Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım & MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Bu deney, protein ile ilişkili hidrojen döteryum değişimini izlemek için kütle spektrometresinin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Aktivasyon durumlarına yol açan yapısal değişiklikler: önce Cleve protein kinaz PAC iki, kaspaz üçlü ve daha sonra PAC iki, substrat olarak bir TP kullanarak otomatik fosforilasyon ile aktive eder, ikinci adım olarak PAC iki'yi Pepin ile sindirir ve Prote PAC'yi analiz eder, tandem kütle spektrometresi ile iki parça, PAC'nin hidrojen döteryum değişim modellerini analiz etmeye devam eder, iki, kalıptan çıkar, her bir PAC'nin süre seviyesinin izlenmesi, iki parça kesindir analiz için küf kullanarak hidrojen döteryum değişim seviyesi. PAC iki'nin kaspaz üç bölünmesi ve otomatik fosforilasyonu hakkında önemli bilgiler sağlayın.

Bu yöntem, protein konformasyonel değişiklikleri, protein ligand etkileşimleri ve protein-protein etkileşimleri gibi protein dinamikleri sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin HD değişim LCQ kütle spektrometresi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı araçsaldır. Bu prosedür, HD değişim sonuçlarını analiz etmek için HPLC'ye bağlı bir kütle spektrometresi gerektirmez ve prosedürün çalıştırılması kolaydır 0.6 mikrogram PAC iki.

Kaspaz üç ekleyin ve reaksiyonu 34 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ürünlerin SDS sayfasına göre analiz edilmesiyle PAC iki ve PAC iki'nin tam bölünmesini doğrulayın. Aktivasyon reaksiyonu için, bölünmüş paketi iki ila 20 mikrolitre aktivasyon tamponu B ekleyin ve 34 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

P 34 ve P 27 fragmanlarının migrasyonu ile otomatik fosforilasyonu doğrulamak için SDS sayfasını kullanın. İlk olarak, pürin konjuge aro hızlarını bir mililitre% 0.1 Tri floro asetik asit ile iki kez yıkayın, mililitre başına 10 miligram iki mikrolitre seyreltin. 100 mikrolitrede% 0.1 TFA'da iki tane paketleyin, konjuge agro boncuklara 30 mikrolitre yıkanmış Pepsi ekleyin ve beş dakika inkübe edin.

Ters fazlı bir H-P-L-C-C 18 kolonunu pH 2.5'te %0.1 TFA ile dengelemeye devam edin. Şimdi Pepin Digest'i yükleyin ve 100 dakikalık doğrusal bir gradyan kullanarak seyreltin. HPLC fraksiyonlarını bir speed VAC reus ile kuruttuktan sonra her iki dakikada bir fraksiyonları toplayın.

Numuneleri beş mikrolitre aseto nitril ve pH 2.5'te %0.1 TFA içinde askıya alın. Başlangıç ekranı olarak. Peptitler için her bir fraksiyonu, peptit içeren tüm fraksiyonlar için küflü olarak analiz edin.

Parçaları tandem kütle spektrometresi ile tanımlayın. PAC iki'nin birincil dizisine dayalı olarak yavru iyonları ve teorik MZ oranlarını eşleştirmek için protein arayıcısında MS ürün fonksiyonunu kullanın. İlk olarak, hidrojen döteryum değişimi için tüm çözeltileri ve reaktifleri dengeleyin.

Mililitre başına 10 miligramlık iki mikrolitreye 18 mikrolitre tampon D iki O ekleyerek hidrojen döteryum değişimini başlatın. İkinci paket, reaksiyonları bir zaman çizelgesi boyunca üç kopya halinde gerçekleştirin. Hidrojen döteryum reaksiyonunu pH 2.2'de 180 mikrolitre buz gibi soğuk %0.1 TFA ile söndürün.

Şimdi 100 mikrolitre hidrojen döteryum alikotu dağıtın. Her 30 mikrolitre aktif pepin konjuge agrega boncuklarına iki tane paketleyin. Bu pepin sindirimini buz üzerinde beş dakika inkübe edin.

Her 30 saniyede bir girdaplama, Pepin'i hızlı bir şekilde çıkarmak için santrifüjleme ile sindirim reaksiyonlarını etkili bir şekilde sonlandırır. Küflü analiz için numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Matrisi hazırlayın ve sıfır santigrat derecede saklayın, her numuneyi hızlı bir şekilde kısmen çözün.

Bir mikrolitre numuneyi bir mikrolitre matris ile karıştırın, ardından küflü analizden 30 saniye önce dört santigrat derece küflü bir hedef plaka üzerinde tespit edin. Kuruması için plakaya orta derecede bir vakum uygulayın. Lekeler, iki dakika içinde ortalama 100 taramadan kütle spektrumuna küflü hale gelmeye devam ediyor.

Her parçanın süresini hesaplamak için Veri Gezgini 4.0 bilgisayar programını kullanmaya devam edin. Daha sonra, 24 saatlik hidrojen döteryum değişimindeki bir sayıya bağlı olarak fiili dahil edilenin, uç terminal amid hariç, omurga amidleri olan tüm olası değiştirilebilir bölgelere bölünme oranına dayalı olarak geri değişimi hesaplayın. Bu örnekte, CASP Bay'in bölünmesi ve otomatik fosforilasyonu, SDS sayfası Kumasi boyaması ile doğrulanmıştır.

Fosforile edilmemiş aktif olmayan PAC iki, 58 kilodaltonluk CASP körfezinden oluşan tek bir banttır. PAC iki'nin bölünmesi tamamlanmıştır ve iki parça üretir, P 27, düzenleyici alan ve P 34, otomatik fosforilasyonu takiben katalitik alan. Oto-fosforile P 27 ve P 34'ün migrasyonu, fosforile olmayan paket ikiye kıyasla tamamen fosforile P 27 fragmanının gecikmiş migrasyonu nedeniyle protein jeli üzerinde bir örtüşme gösterir.

Bu kütle spektrumu, aktif olmayan PAC iki için döteryum dahil etme zaman seyrini gösterir. MZ tepe noktası 1697.85, kütle zarfının kayması ile gösterildiği gibi çoklu izotopik tepelerden oluşur. Zamanla, kırmızı noktalı çizgi, kütle zarfının ortalamasını gösterir ve kütle zarfının kayması, bir peptitin bir kez ustalaştıktan sonra süresini gösterir.

Bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa iki gün içinde tamamlanabilir. Sıvı nitrojenle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle sıvı nitrojenlere koymadan önce 1,5 mil EOL tüpünün kapağına bir delik açmak gibi önlemler alın.