Name: Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım and MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Öğrenin, Pak2 aktivasyonunda hidrojen/deuterium alışverişini MALDI-TOF kütle spektrometresi ile izleme yöntemini. Bu teknik, protein dinamikleri ve konformasyonel değişiklikler hakkında önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe GM-26.738 Enstitüleri (JAT) kısmen desteklenmektedir.

1. Pak2 Etkinleştirme <ol><li> 12 mg / ml Pak2 &#39;lik 20 ul tampon kaspaz 3 uygun önceden test edilmiş bir miktar ekleyin (pH 7.5, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl ve 2 mM DTT) ve 34 inkübe ° C 30 dakika tam tutunmaya ve etkinleştirmek Pak2. </li><li> SDS-PAGE (% 10) ve Coommassie mavi boyama parçalanma ürünleri analiz edin. </li><li> 20 ul 10 mg / ml Pak2 &#39;lik bir nihai konsantrasyonu, pH 7.5 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) aktivasyon tampon B bölünmüş Pak2 ekleyin ve 34 inkübe ° C&#39;de 30 dakika süreyle tam 8 siteleri otofosforilasyon tarafından Pak2 etkinleştirmek için. </li><li> SDS-PAGE 10 tarafından belirlenen P34 ve p27 parçaları göç Pak2 tam bölünme onaylayın. Otofosforilasyon koşullarının uygun doğrulama phosphopeptides tespit etmek (32 P) ATP veya kütle spektrometresi kullanarak ayrı bir deney otoradyografi yoluyla yapılır. </li></ol> 2. KimlikPak2, Pepsin-özet Fragments <ol><li> Önce agaroz boncuk kullanımı için iki kez yıkamak için pH 2.5% 0.1 Trifluroacetic Asit (TFA) 1 ml ekleyin. Sonra, boncuk kaldırmak için 15 sn 2.000 xg&#39;de örnekleri santrifüj. </li><li> % 0.1 TFA 100 ul Pak2 (150 mM NaCl 2 ul içinde 20 mg, pH 7.5, 50 mM Tris-HCl ve 2 mM DTT) ekleyin ve 5 dakika boyunca örnek pepsinojenin konjuge agaroz boncuk 30 ul inkübe . </li><li> PH 2.5,% 0.1 TFA birincil bir çözücü sistemi ile ters faz HPLC C18 kolon dengelenmesi. 0.2 ml / dak akış hızında% 80% 0.1 TFA içeren asetonitril - pepsin sindirimi (50 ul) 0 100 dk doğrusal bir degrade kullanarak kolonda sürüklenecektir. Kesirler her 2 dakikada toplanır. </li><li> (3 saat) hızlı elektrikli süpürge ile HPLC kesirler Kuru ve asetonitril (5 ul) ve pH 2.5,% 0.1 TFA (5 ul) bir çözüm örnekleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Başlangıçta, her fraksiyon peptidler için MALDI-TOF PerSeptive Biyosistem Voyager DE STR (PE Bi kullanarak gösterildi.osystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Peptidler içeren 16 fraksiyonları tandem kütle spektrometresi parçaları belirlemek için Q-TOF kütle spektrometresi ve bir QSTAR XL oMALDI MS / MS kullanarak tabi tutulur. </li><li> Her peptid dizisi Protein Prospector web sitesi (kullanarak Pak2 birincil dizisi dayalı teorik m / z oranları ile tandem kütle spektrometresi tarafından üretilen ürün iyonları tarafından doğrulanmadı <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Amid H / D Exchange ölçümü <ol><li> 25 H / D değişimi için gerekli tüm çözümler ve reaktifler ° C su banyosunda tutun. ATP suda çözülür ve pH kullanmadan önce 7.0 &#39;ye ayarlanır. D 2 O tampon ek 4mm ATP seyreltme sonra Pak2 ayrı ATP önlemek için. </li><li> (20 mg 2 ul ile 18 ul tamponlu D 2 O (50 mM MOPS pH 6.98, 125 mM NaCl) eklenmesi ile H / D değişimi başlatın), 150 mM içeren bir tampon olarak Pak2 NaCl, 0 ile 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 2 mM Pak2 seviyesi 10 mg / ml &#39;lik bir DTT ve pH 7.0 ° C </li><li> H / D karşılığında üç nüsha olarak 0, 0.5, 1, 3, 5 ve 10 dakika ya da 24 saat için numunelerin inkübe </li><li> H / D değişim süreci, pH 2.2, 200 ul nihai hacmi 2.5 pH getiriyor buz% 0.1 TFA 180 ul ekleyerek Quench. ATP, pH 2.2 buz 0.11% TFA 180 ul içeren numuneler için 2,5 pH söndürülür durumu korumak için kullanılır. </li><li> 30 ul aktif pepsinojenin-konjuge agaroz boncuk her söndürülür örnek bir kısım (100 ul) ekleyin. Pepsin sindirim beş dakika süreyle buz üzerinde devam etmesine izin verilir ve örnekleri her 30 saniyede bir vortekslenmiş. </li><li> 4 5.000 xg&#39;de 15 sn için örnek santrifüj sindirim Terminate ° C pepsin kaldırmak için. </li><li> Hızla en fazla 2, -80 ° C&#39;de sıvı N 2 ve mağaza örnekleri dondurmakMALDI-TOF analizi önceki gün. </li><li> MALDI için matris 5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic asetonitril, etanol ve% 0.1 pH 2.5 TFA bir çözüm (01:01:01) çözülür ve 0 ° C&#39;de yapılan asit (CHCA) </li><li> Kısmen hızlı bir şekilde her bir örnek Çözülme ve her numunenin 1 ul ul 4 ° C MALDI hedef plakası matris ve spot 1 ile karıştırın. </li><li> MALDI-TOF analizi için 30 sn önce lekeler kuru plaka ılımlı bir vakum uygulayın. Örnek ve spektrum alma çözülme arasındaki süre yaklaşık 3 dk. </li><li> PerSeptive Biyosistem Voyager DE STR MALDI-TOF kütle spektrumları edinin. 20.000-V hızlandırma voltaj ve% 65 şebeke voltajı 180 ns darbe gecikme ile gecikmeli çıkarma kullanarak, 100.000 veri kanalları az 2 GHz örnekleme hızında veri edinin. 2 dakika içinde yüz taramaları ortalaması alınır. MALDI-TOF cihazı herhangi bir marka ya da herhangi bir özel yazılım ile sınırlı değildir. </li><li> Calcul için Data Explorer 4.0 bilgisayar programı kullanınher parçasının dötertumlanma yedik. </li><li> Arka döviz omurga amidler N-terminal amid (Şekil 1) hariç tüm olası değiştirilebilir siteleri, bölünmüş H / D değişimi 24 saat gerçek dahil deuteron sayısı oranına göre hesaplayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Kaspaz bölünme ve otofosforilasyon SDS-PAGE Commassie boyama ile doğrulanır. İnaktif Pak2 58 kDa tek bir bant. Pak2, kaspaz bölünme tamamlandığında, ve ayrıca göç, p27 ve P34 iki parça üretir. Autophosphorylated p27 ve P34, tam fosforile p27 parçası (Şekil 2) geriliği göç nedeniyle jel bir örtüşme gösterir göç . H / D döviz deneyler, 0 ile 10 dakika (Şekil 3) arasında birden çok kez yapılmaktadır . Bir örnek olarak, m / zp içine döteryum esas zamanlı kursinaktif Pak2 EAK 1697,85 zamanla kitlesel zarfın vardiya tarafından gösterildiği gibi birden fazla izotop zirvelerinden oluşmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Şekil 1 dötertumlanma hesaplanması için denklemi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Şekil 2 otofosforilasyon ve Pak2 kaspaz bölünme. Kaspaz-cleaved Pak2 (sol şerit), bozulmamış inaktif Pak2 (orta şerit) ve kaspaz-cleaved autophosphorylated Pak2 (sağ şeritte), SDS-PAGE ve Coommassie mavi boyama ile analiz edildi. Hsu, YH ve ark 2 &#39;den uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Şekil 3, inaktif Pak2 döteryum esas bir zaman dersin Mass Spektrum . İnaktif Pak2 H / D excha maruz kaldı0-10 dakika nge ve MALDI-TOF ile analiz. H / D değiş zaman seyri sırasında tepe m / z 1697,85 MALDI-TOF genişletilmiş izotop dağılımı bir örnek gösterilmiştir. Kırmızı noktalı çizgi, kitle zarfın ortalama kitle zarfın kayma gösterir ve bir peptid dötertumlanma gösterir.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Pepsin özet Fragments Kimlik H / D değişim deney kritik bir adımdır. Peptid yanlış kimlik yanlış bir sonuca yol açabilir. Pepsin-sindirilmiş Pak2 temiz bir arka plan elde etmek için ters faz HPLC C18 kolon ile yıkandı,. Deneylerde, toplam 40 kesirler bir toplandı ve MALDI-TOF tabi. Çoklu peptidler kesirler her tespit olabilir. Peptidler dizileri tanımlamak için tandem kütle spektrometresi (Q-TOF MS / MS ve oMALDI MS / MS) tabi tutuldu. Bir peptit MS / MS spektrumları peptid kimlik doğrulamak için en az üç ürün iyonları olmalıdır. Data Explorer 4.0 bilgisayar programı (Uygulamalı Biyosistem) ilk temel düzeltme ve gürültü filtreleme yapar. Her spektrumu iki sıralı tepeleri üzerinde göre kalibre edilmelidir. 923,45 ve 1697,84 undeuterated m / z ile teorik kütle spektrumu kalibre edin. To kitle doğruluğu kalibrasyon sonra 10 sayfaya ulaşabilirsiniz. Dötertumlanma üzerine, mono-izotop daha yüksek bir kitle kayabilir. Üniter adım bu m / z oranları artar dötertumlanma ile ilişkili gelişmiş kitlelerin vermiştir. Kitle zarfın pik şiddetleri dötertumlanma düzeyini etkilemez. Ancak, belirli bir kitle zarf içinde izotopik zirvelerinden pik şiddetleri ortalama kütlesinin hesaplanması için kritik öneme sahiptir. Dahil deuteron hesaplama ilk adım döteryumlanmış örneği olmayan döteryumlanmış bir örnek peptid kütle çıkartmaktır. Diğer üç faktör, D 2 O seyreltme, yan zincirleri ve arka döviz kalan deuterons, daha fazla (Şekil 1) hesaplanmasında dikkate alınması gerekir. D 2 O seyreltme sonra D 2 O örnek karıştırma ve D 2 O tampon H / D değişimi başlatmak için seyreltme faktörü. Pepsin-digest yan zincirleri artık deuteron (% 4.5)ed peptidler çıkarılır gerekir. Arka değişim kitle ölçüm sürecinin tüm döteryumlanmış ve pepsin-sindirilmiş peptidler dötertumlanma kaçınılmaz kaybı. H / D değişimi 24 saat sonra en solvent erişilebilir peptid (m / z = 1105,60) tam bir dötertumlanma bölgede temsil eder. Peptidlerin her biri için dahil deuteron sayısı, döteryumlanmış ve non-döteryumlanmış Pak2 peptik peptidlerin ağırlık merkezi arasındaki farktır. En çok döteryumlanmış peptid m / z 1105 Pak2 H / D değişimi 24 saat iken dötertumlanma temsil etmek üzere seçildi. Geri Alım Satım Oranı peptid m / z 1105 tüm olası değiştirilebilir siteleri tarafından bölünmüş H / D değişimi 24 saat gerçek dahil deuteron sayısına göre hesaplandı.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic asit </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE str </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF kütle spektrometresi </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0 bilgisayar programı </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

pak2 etkinleştirme amid hidrojen / döteryum alım satım &amp; maldi-tof kütle spektrometre analiz

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Kütle spektrometresi ile birlikte Amid hidrojen / döteryum değişimi (Y / D değişimi), yaygın olarak,, protein-protein etkileşimleri, protein konformasyonel değişiklikler, protein dinamiği ve protein-ligand etkileşimleri arayüz analiz etmek için kullanılır olmuştur. H / D değişimi omurga amid pozisyonları, kütle spektrometresi 1,2,3, bir protein mikro-bölgeler dötertumlanma oranlarını ölçmek için kullanılmıştır. Bu yöntemin çözünürlük normalde 3-20 artıkları aralığı peptidler ilgi döteryumlanmış protein pepsin sindirim bağlıdır. Çözünürlük kütle spektrometresi ile ölçülen H / D değişimi NMR, kütle spektrometresi H / D değişim ölçüm farkı çekirdekli Tek Kuantum Tutarlılık (HSQC) yöntemi ile ölçülen tek kalıntı çözünürlüğü daha düşük olmasına rağmen boyutu ile sınırlı değildir protein 4. H / D değişimi protein konformasyonu korur sulu bir çözelti içinde yürütülmektedir. Biz bir yöntem sağlamak olduğunu utilHPLC / ESI (elektrosprey iyonizasyon)-MS sistemi 5,6 yerine 2 için algılama MALDI-TOF, izes. MALDI-TOF bu durumda protein kinaz Pak2 (γ-Pak da denir), sindirilmiş protein peptidler için doğru kütle yoğunluğu verileri sağlar. Pak 2 Proteoliz bir çevrimdışı pepsinin sindirim gerçekleştirilir. Kullanıcı erişim, kütle spektrometresi bağlı bir HPLC ve pepsin sütun veya HPLC pepsin sütununda, örneğin ağır disülfit gümrüklü salgılanan Fosfolipaz A 2, optimal bir sindirim harita sonucu değildir bulunmamış Bu alternatif bir yöntem, (SPLA 2). Bu yöntemi kullanarak, başarılı kaspaz 3 bölünme ve otofosforilasyon 7,8,9 Pak2 aktivasyonu sırasında dötertumlanma düzeyinde değişiklikler izlenir.

MALDI-TOF kütle spektrometresi başarıyla protein kinaz Pak2 aktivasyon amid hidrojen / döteryum değişimini izlemek için kullanılmıştır.

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş amid hidrojen/dutyum değişimi (H/D değişimi), protein-protein arayüzünün analiz edilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır...

Bu deney, proteinlerle ilişkili hidrojen-deteryum değişimini izlemek için kütle spektrometrisinin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Aktivasyon durumlarına yol açan yapısal değişiklikler için, ilk olarak protein kinaz PAK2 caspase-3 ile kesilir ve ardından ikinci bir adım olarak ATP'yi substrat olarak kullanarak otofosforilasyon yoluyla PAK2 aktive edilir; ardından PAK2, Pepsin ile sindirilir ve PAK2 proteom fragmanları tandem kütle spektrometrisi ile analiz edilir. Her bir PAK2 fragmanının döteryum düzeyinin izlenmesiyle PAK2'nin hidrojen-deteryum değişim paternlerini analiz etme işlemine geçilir. MALDI analizi kullanılarak hidrojen-deteryum değişiminin kesin düzeyi belirlenir. Bu yöntem, PAK2'nin caspase-3 ile kesilmesi ve otofosforilasyonu hakkında önemli bilgiler sağlar.Bu yöntem; protein konformasyonel değişimleri, protein-ligand etkileşimleri ve protein-protein etkileşimleri gibi protein dinamiğine dair soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, HD değişimi LCQ kütle spektrometrisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı cihazsal düzeydedir. Bu prosedür, HD değişimi sonuçlarını analiz etmek için bir HPLC bağlantılı kütle spektrometresine ihtiyaç duymaz ve 0,6 µg PAC two parçalamak için kullanımı kolaydır.Kaspaz 3 ekleyin ve reaksiyonu 34 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. SDS-PAGE ile ürün analizi yaparak PAC 2'yi ve PAC 2'nin tamamen kesildiğini doğrulayın. Aktivasyon reaksiyonu için, kesilmiş PAC 2'yi 20 µL aktivasyon tamponu B'ye ekleyin ve 34 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.P 34 ve P 27 fragmanlarının migrasyonu ile autofosforilasyonu doğrulamak için SDS-PAGE kullanın. Öncelikle, purin konjuge agro boncukları iki kez 1 mL 0,1% trifloroasetik asit ile yıkayın; 10 mg/mL Pac2'den iki µL'yi 100 µL 0,1% TFA içinde seyrelttirin. 30 µL yıkanmış Pepsin konjuge agro boncuğu ekleyin ve beş dakika inkübe edin.pH 2.5'te %0,1 TFA ile ters faz H-P-L-C-C 18 kolonunu dengelemeye geçin. Şimdi Pepin Digest'i yükleyin ve 100 dakikalık lineer bir gradyan kullanarak seyreltin. HPLC fraksiyonlarını speed VAC reus ile kuruttuktan sonra her iki dakikada bir fraksiyonları toplayın.Numuneleri beş µL asetonitril ve pH 2.5'te %0.1 TFA içerisinde süspande edin. Bir ön tarama olarak, her fraksiyonu peptid varlığı açısından analiz edin ve peptid içeren tüm fraksiyonları belirleyin.Fragmanları tandem kütle spektrometrisi ile tanımlayın. Daughter iyonları ve PAC iki'nin primer dizisine dayalı teorik MZ oranlarını eşleştirmek için protein prospector'daki MS product fonksiyonunu kullanın. Öncelikle, hidrojen-döteryum değişimi için tüm solüsyonları ve reaktifleri dengeleyin.18 µL tampon D₂O'yu 10 mg/mL'lik 2 µL örneğe ekleyerek hidrojen döteryum değişimini başlatın. Reaksiyonları, bir zaman seyri boyunca üç paralel olarak gerçekleştirin. Hidrojen döteryum reaksiyonunu, pH 2.2'de 180 µL buz gibi soğuk %0,1 TFA ile durdurun.Şimdi 100 µL'lik hidrojen döteryum alikotlarını dağıtın. Her 30 µL aktive edilmiş pepsin konjugatlı agregat boncuğuna iki adet paketleyin. Bu pepsin sindirimini buz üzerinde beş dakika inkübe edin.Sindirime tepkimelerini etkili bir şekilde sonlandırmak için her 30 saniyede bir vorteksleyin ve ardından Pepini hızla uzaklaştırmak için santrifüj yapın. Numuneleri, analiz edilinceye kadar sıvı azot içerisinde dondurun. Matrisi hazırlayın ve sıfır derece santigrat Celsius'ta saklayın, ardından her bir numuneyi hızlıca kısmen çözdürün.Bir mikrolitre numuneyi bir mikrolitre matris ile karıştırın, ardından analizden 30 saniye önce dört derece santigrat sıcaklıktaki MALDI hedef plakasına damlatın. Kurutmak için plakaya orta derecede vakum uygulayın. Lekeler, iki dakika içinde ortalama 100 tarama ile MALDI kütle spektrelerini almaya devam eder.Her bir fragmanın süresini hesaplamak için Data Explorer 4.0 bilgisayar programını kullanmaya geçin. Ardından, 24 saatlik hidrojen döteryum değişimindeki gerçek yerleşmiş miktarın, uç terminal amit hariç ana zincir amitleri olan tüm olası değişimli bölgelere oranına dayanarak geri değişimi hesaplayın. Bu örnekte, CASP Bay'in parçalanması ve oto-fosforilasyonu, SDS page Coomassie boyaması ile doğrulanmıştır.Fosforile olmamış inaktif PAK2, 58 kilodaltonluk tek bir bant şeklinde görülür. PAK2'nin parçalanması tamamlanır ve otofosforilasyonun ardından düzenleyici bölge olan P27 ile katalitik bölge olan P34 şeklinde iki fragman oluşur. Otofosforile olmuş P27 ve P34'ün migrasyonu, tam fosforile olmuş P27 fragmanının fosforile olmamış PAK2'ye kıyasla migrasyonunun gecikmesi nedeniyle protein jelinde bir örtüşme gösterir.Bu kütle spektrumu, inaktif PAC two için döteryum inklüzyonunun zaman seyrini göstermektedir. 1697.85 m/z piki, kütle zarfının kaymasıyla gösterildiği üzere çok sayıda izotopik pikten oluşmaktadır. Zamanla, kırmızı noktalı çizgi kütle zarfının ortalamasını belirtmekte ve kütle zarfındaki kayma, bir peptidin sentezlenme süresini göstermektedir.Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında iki gün içinde tamamlanabilir. Sıvı azotla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle, 1,5 ml EOL tüpünü sıvı azota yerleştirmeden önce kapak kısmına bir delik açmak gibi önlemler alın.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Protein yapı ve dinamikleri protein yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için anahtardır. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte hidrojen alış veriş proteinlerin konformasyonel dinamiklerini incelemek ve temas arayüzler ve allosterik etkileri de dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimleri, karakterize için çok yönlü bir yöntemdir.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Lanthipeptide sentezleri peptit doğal ürünlerin biyosentezi sırasında katalizör multistep reaksiyonları. Burada, lanteptid sentezlerinin konformasyonel dinamiklerini ve peptit doğal ürün biyosentezinde yer alan diğer benzer enzimleri incelemek için bunların kullanılabileceği sürekli, aşağıdan yukarıya, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) iş akışını açıklıyoruz.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Öğrenin, Pak2 aktivasyonunda hidrojen/deuterium alışverişini MALDI-TOF kütle spektrometresi ile izleme yöntemini. Bu teknik, protein dinamikleri ve konformasyonel değişiklikler hakkında önemli bilgiler sağlar.

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım & MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Daha fazla video keşfet