Name: Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin, klinik örneklerdeki antijen-spesifik antikorların fagositik aktivitesini yüksek verimli akış sitometrisi ile nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, floresan boncuklar ve monositik hücre hatları kullanarak standartlaştırılmış bağışıklık yanıtı değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar NIH 3R01AI080289-02S1 ve Harvard Üniversitesi Center NIH / NIAID 2P30AI060354-07 altında AIDS Araştırma Görevlisi Bursu için bir fon kabul etmek istiyoruz.

1. Kültür fagositik hücreler <ol><li> Kültür THP-1 10 hücre RPMI 1640 T matara sabit bir süspansiyon olarak% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. FcγR ifade ve test performansı tutarlı düzeyde korumak için hücre yoğunluğu 0.5x10 6 / ml altında tutulmalıdır. </li></ol> 2. Biotinlenmiş Antijen hazırlayın <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre faiz hedef antijen biotinylate için gerekli sulfo-NHS LC biotin reaktif kiti miktarını hesaplayın. </li><li> Biyotinilasyon reaktif su içinde çözülür ve birincil aminler içermez bir tampon hemen antijen için hesaplanan miktar ekleyin. Reaksiyon, ara sıra karıştırarak, oda sıcaklığında 1 saat süreyle devam etmek için izin verin. </li><li> Küçük kalkan korumak için uygun bir molekül ağırlığı kesme Amicon santrifüj konsantrasyon biriminde tampon döviz fazlalığı, indirekt biotin çıkarınt antijen. Konsantrasyon birimi üst odasına örnek ekleyin ve toplam hacmi 15 ml doldurma çizgisine getirmek için PBS ekleyin. Yaklaşık 1.5 ml hacim getirmek için 4000 xg&#39;de santrifüjleyin. Bu işlemi tekrarlayarak boncuk antijen maksimum kaplama sağlamak için iki kez serbest biotin% 99 kaldıracaktır. </li></ol> 3. Antijen Doymuş Boncuk hazırlayın <ol><li> Iki kere 1, 1 mm floresan neutravidin boncuk 100 ul yıkayın ml% 0.1 PBS-BSA yüksek hızda bir mikrosantrifüj iplik sonra. Yeniden süspanse 10 tüp içine 100 ul PBS-BSA ve kısım boncuk yıkanır. </li><li> Boncuklar doyurabilecek antijen kaplama koşulları belirlemek için, iki kat adımlar biotinlenmiş antijen konsantrasyonlarında değişen yıkanmış boncuk süspansiyonu ile 10 ul birleştirir. Rotator mikrosantrifüj tüp 4 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li></ol> NOT: Doygunluk boncuk, deneysel olarak tespit edilmelidir. Bu yapılabilir, boncuk, sonradan kontrol monoklonal antikor ile opsonized zaman maksimum fagositozda verimi boncuk kaplama koşulları belirleyerek. <ol start="3"><li> Boncuk pelet kadar yüksek hızda 1 ml PBS-BSA ve santrifüj ile yıkanarak bağlanmamış antijen çıkarın. PBS-BSA kaldırın ve tekrar edin. </li><li> Son hacim 1 ml PBS-BSA yeniden süspanse antijen kaplı boncuk. Boncuk 4 ° C kullanımdan önce bir hafta kadar saklanır olabilir. </li></ol> 4. Antikor Örnekleri hazırlayın <ol><li> Klinik antikor örnekleri, plazma, üretici talimatlarına göre bir Kavun jel IgG saflaştırma kiti kullanarak arındırılmalıdır. Saflaştırılmış IgG 4 ° C kullanıma hazır olana kadar saklanabilir. </li></ol> NOT: Uygun önlemler işlenmesiyle ilgili insan numunelerinde her zaman alınmış gerekir. <ol start="2"><li> A280 absorbans antikorlar arıtılmış konsantrasyonu belirlemek ve örnekleri PBS içinde 1 mg / ml seyreltik. </li><li> Varsaymak hazırlayın1 mg / ml PBS seyreltme ive ve negatif monoklonal kontrol antikorlar. </li></ol> 5. Deney Kaplama <ol><li> Vorteks yukarıda hazırlanan yıkanmış, antijen doymuş boncuk çözüm süspanse edin ve yuvarlak bir alt 96 plaka her kuyuya 10 ul aktarmak. Bakım, her bir kuyunun eklenir eşit sayıda floresan boncuk sağlamak için sürekli boncuk süspansiyonu ajitasyon alınmalıdır. </li><li> Her antikor için bir doz-yanıt eğrisi oluşturma, her bir kuyunun ilgi antikorlar konsantrasyonları değişen ekleyin. Optimal konsantrasyonları mevcut antikor titresi bağlı örnekleri arasında farklılık gösterir, ancak 0.01-100 mikrogram / ml final konsantrasyonda bir dizi iyi kapsama sağlamak ve ilgi konsantrasyon aralığı belirlenmesini sağlayacaktır. 20 ul daha geniş hacimli olun antikorları eklenir. </li><li> 37 2 saat inkübe boncuk ve antikor örnekleri ° C antikorları boncuk opsonize için izin vermek. &lt;/ Li&gt; <li> THP-1 hücrelerinin 2.5 x 10 5 hücre / ml süspansiyon hazırlamak, toplam 5 x, her bir kuyunun bu süspansiyon 200 ul 10 4 THP-1 hücreler her iyi. </li><li> 37 ° gecede ° C&#39;de,% 5 sabit bir inkübatör CO 2, yerçekimi üzerinden pelet izin hücreleri ve boncuk. </li></ol> NOT: Sinyal gürültü optimal boncuk belirlenmesinde tarafından geliştirilmiş olabilir: antikoru: THP-1 hücre oranları belirli bir antijen ve antikor kaynağı için. 6. Akış sitometrik analizi <ol><li> Her hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak süpernatant 100 ul çıkarın. Sitokin salgılanması tespitler veya diğer analizler istendiğinde supernatant kaydedilebilir. </li><li> Sabitlenmesi için, her bir kuyu ve pipetlemeyin hücreleri tekrar süspansiyon ve mix 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin. </li><li> Yüksek verim akım sitometri analizi bir HTS plaka okuyucu ile donatılmış bir BD LSR II kullanılarak yapılabilir.</li><li> Program yazılımı her iyi üç kez (100 ul karışımın hacmi) karıştırın ve her numunenin 30 ul, ya da en az 2000 hücre olaylar, analiz etmek. </li><li> FlowJo veya eşdeğer yazılım toplanan veriler analiz edilebilir. Faydalı ölçümlerini boncuk + yüzde floresan hücreler, mevcut fagositik hücrelerin sayısının bir ölçüsüdür sağlar, fagosite boncuk sayısının bir ölçüsüdür sağlar fagositik hücrelerinin yanı sıra floresan içerir. Bu değerlerin çarpılması entegre bir ortalama floresan yoğunluğu, veya iMFI üretir. </li><li> Her fagositik hücre tarafından fagosite boncuk ortalama sayısı 1 boncuk ortalama floresan iMFI bölünmesi ile hesaplanır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Etkilenen ve etkilenmeyen konularda antikor örneklerinin açık bir farklılaşma mevcut olmalıdır. Şekil 1A, HIV negatif bir antikor örnek FACS histogramlartive (siyah eser) ve HIV pozitif (gri iz) konu ve antijen-spesifik antikorların varlığı ile tahrik artan fagositoz göstermektedir. Optimum duyarlılık testinin biotinlenmiş antijen ile boncuk doygunluğu bağlıdır. Şekil 1B farklı miktarlarda antijen ile kaplı boncuklar (bağlayıcı olmayan bir antikor, üçgenler de dahil olmak üzere) 3 kontrol monoklonal antikorlar ile opsonized olduğu gözlenen fagositoz sunar ve bir doyurarak konsantrasyon olarak bu antijeni 2μg antijen / ml boncuk kurar. Bir doz-yanıt eğrisi Şekil 2&#39;de sunulan ve 0,05-5 mg / ml antikor konsantrasyon aralığında fagositoz ikna etmek için tabi antikor örneklerinin diferansiyel kapasitesini gösteriyor. Bu diferansiyel fagositoz titresi veya IgG alt ve glikozilasyon devlet olarak Fc etki alanı özellikleri farklılıklar ya da tahrik olabilir. THP-1 hücreleri i zamanMaged floresan mikroskobu ile, boncuk fagositoz açık bir kanıt yoktur. Şekil 3, antikor opsonized (yeşil) ve non-opsonized (kırmızı) boncuk ile inkübasyon sonra antikor yokluğunda fagositik alımı eksikliği gösteren THP-1 hücreleri hala görüntüleri iki 63x sunar. Zaman atlamalı mikroskopi yapıldığında, floresan boncuk antikor özel fagositik alımı daha da çarpıcıdır (Film 1, 20x büyütme). Önceki iş hücreleri ile ilişkili boncuk içselleştirilmesi onaylamıştır ve birincil monositler ile ilgili deneyler, bu yüksek verim assay (veriler gösterilmemiştir) fagositik puanları (iMFI değerler) ile mutabık kalmışlardır. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 Kalite Kontrol Testi. 1A, bir antikor örnek için HIV negatif bir konu (siyah iz) ve HIV pozitif bir konuda (gri iz) fagositoz Flow sitometri histogramlar.1B: Deneysel örnek bir antijen için en uygun boncuk kaplama koşullarının belirlenmesi. Bir kontrol antikor (üçgen) fagositik aktivite gösterir antijen-spesifik monoklonal antikorlar (daire, kare), boncuk antijen / ul&gt; 2 mg ile kaplı boncuk maksimum fagositoz göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 Fagositoz doz-yanıt eğrisi. Farklı HIV pozitif (tedavi edilen, işlenmemiş, viral replikasyon kontrolü ve anti-retroviral tedavi yokluğunda sergileyen) ve gp120 HIV negatif konular sürücü fagositoz (HIV zarf) kaplı boncuk Klinik antikor örnekleri. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Verimli İçselleştirme. Mikroskopi, non-opsonized boncuk sol kalırken antikor opsonized boncuk (yeşil) içselleştirilmesi teyitution (63x büyütme). Movie 1, antikor-odaklı fagositoz Time-lapse mikroskopi 14 saat boyunca yüksek verim tayininde kullanılan THP-1 hücrelerinin fagositik aktivite görselleştirme yapılır ve izin verir oldu . Yeşil floresan boncuk antikor opsonized, kırmızı floresan boncuk olumsuz bir kontrol sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">film izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Cartron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+activity+of+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+and+polymorphism+in+IgG+Fc+receptor+FcgammaRIIIa+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene.</a> Blood. 99, 754-758 (2002).</li>
<li>Ahmad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+correlation+between+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity-mediating+anti-HIV-1+antibodies+and+prognostic+predictors+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a correlation between antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediating anti-HIV-1 antibodies and prognostic predictors of HIV infection.</a> J. Clin. Immunol. 21, 227-233 (2001).</li>
<li>Hashimoto, G., Wright, P. F., Karzon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza virus-infected cells.</a> J. Infect Dis. 148, 785-794 (1983).</li>
<li>Anthony, R. M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th%09%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Th	.</a> Curr. Opin. Organ Transplant. , (2010).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptors+and+their+role+in+immune+regulation+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fc receptors and their role in immune regulation and autoimmunity.</a> J. Clin. Immunol. 25, 1-18 (2005).</li>
<li>Jefferis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%3A+isotype+and+glycoform+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 1401-1413 (2007).</li>
<li>Halstead, S. B., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viruses+and+mononuclear+phagocytes.+I.+Infection+enhancement+by+non-neutralizing+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody.</a> J. Exp. Med. 146, 201-217 (1977).</li>
<li>Subramaniam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+absence+of+serum+IgM+enhances+the+susceptibility+of+mice+to+pulmonary+challenge+with+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The absence of serum IgM enhances the susceptibility of mice to pulmonary challenge with Cryptococcus neoformans.</a> J. Immunol. 184, 5755-5767 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> J. Immunol. Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1.</a> Int. J. Cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ward, E. S., Ghetie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effector+functions+of+immunoglobulins%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effector functions of immunoglobulins: implications for therapy.</a> Ther. Immunol. 2, 77-94 (1995).</li>
<li>Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J., Golab, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+antitumor+effects+of+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies.</a> Front. Biosci. 16, 277-306 (2011).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptors%3A+their+diverse+functions+in+immunity+and+immune+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Fc receptors: their diverse functions in immunity and immune disorders.</a> Springer Semin. Immunopathol. 28, 303-304 (2006).</li>
<li>Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoform-dependent+conformational+alteration+of+the+Fc+region+of+human+immunoglobulin+G1+as+revealed+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Glycoform-dependent conformational alteration of the Fc region of human immunoglobulin G1 as revealed by NMR spectroscopy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1760, 693-700 (2006).</li>
<li>Anthony, R. M., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+the+IgG+Fc+glycan%3A+the+anti-inflammatory+activity+of+sialylated+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Fcs.+J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel role for the IgG Fc glycan: the anti-inflammatory activity of sialylated IgG.</a> Fcs. J. Clin. Immunol. 30, Suppl 1. S9-S14 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Anthony, R. M., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agalactosylated+IgG+antibodies+depend+on+cellular+Fc+receptors+for+in+vivo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8433-8437 (2007).</li>
<li>Marchette, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+immune+status+on+dengue+2+virus+replication+in+cultured+leukocytes+from+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Effect of immune status on dengue 2 virus replication in cultured leukocytes from infants and children.</a> Infect. Immun. 24, 47-50 (1979).</li>
<li>Fust, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+and+enhancing+antibodies+measured+in+complement-restored+serum+samples+from+HIV-1-infected+individuals+correlate+with+immunosuppression+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Neutralizing and enhancing antibodies measured in complement-restored serum samples from HIV-1-infected individuals correlate with immunosuppression and disease.</a> AIDS. 8, 603-609 (1994).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan tahlil fagositik süreçleri 10 ve plaka bazlı otomatik flow sitometri uzun çalışma için kullanılan bir monositik hücre hattı kullanılarak klinik antikor örneklerinin fagositik aktivitesi yüksek verimlilik analizi sağlar. Bu testte sadece farklı konularda hastalığa özgü antikorlar tarafından tahrik fagositoz farklılıklar çalışma için izin, antijen-antikor altkümelerini tam olarak karakterize etmek için kendi yeteneği diğerleri üzerinde avantajlı değil, aynı zamanda, aynı konuda içinde birden fazla antijen özgüllükleri çalışma. Antikor işe doğuştan efektör hücreleri, monositler ve diğer antijen sunan hücreler de dahil olmak üzere güçlü bir hastalık sonucu 11-13 etkileri ve Fc etki alanı 14-16 Asparagine297 antikor geometri, IgG alt ve glikozilasyon bağlı olarak biyolojik değişken olduğu için, bu yöntem sağlar. kritik bir eylem antikor mekanizmasının değerlendirilmesi. Ayrıca, antikor-medi çünküated fagositoz 7,17,18 enfeksiyonu seyri sırasında bazı patojenler tarafından sömürüldü, bu testte antikor-bağımlı geliştirme sürecinin değerlendirilmesi söz tutan ve potansiyel koruyucu, hem de potansiyel olarak zararlı olarak fagositoz ikili doğasını vurgular antikor aktivitesi. Açıklanan test hasta popülasyonları klinik örneklerinden antikorlar analiz etmek için kullanılan, aynı zamanda aşılananların ve saflaştırılmış IgG yerine serum kullanmak için adapte edilebilir olabilir. Ayrıca, kültür süpernatant fagositoz yanıt sitokin salgılanması analiz edilecek ve özel FCR etkisi belirlenecek fagositik potens tek fark sağlayan, FCR-bloke edici antikorlar kullanarak tespit edilebilir, ancak aşağı akım anlayışı ile, olaylar sinyalizasyon mekanizmasını çözmek ve bu bağışıklık mekanizmasının anlaşılmasını ve rafine yardımcı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Micro Sulfo-NHS-LC-biyotinilasyon Kit EZ-Link </td><td> Thermo Scientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracel-50 membran ile Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi </td><td> Millipore </td><td> UFC905024 </td><td> Filtre birim boyutu antijen boyutuna göre değişebilir </td></tr><tr><td> FluoSpheres NeutrAvidin mikroküreler, 1.0 mm, sarı-yeşil floresan (505/515) etiketli </td><td> Invitrogen </td><td> F-8776 </td><td> Üreticiler, çeşitli renklerde bu ürün üretmek </td></tr><tr><td> Kavun Jel IgG Arıtma Kiti </td><td> Thermo </td><td> 45212 </td><td> Ab örneklerin SDS-sayfası saflığını doğrulamak için alınmalıdır. </td></tr></tbody></table>

klinik antikor Örnekleri fagositik aktivitesi belirlenmesi

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antikor-odaklı fagositoz nişan profesyonel fagositler Fc reseptörleri aracılığıyla ortaya çıkar ve hastalığın yanı sıra her iki boşluk patoloji katkıda bulunabilir. Antikorların değişken etki özellikleri uzun in vivo fonksiyonu için kritik olarak kabul edilmiştir, antikor Fc etki alanları üzerinden doğuştan gelen bağışıklık hücreleri işe yeteneği hem rekombinant bir ortamda, önemli bir faktör olarak etkinliğini giderek takdir haline gelmiştir monoklonal antikor tedavisi yanı sıra, doğal enfeksiyon sırasında ya da 1-3 aşı . Önemlisi, sürekli bir etki alanı olarak isimlendirilmesi rağmen, antikor Fc, etki alanı sabit fonksiyon ve IgG alt sınıf (IgG1-4) ve glikozilasyon 297 4-6 Asparagin az güçlü modüle değildir . Böylece, bu yöntem klinik örneklerde antijen-spesifik antikorların işlevsel farklılıklar çalışma fagositik pot korelasyon kolaylaştırmakantikorların hastalık durumu, enfeksiyona yatkınlık, ilerlemesi, ya da klinik sonuç ential. Ayrıca, bu efektör fonksiyon Fc reseptör odaklı fagositoz 7 ile konak hücre içine patojenler erişim sağlayarak enfeksiyon antikor geliştirmek için belgelenmiş yeteneği ışığında özellikle önemlidir. Ayrıca, immün kompleksler fagositik alımı bağışıklık yanıtı 8 Th1/Th2 kutuplaşma etkisi dair bazı kanıtlar vardır. Burada, biz, diferansiyel IgG alt, Asn297 glukanıdır yapısının yanı sıra, yüksek verimli bir biçimde bağışıklık spesifik antijen-antikor komplekslerini oluşturmak için yeteneği neden olabilir antikor-kaynaklı fagositoz farklılıklar tespit etmek için tasarlanmış bir test tarif . Bu amaçla, 1 mikron floresan boncuk sonra klinik antikor örnekleri ile inkübe floresan antijen spesifik immün kompleksler oluşturmak, antijen ile kaplanmıştır. Bu antibody-opsonized boncuk inhibitör ve etkinleştirme de dahil olmak üzere, birden fazla FcγRs ifade monositik hücre hattı ile inkübe edilir. Testi çıkış fagositik aktivitesi, sitokin sekresyon ve FcγRs kullanım alışkanlıkları, ve bu enfeksiyon ve aşı aracılı koruma 9 hem de bu antikor-bağımlı efektör fonksiyon ayrıştırma farklılıklar için oldukça yararlı bir sistem, standart bir şekilde belirlenir.

Biz reseptörleri sağlayan birden fazla Fc ifade floresan antijen kaplı boncuklar ve monositik hücre hattı kullanan standart bir reseptör kullanımı ve fagositik aktivite tayinleri ve klinik örneklerde antijen-spesifik antikorların fagositik aktivitesini belirlemek için yüksek verimli bir akış sitometrik tahlil mevcut ilgi herhangi bir antijen için tekrarlanabilir moda.

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Antikor kaynaklı fagositoz, profesyonel fagositler üzerindeki Fc reseptörlerinin etkileşimi yoluyla indüklenir ve hem temizlenmeye hem de... katkıda bulunabilir.

Aşağıdaki deneyin amacı, klinik örneklerdeki antijene özgü antikorların fagositik aktivitesini yüksek verimlilikle belirlemektir. Bu işlem, öncelikle karmaşık klinik antikor örneklerinde bulunan antijene özgü antikor fraksiyonunun yakalanmasını sağlamak amacıyla, floresan boncukların seçilen bir antijen ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, fagositik THP-1 hücreleri, iyonize edilmiş floresan boncuklarla inkübe edilir ve ardından hücreler, bağlanan antikorların sayısı ve FC etki alanı özelliklerine bağlı olarak boncukları fagositoz eder.Ardından, numunede bulunan antikorların fagositik aktivitesini nicelleştirmek amacıyla THP one hücrelerinin floresan yoğunluğu, yüksek çıktılı plaka tabanlı akış sitometrisi ile belirlenir. Nihayetinde, numunedeki antijene özgü antikorların, değişken antikor titresi veya fagositik hücrelerde eksprese edilen antikor reseptörleri tarafından farklı düzeylerde tanınma nedeniyle opsonize floresan boncukların diferansiyel alımına dayalı olarak fagositozu indükleme yeteneği değerlendirilebilir. Bu tekniğin, primer fagositik hücrelerin kullanıldığı yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, çıktının artması ve standardizasyonun iyileşmiş olmasıdır.Bu yöntem, farklı aşı rejimlerinin farklı aktivitelerle antikorlar indükleyip indüklemediği gibi, adaptif bağışıklık yanıtının temel immünolojisine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Antikorlar, etkili ve koruyucu bir bağışıklık yanıtının oluşturulmasına önemli bir katkı sağladığından, bu tekniğin etkileri enfeksiyöz hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Biz bu yöntemi, progresif HIV enfeksiyonu ve aşılamadaki antikor aktivitesine dair bilgi sağlamak için kullanmış olsak da, yöntem; fragol antikorların koruma sağlamak yerine hastalığı şiddetlendirebildiği influenza, otoimmünite ve danga gibi diğer hastalık durumlarına da uygulanabilir.Antijeni, primer amin içermeyen bir tamponda seyrelterek başlayın. Ardından, sulfa NHS lc, biyotin reaktifini suda çözün. Sonrasında, hidrate edilmiş reaktifi derhal antijene ekleyin ve karıştırarak oda sıcaklığında bir saat boyunca reaksiyonun gerçekleşmesini sağlayın.Reaksiyon tamamlandığında, tampon değişimi yoluyla fazla konjuge olmamış biyotini uzaklaştırmak için numuneyi bir santrifüj konsantrasyon ünitesinin üst haznesine ekleyin. Şimdi, toplam hacmi 15 mililitre dolum çizgisine getirmek için PBS ekleyin. Son olarak, numuneyi hacim yaklaşık 1,5 mililitreye düşene kadar 4 °C'de beş dakika boyunca 4,000 ×g hızında santrifüjleyin.Serbest biyotinin neredeyse tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için bu adım üç kez tekrarlanır. Bir mikronluk floresan eut tradin boncuklarının 100 µL'sini mikro santrifüjde 5 dakika boyunca 13,000 ×g hızında çöktürdükten sonra, aynı santrifüj prosedürünü takip ederek boncukları 1 mL %0.1 P-B-S-B-S-A içinde yeniden süspande edin ve yıkayın. Ardından, yıkanmış boncuklar 100 µL P-B-S-B-S-A içinde yeniden süspande edildikten sonra, boncukları tekrar 10 adet mikro füed tüpe paylaştırın.Ardından, yıkanmış boncuk süspansiyonunun 10 µL'sini, farklı konsantrasyonlardaki biyotinlenmiş antijenle katlama basamakları şeklinde birleştirin. Daha sonra boncuk ve antijen süspansiyonlarını bir mikrosantrifüj tüpü içerisinde, bir rotatör üzerinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.Süspansiyonları bir mililitre P-B-S-B-S-A ile iki kez yıkayarak bağlanmamış tüm antijenleri uzaklaştırın ve boncuklar çökelene kadar örnekleri daha önce olduğu gibi yüksek hızda santrifüjleyin. Son olarak, klinik antikor örneklerini bir melon gel IgG saflaştırma kiti kullanarak plazmadan saflaştırdıktan sonra, antijen kaplı boncukları bir mililitre P-B-S-B-S-A nihai hacminde yeniden süspande edin. Üretici talimatlarına göre, saflaştırılmış antikorların konsantrasyonunu 280 nm absorbans ile belirleyin.Ardından, pozitif ve negatif monoklonal kontrol antikorları için de numuneler ayırarak antikorları PBS içerisinde mililitrede bir miligram olacak şekilde dilüe edin. Sonrasında, antijenle doyurulmuş boncuk çözeltisini vorteksleyerek resüspande edin ve ardından çözeltiden 10 µL'yi yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın; floresan boncukların her bir kuyucuğa eşit sayıda eklendiğinden emin olmak için boncuk süspansiyonunu sürekli karıştırmaya özen gösterin. Her bir kontrol antikor için, ilgili antikorların değişken konsantrasyonlarını 20 µL'yi geçmeyen hacimlerde her bir kuyucuğa ekleyerek bir doz-yanıt eğrisi oluşturun.Şimdi, antikorların boncuklara bağlanmasını sağlamak için boncuk ve antikor örneklerini, boncuklar hazırlanmadan hemen önce 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Besiyerinde 2,5 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonundaki THP-1 hücre örneğini seyrelterek inkübe edin. Ardından, her birine 200 µL hücre ekleyin.Son olarak, hücreleri antikor kaplı boncuklarla birlikte 37 °C'de ve %5 karbon dioksit içeren sabit bir inkübatörde gece boyunca inkübe ederek hücrelerin ve boncukların yerçekimi ile çökelmesini sağlayın. Ertesi gün, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek her kuyucuktan 100 µL süpernatan çıkarın. Hücreleri 100 µL %4 paraformaldehit ile fikse edin ve ardından hücreleri yeniden süspande etmek ve karıştırmak için pipetleyin.Şimdi plakayı, otomatik veri toplamaya olanak tanıyan yüksek kapasiteli bir akış sitometresinin HTS plaka okuyucusuna yerleştirin. HTHP tek hücresinin floresan yoğunluğu yakalanır ve kaydedilir. Bu floresan yoğunluğu daha sonra, test edilen antikor örneğinin fagositik aktivitesini belirleyen her bir hücre tarafından fagosite edilen boncuk sayısını belirlemek için kullanılır.Etkilenmiş ve etkilenmemiş deneklerden alınan antikor örnekleri arasında net bir farklılaşma olmalıdır. Bu şekilde, HIV negatif bir denekten alınan antikor örneğinin histogramı siyah izle ve HIV pozitif bir denekten alınan antikor örneğinin histogramı gri izle temsil edilmiştir; bu durum, antijen spesifik antikorların varlığının tetiklediği artmış fagositozu göstermektedir.Bu analizinin optimal hassasiyeti, burada görüldüğü üzere boncukların biyotinline edilmiş antijen ile doyurulmasına bağlıdır. Bu antijen için doyurucu konsantrasyonun mikrolitre başına iki mikrogram antijen olduğu belirlenmiştir. Bu doz yanıt eğrisi, denek antikor örneklerinin 0,05 ile beş mikrogram/mL arasındaki antikor konsantrasyonu aralığında fagositozu indükleme konusundaki farklı kapasitelerini göstermektedir.Bu diferansiyel fagositoz, ya titredeki farklılıklardan ya da IgG alt sınıfı veya glikozilasyon durumu gibi FC domain özelliklerinden kaynaklanıyor olabilir. TP one hücreleri floresan mikroskobu ile görüntülendiğinde, boncuk fagositozuna dair net kanıtlar görülmektedir. Antikorla opsonize edilmiş boncukların yeşil ve opsonize edilmemiş boncukların kırmızı olduğu, TP one hücrelerinin inkübasyon sonrası bu durağan görüntüsü, yalnızca yeşil boncukların TP one hücreleri tarafından sitoplazmaya alındığını göstererek antikor yokluğunda fagositik alımın gerçekleşmediğini kanıtlamaktadır.Zaman ayarlı mikroskopi uygulandığında, floresan boncukların antikora özgü fagositik alımı daha da çarpıcı hale gelir. Burada görülen yeşil floresan boncuklar antikor ile iyonize edilmiştir. Kırmızı floresan boncuklar ise negatif kontrolü sağlar. Bu prosedürün ardından, enfeksiyona veya aşılama yanıtına karşı antikor tepkisinin özelliklerine ilişkin ek soruları yanıtlamak amacıyla diğer antikor fonksiyon testleri gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kapasiteli akış sitometrisi kullanarak antikor örneklerinin fagositoz aktivitesinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Klinik kan ve plazma örnekleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve güvenli taşıma prosedürlerine uyulması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

determining-the-phagocytic-activity-of-clinical-antibody-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Nagre, N. ve diğerleri. Alveolar makrofaj fagositoz ve farelerde bakteri temizlemesi. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, IgM ve komplement ile opsonize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleri kullanılarak komplement reseptörü aracılı fagositozun değerlendirilmesini ve ardından fare makrofajları tarafından alınmasını göstermektedir. Fagositoz kapsamı, diaminoflorenin hemoglobin-katalize edilmiş oksidasyonuyla oluşan mavi kromojenik ürünün ölçülmesiyle ölçülür.

Opsonize Kırmızı Kan Hücreleri Kullanarak In Vitro Komplement Aracılı Fagositoz Modellenmesi

Video, Streptococcus pneumoniae ile insan nötrofillerinin bir ko-kültürü kullanılarak in vitro opsonofagositik bir öldürme testini göstermektedir. Antikorlar ve kompleman proteinleri, bakterilerin opsonizasyonunu kolaylaştırarak nötrofillerin bakterileri tanımasını ve öldürmesini sağlar, başarılı nötrofil opsonofagositik aktivite gösterir.

Bakteriyel Patojenlere Karşı Opsonofagositik Öldürme Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bu video, monositler tarafından etiketlenmiş ve opsonize edilmiş Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositleri içeren akış sitometrisi tabanlı bir fagositoz testini göstermektedir. Akış sitometrisi, monositlerdeki floresansı tanımlar ve fagositoz yoluyla opsonize eritrositlerin başarılı bir şekilde tanımlandığını doğrular.

Parazitle Enfekte Eritrositlerin Antikor Aracılı Fagositozunun Ölçülmesi İçin Bir Test

Bu videoda, poli D antikoru opsonize edilmiş R2R2 kırmızı kan hücreleri ile Fcγ reseptör aracılı fagositozu değerlendirmek için periferik kandan birincil monositleri kullanan bir monosit tek katmanlı test gösterilmektedir.

Monosit Tek Tabakalarında Fcγ Reseptörü Güdümlü Fagositozun İncelenmesi İçin Bir Test

Bu video, anne sütü fagositleri tarafından antikora bağımlı hücresel fagositozu (ADCP) ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Bir antijen-antikor kompleksine konjuge edilmiş floresan işaretli mikroküreler, fagositik lökositler tarafından antikora bağımlı hücresel fagositozu indüklemek için anne sütünden izole edilen bir hücre süspansiyonu ile birleştirilir. Hücreler ortak lökosit antijenine (CD45) karşı antikorlarla etiketlendikten sonra, ADCP aktivitesinin seviyesini gösteren mikroküre...

Fagositler tarafından Antikora Bağımlı Hücresel Fagositozu Ölçmek için İn Vitro Test

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Fagozomal pH, fagozom olgunlaşmasını, oksidan üretimini, fagozomal öldürmeyi ve antijen sunumunu etkiler. Burada, floresan mikroskobu kullanarak canlı fagositlerdeki bireysel fagozomlardaki zaman-seyri ve son nokta pH değişikliklerini ölçmek için bir oransal yöntemi açıklıyoruz.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Monosit tek tabakalı test (MMA), Fcγ reseptörü (FcγR) aracılı fagositozu değerlendirmek için memeli periferik tam kanından elde edilen izole primer monositleri kullanan bir in vitro testtir.

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Fc-aracılı efektör fonksiyonları aktivasyonu antikorlar tarafından hedefleyen grip virüsü hemagglutinin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tahlil de Fc-aracılı bağışıklık ikna etmek için monoklonal antikorlar veya poliklonal sera diğer viral yüzey glikoproteinlerin hedefleme yeteneklerini değerlendirmek için adapte edilebilir.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

Transfüzyon tıbbı ve immünolojide kırmızı hücre alloantikorlarının klinik önemini daha iyi tahmin etmeye yardımcı olmak için makrofajların kullanıldığı mevcut monosit-monotabaka testi (MMA) için iyileştirmeler ve güncellenmiş yöntemler geliştirdik. Bu test, monosit-makrofaj testi (M-MA) olarak adlandırılır.

Monosit-Makrofaj Testi Kullanılarak Kırmızı Kan Hücresi Antikor Öneminin Tahmini

Öğrenin, klinik örneklerdeki antijen-spesifik antikorların fagositik aktivitesini yüksek verimli akış sitometrisi ile nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, floresan boncuklar ve monositik hücre hatları kullanarak standartlaştırılmış bağışıklık yanıtı değerlendirmesi sağlar.

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet