak, her biri 15 saniye süren yedi kez homojenizasyon işlemini 4 °C'de, her homojenizasyon arasında buz üzerinde iki dakikalık soğutma süreleri bırakarak gerçekleştirin.

Numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.800 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı saklayın ve hacmini ölçün. Proteinleri üç hacim buzda çöktürmek için peleti atın.

Süpernatan hacmi kadar soğuk reaktif saflıkta aseton ekleyin. Tüpleri 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından pellet oluşturmak için 15.800 G'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve pelletleri motorlu havan eli ve polipropilen karıştırma çubukları ile ekstraksiyon tamponu içinde yeniden süspande edin; proteinleri ikinci kez çöktürmek için ek olarak üç hacim aseton ekleyin.

Pelleti ve ekstraksiyon tamponunu resüspanse ettikten sonra, protein konsantrasyonunu belirleyin ve/veya örnekleri -20 °C'de saklayın. Proteinlerin izoelektrik odaklamasını gerçekleştirmek için, dondurucudan hazır bir IPG şeridi çıkarın ve 10 ila 15 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Örneği vorteksleyin ve 600 ila 800 µg proteini, numune rehidrasyon tepsisindeki bir kanalın arka kenarına, her iki uçta yaklaşık bir santimetre boşluk bırakacak şekilde düz bir hat halinde pipetleyin.

Forseps kullanarak, şeridin sadece uçlarından tutmaya ve jel ile herhangi bir temas kurmamaya dikkat ederek IPG şeridinin plastik kapağını soyun. Şeridin pozitif işaretli ucunu belirleyin ve bunu tepsisinin sol tarafına yerleştirin. IPG şeridini, jel tarafı numunenin üzerine gelecek şekilde yerleştirin.

Alt kısımda hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Bir saat boyunca rehidrasyona bırakın. Şeridin üzerini 2,5 mililitre mineral yağ ile kaplayın.

Tepsiyi bir kapakla kapatın ve gece boyunca yeniden hidrate olmasına izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, odaklama kanalının her iki ucuna birer kağıt fitil yerleştirin ve her birini 10 µL millipore su ile ıslatın. IPG şeridini çıkarın ve yaklaşık 10 saniye boyunca dikey konumda tutun.

Yağı süzmek için, plastik desteklemi bir Kim wipe ile kurulayın. IPG şeridini, temel ucu sola gelecek şekilde jel tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirin. Odaklama tepsisinde, şeridin üzerini 2,5 milliliters mineral yağı ile kaplayın.

Tepsiyi protean IEF hücresine yerleştirin ve varsayılan hücre sıcaklığı 20 °C, şerit başına maksimum akım 50 µA ve rehidrasyon süresi olmadan üç adımlı bir protokol programlayın. Program tamamlandıktan sonra, şeridi jel tarafı yukarı gelecek şekilde 11 cm'lik bir dengeleme tepsisine aktarın. Kanala 4 mL redüksiyon tamponu ekleyin ve şeridi hafifçe çalkalayarak 10 dakika boyunca dengeleyin.

Redüksiyon tamponunu uzaklaştırın, kanala dört mililitre alkilasyon tamponu ekleyin ve şeridi 10 dakika daha çalkalayarak dengeye getirin. IPG şeridini, bir XSDS çalıştırma tamponuna kısa süreliğine daldırarak durulayın. Ardından, şeridi jel yüzeyi yukarı bakacak şekilde 11 santimetrelik bir criterion arka plakasına yerleştirin.

Önceden hazırlanmış %10,5 ila %14'lük tris H-C-L-S-D-S poliakrilamid jeli ve SDS jeli ile tam temas sağlayacak şekilde nazikçe bastırın. İki jel yüzeyi arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. IPG şeridinin üzerine bir mililitre erimiş agar çözeltisi dökün ve beş dakika boyunca katılaşmaya bırakın.

Ardından, tek kuyucuğa beş µL protein markörü yükleyin. Jeli, SDS tamponu içerisinde, oda sıcaklığında veya 4 °C'de 200 volt ile yürütün. Boya önü jelin altına ulaştığında, jeli plastik kalıptan çıkarın ve Coomassie Brilliant Blue içerisinde nazikçe çalkalayarak gece boyunca boyayın.

Jeli, her biri üç saat sürecek şekilde iki kez detein 1 çözeltisinde çalkalayın ve ardından detein 2 çözeltisinde gece boyunca bekletin. Analiz için jeli %7 asetik asitte saklayın. Jelin görüntülenmesinin ardından, jeller arasındaki spot paternlerinin karşılaştırmalı analizini gerçekleştirin ve ilgilenilen spotları kesin; jel tıkaçlarına 200 µL detaining çözeltisi ekleyerek vorteksleyin ve örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.

Ardından çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırıp atın ve işlemi tekrarlayın. Jel tıkaçlarını içeren tüplere, taze hazırlanmış 30 µL indirgeme tamponu ekleyin ve 60 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Numunelerin soğumasını bekleyin.

Ardından tamponu uzaklaştırın ve atın. 30 µL Alkylation buffer ekleyin ve örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin; ardından alkilasyon tamponunu uzaklaştırın ve atın. Her tüpe 200 µL detaining solution ekleyerek jel plug'larını yıkayın ve örnekleri 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

Tutma çözeltisini uzaklaştırıp atın ve yıkama işlemini tekrarlayın. Ardından, jel tıkaçlarına 50 µL asetonitril ekleyin ve büzülerek kurumalarını sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sonrasında asetonitrili dikkatlice uzaklaştırın ve jel parçalarını tekrar toplayın.

Beyaz ve küçük görünmelidir. Jel parçalarının bir konsantratörde 10 dakika boyunca kurumasına izin verin. 10 µL aktive edilmiş tripsin çözeltisi ekleyerek jel parçalarını şişirin.

15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tüplere 25 µL sindirim tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında, çalkalayarak gece boyunca inkübe edin; numuneleri 10 dakika boyunca sonike edin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarmadan önce santrifüjle çöktürün.

Peptitleri daha fazla ekstrakte etmek için, tıkaçlara 10 µL %0,1 formik asit ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin, ardından örnekleri 10 dakika boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Süpernatantı toplayın ve daha önce saklanan süpernatant ile birleştirin. Proteinler daha sonra tuzdan arındırılabilir ve HPLC bağlantılı kütle spektrometrisi için hazırlanabilir; egzersiz yapmamış erkek ve dişi aynalı iskelet kası ekstrakte edilmiş ve iki boyutlu bir haritaya ayrılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme kullanılarak görselleştirilen kas karşılaştırmalı proteomunun ilk seviyesinde, burada görüldüğü üzere her birinde yaklaşık 800 protein spotu tespit edilmiştir. Erkek proteom haritası temel olarak alındığında, dişi proteom spotlarında bolluğu değişen çok sayıda spot olduğu açıkça görülmektedir; dişilerde iki kat veya daha fazla artanlar kırmızıyla, iki kat veya daha fazla azalanlar ise maviyle daire içine alınmıştır. Beş fareden oluşan bir grup (N=5) ile istatistiksel olarak anlamlı olan ve iki kat veya daha fazla artış ya da azalış gösteren protein spotlarının kimlikleri, sıvı kromatografisi ile eşleştirilmiş kütle spektrometrisi kullanılarak amino asit sekans analizi ile belirlenmiştir.

Bu grafikte, x ekseni egzersiz öncesindeki dişi fareleri, Y ekseni ise tek seferlik sıfırıncı saat zaman noktası grubunu temsil etmektedir. Sonuçlar, dişilerin şeker enerji metabolizmasında, enzimlerde ve kaslardaki farklı bir enerji besleme sistemi olan kreatin kinaz enzim izoformlarında belirgin bir azalma gösterdiğini ortaya koymaktadır. Hem insanlarda hem de hayvanlarda, dinlenme halindeyken ve egzersiz sonrası erkek serum CK seviyeleri daha yüksek seyretmektedir; ancak serum CK seviyeleri, miofibriller miktarıyla mutlaka korelasyon göstermemektedir.

Miren biceps brachii kasındaki CK hücre bolluğunda görülen bu cinsiyet dimorfizmi yeni bir bulgudur ve fizyolojik olarak farklı olan serum CK seviyelerini açıklayabilir. Bu prosedürün ardından, sonuçları doğrulamak amacıyla kantitatif immünoblotlama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel proteom profilleme için örneklerin nasıl hazırlanacağı ve ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıyız.