Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Bu prosedürün genel amacı, nöral krest hücrelerinin göçünü ve kaderini izlemek için bir bıldırcın embriyosundan bir dorsal nöral tüp ekplanını aşamalı olarak eşleşen bir tavuk embriyosuna aşılamaktır. Bu, nöral tüpe erişmek için önce konakçı tavuk embriyosunun IGN zarında küçük bir delik açılarak gerçekleştirilir. Donör bıldırcın embriyosu daha sonra greft eksizyonu için hazırlamak üzere yumurtasından çıkarılır.

Bir sonraki adımda, ilgilenilen bölge konakçı embriyonun nöral tüpünden çıkarılır. Benzer bir bölge daha sonra greftleme için donör nöral tüpten çıkarılır. Daha sonra, donör nöral tüp, konakçı nöral tüpe nakledilir.

Son olarak, kimerik embriyo, tercih edilen organda nöral krest gelen hücrelerin tespiti için istenen aşamaya kadar inkübe edilir. Sonuç olarak, donör kaynaklı nöral krest hücrelerinin konakçı embriyonun çeşitli yerlerine göçü ve farklılaşması, immünofloresan mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü mikro diseksiyon ve greftleme adımları çok ince motor beceriler gerektirir ve bu da öğrenilmelerini zorlaştırır.

Civciv yumurtalarındaki kalıntıları ılık suyla yıkayarak başlayın. Yumurtaları bir tepsiye yatay olarak yerleştirin ve ardından embriyonun lokalize olacağı bölgeyi belirtmek için kenarları yukarı bakacak şekilde kurşun kalemle işaretleyin. Donör embriyoların X ovo hazırlanması için, bıldırcın bacaklarının künt tarafını kuluçkaya yatırın.

Ardından, yumurtaları 38 santigrat derece nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine yerleştirin ve sallanma işlevini açın. Yumurtalar bittikten sonra, kuluçkaya yatırın, üstleri %70 etanol püskürterek sterilize edin ve ardından bir kim mendiliyle hızlı bir şekilde silin Yumurtadan herhangi bir emilimi önlemek için, sterilize edilmiş her yumurtayı, burada görülen katlanmış Kim mendilleriyle kaplı Petri kabına benzer şekilde ayrı bir yumurta tutucusuna yerleştirin. Daha sonra sterilize edilmiş AA forseps kullanarak, yumurtanın sivri ucundaki yumurta kabuğunun üst yüzeyine küçük bir delik açın.

Beş mililitrelik bir şırıngayı 18 buçuk gauge hipodermik iğne ile donatın. Daha sonra eğim yumurtanın sivri ucuna bakacak şekilde iğneyi yumurta kabuğundaki deliğe dikey olarak sokun. Emme yoluyla yumurta sarısına kazara zarar vermemek için, deliği daha önce olduğu gibi %70 etanol ile temizleyin ve deliği bantla kapatın.

Daha sonra çift A forseps ile, yatay bacağın işaretli üst yüzeyine, tam olarak tepede değil, başka bir delik açın. Ardından, kavisli iris forsepslerinin bir tarafını yumurtaya paralel deliğe yerleştirin. Kabuk daha sonra kabuğu sıkıştırın ve dairesel bir hareketle çalışın.

Tavuk yumurtasında iki santimetre çapında bir pencere kırın, kabuğu çıkarılan yumurta kabuğunu atın. Embriyo, yumurta sarısının üstünde opak bir disk olarak görünmelidir. Yumurta sarısının yüzeyinde küçük beyaz bir nokta veya blaster derminin yokluğu ile tanımlanan döllenmemiş yumurtaları atın.

Şimdi uygun göz koruması takarken, 26 buçuk gauge hipodermik iğneyi iğnenin tabanından başlayarak 45 derecelik bir açıyla bükün. Bükülmüş iğne eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde bir mililitrelik bir şırıngaya taktıktan sonra, iğneyi seyreltilmiş Hindistan mürekkebi ile doldurun. Yumurta sarısı zarını blasterin çevresinin dışına delin ve iğnenin ucunu embriyonun altına, yumurta sarısının yüzeyine yakın, ancak embriyonik katmanlara değil.

Daha sonra embriyonun ana hatlarını çizmek için yeterli miktarda mürekkep enjekte edin ve herhangi bir baloncuk enjekte etmekten kaçının. İğneyi dikkatlice geri çekin. Şimdi bir stereo mikroskop ve burada gösterilen fiber optik deveboynu lambası gibi sınırlı bir ısı yüküne sahip bir ışık kaynağı kullanıyor.

Embriyoları hamburger ve Hamilton'a göre sahneleyin. Sahneyi yumurta kabuklarının üzerine kaydedin. Daha sonra dehidrasyonu ve kontaminasyonu önlemek için embriyoların yüzeyine iki ila üç damla ılık steril zil çözeltisi uygulayın.

Ardından, pencereleri geçici olarak kapatmak için yumurtaların yüzeyine para film gerin. Daha sonra bıldırcın yumurtasını nakil için hazırlayın. Yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarmadan önce, bir Petri kabını zil çözeltisi ile doldurun.

Daha sonra embriyoyu ortaya çıkarmak için künt taraftaki yumurtaları kavisli forseps ile açın. Diseksiyon makası kullanarak, tüm kesiklerin buluştuğundan emin olarak, vili zarı ve embriyonun dışındaki blaster derm boyunca kare şeklinde dört kesim yapın. Daha sonra kavisli iris forsepsleri kullanarak, bir kesik kenarı nazikçe kavrayın ve embriyoyu yumurtadan kaldırın ve hazırlanan petri kabına aktarın.

Son olarak, vitellin zarını beş numaralı forseps ile nazikçe çıkarın ve ardından embriyoları diseksiyon mikroskobu altında sahneleyin. Para filmi konakçı civciv embriyosundan çıkarın. Daha sonra keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesi kullanarak, nöral tüpün istenen bölgesinde VII zarında küçük bir delik açın.

Embriyoya bir damla zil çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bu videoda gerçekleştirilen gibi tek taraflı greftler için, lümenin ötesine uzanmadan, nöral tüpün orta beyin bölgesine dikkatlice enine rostral ve kordal kesiler yapmak için dökülmüş bir cam iğne kullanın. Daha sonra dorsal nöral tüp ile parial mezoderm arasında iki taraflı olarak kesin.

Son olarak, eksize edilen ex explan'ı nöral tüpten dikkatlice ayırın ve ardından bir cam mikro pipete aspire ederek embriyodan çıkarın. İlk olarak, aşama uyumlu bir bıldırcın embriyosu kullanın. Daha sonra, az önce gösterildiği gibi benzer büyüklükte bir nöral tüp bölgesini eksize edin ve donör X explan'ı zil çözeltisi içeren bir cam mikro pipete aspire edin.

X explan'ı civciv konağının eksize edilen bölgesine bitişik olarak aktarın. Ardından, çekilmiş bir cam iğne kullanarak, eski explan'ı nazikçe kesilmiş bölgeye yönlendirerek yönlendirin. Dehidrasyonu önlemek için embriyoya dikkatlice birkaç damla zil çözeltisi ekleyin.

Son olarak, pencereyi koli bandı ile kapatın, bandın pencereli yumurtanın tüm bölgesini kapattığından emin olun, yumurtayı istenen aşamaya kadar kuluçka makinesine geri koyun, kyira'yı kuluçkaya yatırırken sallanma fonksiyonunu kapatın, X, canlılıklarını artırmak için günde iki kez elle nazikçe döndürülebilir. Gelişimin daha sonraki aşamaları hedeflenirse, HH 11'e altı saatlik yeniden inkübasyondan sonra nöral tüpün aşılanmış bölgesinin bu temsili görüntüsü, aşılanmış bıldırcın donör dokusunun konakçı civciv nöral tüpüne beklenen katılımını gösterir. HH 11'deki aşılanmış bölgeden geçen bu kesit, biri nöral tüpten yanal olarak göç eden hnk ile etiketlenmiş nöro krest hücrelerini gösterir.

Nöral krest hücresi göç akımına ve nöral tüpe katkıda bulunan bıldırcın hücreleri, QCPN ile açıkça etiketlenmiştir. Daha sonraki aşamalarda, bıldırcın nöral krest hücresinden türetilen hücreler, nihai hedef dokularına kadar izlenebilir. Bu şekilde görülebileceği gibi, QCPN işaretli hücreler, maksiller sürecin civciv embriyosu meen chi içine serpiştirilir E beşte, QCPN antikoru, bıldırcın türevi nöral krest hücrelerinin farklılaşmasını incelemek için diğer antikorlarla kolayca birleştirilebilir.

Ana bilgisayar ortamında. Burada görüldüğü gibi, bıldırcın nöral kret hücresi kaynaklı trigeminal duyusal nöronlar, QCPN ve T UJ bir antikorları ile etiketlenir. Bu prosedürü takiben, nöro krest hücrelerinin hangi dokulara yol açtığı ve nöro kret hücrelerinin çeşitli dokulara farklılaşırken hangi genleri ifade ettiği gibi ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya ve in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.