Name: Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, bıldırcın-tavuk kimerik embriyolarda sinir kretası hücrelerinin göç ve farklılaşmasını izlemek için dorsal sinir tüpü greftleme tekniğini. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji ve nörobilim araştırmalarında hücre kaderini güvenilir şekilde analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yazının eleştirisi Lwigale laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. SLG, Ruth L. Kirschstein NRSA, Ulusal Göz Enstitüsü (F32 EY02167301) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. PYL Ulusal Göz Enstitüsü (EY018050) tarafından desteklenmektedir.

1. Istenen aşamada, inkübe civciv ve bıldırcın yumurtası HH9 embriyo için, tipik inkübasyon sürelerinde 38 ° C 63 29-33 saat arasında değişmektedir <ol><li> Herhangi bir enkaz yumurta ılık su ile yıkayın. </li><li> Yatay tepside tavuk yumurtası düzenleyin. Kalem ile yukarı bakacak şekilde yan işaretleyin; bu embriyo lokalize edilecektir bölge karşılık gelecektir. Bıldırcın yumurtası künt sonuna kadar inkübe edin. </li><li> Yeri 38 ° C nemlendirilmiş inkübatör. Fonksiyonu sallanan açın. </li></ol> 2. Pencereleme ve diseksiyon için yumurta hazırlayın <ol><li> Inkübatör gelen yumurta çıkarın ve üstleri% 70 etanol ile sterilize edin. Bu etanol püskürtün ve bir kağıt havlu ya da Kimwipe kabuğu ile, etanol herhangi bir emilimini önlemek için hızlı bir şekilde silip en iyisidir. </li><li> Tek bir yumurta tutucusu (katlanmış kağıt havlu ile kaplı bir Petri, örneğin, &quot;Kimwipes&quot; kullanın) üzerine Yeri tavuk yumurtası. AA forcepsi, küçük bir hol dokunune kabuğunun yumurtanın sivri uç üst yüzeyi içine. </li><li> 1.5-3ml, 18 ½ G derialtı iğne ve 5 ml şırınga ile tavuk yumurtası albumin ışık çıkarın. Bu, yumurta (Şekil 2A) sivri ucuna bakacak şekilde konik, delik içine iğne dikey eklemek için en iyisidir. Bu şekilde, albumin geri çekildiğinde, yanlışlıkla emme yoluyla sarısı zarar verme riski vardır. Albümin atın. Bu adım, kabuğu açılacak bir pencere için izin vermek için yumurtanın içindeki yumurta sarısı ve embriyo düşürecektir. </li><li> Yukarıda açıklanan ve seloteyp ile yapıştırın% 70 etanol ile delik silin. Bu deliği çevreleyen kabuğu tamamen yoksun albümin ve kuru ya da yapışkan mühür önemlidir. </li><li> AA forseps ile değil, oldukça apekste, yatay yumurta belirgin üst yüzeyi başka bir delik dokunun. Sarısı ya da embriyo zarar görmesini önlemek için forseps kabuğu ile çok ileri gitmesine izin vermemeye özen gösterin. </li><li> Içindebir tarafı delik paralel yumurta kabuğu içine kavisli iris forseps Sert. Tavuk yumurta kabuğu çapı penceresinde ~ 2 cm kırmak için bir dairesel hareketlerle çalışan kabuk pinching. Kaldırılan kabuğu atın. Alternatif olarak, yumurta paketleme bandı ile üst yüzeyini kaplayan ve pencereden dışarı kesmek için bir makas kullanın. Bu kabuğu enkaz yumurtanın içine düşme olasılığını en aza indirir. Embriyonun yumurta sarısı üstüne opak bir disk olarak görünmesi gerekir. Herhangi bir döllenmemiş yumurta (blastoderm arasında küçük beyaz yumurta sarısının yüzeyinde leke, ya da yokluğu ile tanımlanır) atın. </li><li> Hindistan mürekkep, embriyo düzeylendirme ile yardımcı blastoderm altında: küçük bir miktarı (&quot;Pen / Strep nihai konsantrasyonu 100 mg / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin içeren steril Ringer çözeltisi içinde 1:10 oranında seyreltildi antibiyotik) enjekte ediniz Alternatif olarak, bir anne; 1 ml şırınga ve 26 ½ G derialtı iğne, iğne üssünde 45 derecelik açı içine eğildi, eğim yukarı bakacak şekilde kullanın.y çekti cam Pasteur pipeti ve ağız pipetleme cihazı (derialtı iğne bükme veya cam iğne kırılma esnasında koruyucu gözlük) kullanın. Dışından blastoderm yumurta sarısı membranı ve yüzey sarısı, iğne ucu altındaki embriyo kaydırarak Ponksiyona ancak embriyonik katmanların (Şekil 2B). Embriyonun ana hatlarıyla için yeterli mürekkep enjekte edilir, sonra dikkatli bir iğne (Şekil 2C) çekebilirsiniz. Çok fazla mürekkep enjekte embriyo ölüme yol açabilir. Bu kontaminasyon için bir kaynak olabileceği gibi, embriyo altında hava kabarcığı enjekte etmek için önemlidir. NOT: Bu prosedür içinde kullanılan tüm Ringer çözeltisi olarak sterilize edildi ve, Pen / Strep yukarıda tanımlandığı gibi içerir. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) de bu protokolün tüm adımları Ringer çözümü için kabul edilebilir bir alternatif. </li><li> Stage göre embriyo Hamburger ve Hamilton 63 ve kalıcı mürekkep veya kalem kabuğu aşama kaydedebilirsiniz. Aşamaları iyi stere altında değerlendiriliromicroscopy, sınırlı bir ısı yükü olan fiber optik &quot;deveboynu&quot; ışık kaynakları. </li><li> Uygula 2-3 dehidratasyon ve kirlenmeyi önlemek için embriyo yüzeye sıcak steril Ringer çözeltisi düşer. Parafilm yumurta yüzey üzerine gerilmiş Geçici penceresini kapatın. </li><li> Tekrar nakli deneyleri başlayan önce tüm civciv yumurta ile 2,2-2,9 adımları yineleyin. </li><li> Bıldırcın embriyoları sadece donör doku için kullanılan bu yana, ovo adımları 2,2-2,9 atlanabilir. Donör embriyo ex ovo hazırlanması için, bıldırcın yumurtası, künt yan inkübe edilir ve embriyo ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile bu bölgede açıldı. Diseksiyon makas kullanarak, embriyo dışında vitellin membran ve blastoderm (tüm kesimler karşıladığından emin olun) ile bir kare şeklinde dört kesim yapmak. Kavisli bir iris forseps kullanarak, hafifçe bir kesim kenarını kavramak ve yumurta embriyo kaldırın ve bir Petri kabındaki Ringers çözüm aktarmak. Alternatif olarak, bir eğri kullanabilird iris yumurta embriyo transfer etmek için kullanılır olabilir, altına veya bir embriyo kaşık veya silindir geniş kısmı kesip plastik transferi pipet eksize embriyo kaldırmak için forseps. Yavaşça vitellin membran # 5 forseps ile çıkarın. Yukarıdaki gibi kalan bıldırcın embriyolarının toplayın ve bunları mikroskop altında sahneleyecek. </li></ol> 3. Greft almak için ev sahibi embriyo hazırlayın <ol><li> Konak (civciv) embriyo parafilm çıkarın ve sivriltilmiş bir tungsten iğne veya # 5 forseps kullanarak, nöral tüp (Şekil 3A) istenilen bölgenin, vitellin zarında küçük bir delik gözyaşı. </li><li> Bir damla embriyoya Ringer çözeltisi ekleyin. Embriyo doku kaybını önlemek için tüm prosedürü sırasında Ringer çözeltisi tamamen sular altında tutmaya özen gösterin. Ringer çözeltisi ile embriyo transferi pipet gerekirse yüzeye damla eklenerek tutun. </li><li> Çekti cam iğne kullanılarak, dikkatle rostral ve yaklaşıkdorsal nöral tüp içinde faiz uzunluğu ve bölgeye karşılık devamlı iyeliğe dayalı mülkiyet hakkı transvers insizyon. (Çektiğine cam iğneler iğne aparatı çekerek ile ısı altında çektiği silikon cam kılcal tüpler üretilir.) Tek taraflı greft insizyon sadece dorsal nöral tüp lümenine genişletmek ve ikili greftler için, boydan boya kesiler yapmak tüm dorsal nöral tüp. Ardından dorsal nöral tüp ve paraxial mezoderm arasında bilateral kesti. </li><li> Nöral tüp eksize eksplant dikkatle ayırmak sonra bir cam mikropipet (Şekil 3B) aspire embriyo çıkarın. </li></ol> 4. Donör greft doku hazırlayın <ol><li> Bir sahne eşleşti-bıldırcın embriyo seçin. AA forseps ile embriyo basılı tutun, vitellin membran, kaldırmak ve tüketim nöral tüp yukarıda açıklandığı gibi benzer bir büyüklükte bölgesi (3,3-3,4) (Şekil 3A&#39;-B &#39;). Denemenizin ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu bölge olabilirev sahibi (civciv) nöral tüp veya postero kaudal eksen boyunca farklı bir bölge tamamlayıcı bir bölge. (Not: tam nöral tüp greft de dahil olmak üzere daha büyük bir bölgesel greftler, için, araştırmacılar donör doku nakli için önce herhangi bir yapışık mezenkimal doku kaldırmak için bu adımı bir proteaz sindirim eklemek isteyebilirsiniz Ancak, erken evrede küçük dorsal nöral tüp greft. , sinirsel tüp kolayca, cerrahi teknikler tarafından kesin olarak, bitişik mezenşimin ayrılmıştır olarak, burada açıklanan, proteaz sindirimi gerekli değildir.) </li></ol> 5. Graft doku <ol><li> Ringer çözeltisi içeren bir cam mikropipet içine donör eksplant aspire edin. Pipet içine herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olun. </li><li> Civciv ana eksize bölgeye bitişik eksplant aktarın. Orient, çekilmiş cam iğne, eksplant kullanma ve yavaşça ablasyon bölgesi (Şekil 3C) içine rehberlik. </li><li> Ringer çözeltisi dikkatlice birkaç damlasu kaybını önlemek için embriyoya. Bu greft çıkarmak olabilir greft üzerine doğrudan sıvı bırakarak önlemek için özen gösterin. </li><li> Pencere ambalaj bandı ile kapatılmalıdır. Bantları,, pencereli yumurta tüm bölge olduğundan emin olun. Bu, sonraki inkübasyon sırasında dehidrasyon ve embriyo kirlenmesini önler. </li><li> ,, Istenen sahne kadar inkübatöründe yumurta döndürür. Kuruntuları kuluçkaya ise &quot;rocking&quot; fonksiyonu kapalı olduğundan emin olun. Yumurta yavaşça elini iki kez bir gün sonraki gelişim aşamalarında hedef ise bu onların canlılığı artırabilir tarafından açılabilir. </li></ol> 6. Kesimi için kimerik embriyo hazırlayın <ol><li> Deneysel son noktada, ince makas kullanırken pencere kapsayan bandı kesti. </li><li> Eğri iris forseps (tırtıklı ipuçları ile yapılacak en kolay) blastoderm kenarına tutun, daha sonra 4 blastoderm sınırları dışında geniş kesimler ile sarısından uzak embriyo kesilir. </li&gt; <li> Ringer çözeltisi içeren Petri embriyo aktarın. Doku dehidratasyonu önlemek için, embriyonun havaya maruz kalmayı en aza indirmek için özen gösterin. </li><li> Stereomikroskobi altında hafifçe # 5 forcepsi blastoderm vitellin membran ayırın. </li><li> Yumurta olduğu gibi düz dışarı attı çevreleyen membran ile, embriyo, aynı yönde olması için çanak embriyo dikkatli bir şekilde düzenlemek. </li><li> Tungsten teller 64 yapılan iğneler, yemeğin altına tungsten telli paralel uzunluğu ile embriyo ve extraembryonic doku sınır iğne düzenleyerek embriyo temiz, çevredeki blastoderm kaldırmak için diseksiyon kullanın. Hafif bir kesme hareketi, dokuları kesmek için kullanın. </li><li> # 5 forseps ile amniyon dikkatlice çıkarın. Bu noktada, daha fazla ilgi bölge teşrih veya embriyo bütün bırakın ya da isteyebilirsiniz. </li><li> Buz gibi soğuk% 4 paraf embriyo transfer4 ° C&#39;de ve geceleme rock ormaldehyde </li><li> Örnekleri hazırlayın ve, cryo veya parafin bölümlendirilmeleri için embed. </li></ol> Ana embriyo içinde aşılı doku çiziniz. Hematoksilen boyama ile bıldırcın nukleoli algılama (bıldırcın çekirdeklerin, civciv çekirdekler daha çok büyük, koyu boyama kapanımlar), Feulgen-Rossenbeck reaksiyonu, akridin-turuncu ya da biz-benzamid leke de dahil olmak üzere bir civciv embriyo içinde bıldırcın doku tanımlamak için çeşitli teknikler vardır bıldırcın özgü antijenler 3,47,65,66 elektron mikroskop veya immün ile birlikte. İşte biz, bıldırcın civciv kimeralar (Şekil 4) bıldırcın nöral krest hücrelerinden tanımlamak için QCPN antijen ve standart tüm montaj veya bölüm immunofloresan teknikleri kullanın. Bu tekniğin ayrıca QCPN immunoşoresan, vericinin (Bıldırcın) dokudan türetilmiş farklılaşmış hücreler tanımlamak için diğer antikorları ile kombine edilebilir olarak, deney tasarımı en esneklik sağlar. Standa kullanınrd tüm montaj veya bölüm immunofloresan teknikleri kimeralar bıldırcın kökenli hücrelerin etiketlemek için. 7. Temsilcisi Sonuçlar Re-inkübasyon 6h sonra nöral tüp aşılı bölgenin temsili bir görüntü (HH11 için), ana bilgisayar (civciv) nöral tüp (Şekil 4A) içine aşılı donör (bıldırcın) doku beklenen birleşme gösterir. Reincubation sonra, greft eksik entegrasyon, veya, kranial bölge veya Somitlerin asimetrik gelişme gösteren Embriyolar atılmalıdır. , HNK-1 yanal nöral tüp geçiş ile etiketlenmiş HH11 gösterisi NCCS, aşılı bölge ile kesiti. Bıldırcın hücreleri KKK göçmen akışına katkı ve nöral tüp, açıkça QCPN (Şekil 4B) ile işaretlenmiş. Daha sonraki aşamalarda, bıldırcın KKK-türetilmiş hücreler nihai hedef dokuya izlenebilmektedir. , QCPN etiketli hücreleri civciv embriyo mezenşimin içinde serpiştirilmişE5 (Şekil 4C) maksiller süreci. QCPN antikor kolayca,, ana çevre bıldırcın-derived NCCS farklılaşma incelemek için diğer antikorları ile kombine edilebilir. Bıldırcın KKK-türetilmiş trigeminal duysal nöronlarda QCPN ve Tuj1 antikorlar (Şekil 4D) tarafından etiketlenir. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel prosedür ve gerekli aletler genel bir bakış. A) Host (civciv) ve donör (bıldırcın) embriyo aşamasında uyumlu olması gerekir. Trigeminal ganglion ve Çene-mandibüler bölgedeki katkıda KKK akışı etiketlemek için HH9, idealdir. HH9, nöral tüp rostral bölgede kapatmak için başlıyor, ama henüz tamamen kapalı değil. Diyagramlarda gri çizgi kapanış nöral tüp orta hat temsil eder. Noktalı beyaz çizgiler, ev sahibi ve donör nöral tüp sağ tarafında bir Ortabeyin bölge eksize kesme hatları gösterir embryos. Ana embriyo eksize bölge atılır ve donör doku kimerik embriyo oluşturmak için nakledilen. B) Gerekli araçlar şunlardır: a) 5 ml&#39;lik 18 ile şırınga ½ G derialtı iğne, b) 26 ile 1 ml şırınga ½ 45 ° açılı, c) Hindistan mürekkep G derialtı iğne bükük, d) net ambalaj bandı, e) ağız pipetleme cam pipet AA forseps, aparatları, f) 60 mm-Petri, g) h) tırtıklı ipuçları, i eğri iris forseps) # 5 forseps, j) ince makas, k) l, tungsten tel bilenmiş) cam iğne, m) parafilm çekti kareler. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> Şekil 2. 18 ideal ekleme noktası da dahil olmak üzere yumurta, yumurta ve embriyo hazırlanması. A) Kesitsel şeması, ½, albümin ışık çekilmesi için G derialtı iğne. B) ışık albümin ~ 3ml çekilmesi sonra, sarısı ve embriyo, araştırmacılar t bir &quot;pencere&quot; (oklar) kesmek için izin, yumurtanın içindeki düşürüro embriyo erişmek için kabuğu. Çini mürekkebi, steril Ringer çözeltisi seyreltilmiş 01:10, sonra embriyoların kolay evreleme için kontrast sağlamak için blastoderm altına enjekte edilebilir. C) Civciv embriyo mürekkep sonra. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> Şekil 3. Şematik aşılama işlemi her aşamada ve HH aşamada 9 donör ve alıcı embriyo örnekleri A) Chick ana embriyo. , Vitellin membran greft kranial bölge erişmek için yırtılmış nereye şemada kesik çizgilerle gösterir. Vitellin membran yırtılmış sonra üçgen flep kaudal soyulmuş olmalıdır. Görüntünün Kutu (BC) içinde kullanılan inset gösterir. A &#39;) Bıldırcın donör embriyo. Görüntü donör embriyo yumurta çıkarıldı ve greft doku diseksiyonu için Petri yerleştirilir. (B &#39;) görüntü kutusunda kullanılan gömme gösterir. Vitelline ve sarısı membranlar t kaldırmak için nerede kesileceğini şematik diyagramı Kesikli çizgiler (A) gösteriryumurtadan çıkan embriyo. B), greft bekleyen eksize nöral tüp (beyaz oklar) tek taraflı Ortabeyin bölge ile Host embriyo. Kesimler Ortabeyin bölgede nöral tüp tüketim yapılmalıdır nerede şematik diyagramda noktalı çizgi gösterir. Dorsal nöral tüp greft dokusu ile B &#39;) Donör embriyo (greft dokusu siyah ok uçları ile gösterilir) çıkarıldı. Kesimler nöral tüp Ortabeyin bölgede aşılama tek taraflı donör doku tüketim bıldırcın embriyo nerede yapılmalıdır diyagramda noktalı çizgi gösterir. Bıldırcın dorsal nöral tüp implantını, civciv Ortabeyin bölgeye aşılamadan sonra C) Kimerik embriyo. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> Şekil 4. İmmünofloresan donör kaynaklı kimerik embriyo hücrelerinde bıldırcın özel nükleer antijen QCPN tespit chimera HH11 (de aşılı HH9), kırmızı QCPN boyama gösteren ve, HNK-1 boyanmasının (NCCS göç eden bir belirteç) A) Tüm montaj görüntü içindeyeşil. 10X büyütme dorsal görünüm. Embriyo ile nöral tüp ve göçmen KKK HNK-1 (yeşil) ile birlikte boyandı QCPN pozitif bıldırcın elde edilen hücreler gösteren (A) B) Kesit. 40X büyütme. C) chimera E5 maksiller sürecinde Çapraz bölümü (3 gün sonrası greft için inkübe), nöral tüp embriyo nihai konuma aşılı bölgeden göç etmiş QCPN-pozitif KKK kökenli hücrelerin (kırmızı) gösteren. 10X büyütmeli. D) Bölüm (yeşil) TuJ1-pozitif nöron içine trigeminal ganglion (kırmızı) ve farklılaşma KKK elde edilen bıldırcın E5 chimera gösteren katkısı ile. 40X büyütme. * NCCS; MP, maksiller süreci NT, nöral tüp; TG, trigeminal ganglion.

Yazarlar, ifşa etmek için bir şey var.

Postero-kaudal ekseni 21,67-69 boyunca farklı bölgelerden kaynaklanan NCCS göç belirli subpopülasyonunun izlemek için basit ve ucuz bir tekniktir host civciv embriyolarının içine bıldırcın nöral tüp grefti Burada anlatılan. Bu teknik deneysel olarak araştırmak, kuş embriyoları (memeli embriyo göre) erişim kolaylığı yararlanır ve elektroporasyon yoluyla ifade plazmidlerin doku ablasyonu, inhibitör moleküllerin enjeksiyon veya genetik manipülasyon gibi diğer teknikleri ile kombine edilebilir 47,69 em...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Civciv yumurta </td><td> Çeşitli - Texas A &amp; M Üniversitesi Kanatlı Bilimleri Bölümü, Teksas. </td><td></td></tr><tr><td> Bıldırcın yumurtası </td><td> Çeşitli - Ozarks Yumurta Şirket, MO kullanın. </td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka (Dijital Saati 1502 Sporcu İnkübatör w / Nem 110-120 Volt AC) </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td> , Dumont AA forseps, Inox Epoksi kaplı </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11210-10 </td></tr><tr><td> Seloteyp </td><td> Herhangi bir ofis malzemeleri satan bir mağazadan </td><td></td></tr><tr><td> Eğri İris forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11065-07 </td></tr><tr><td> Benndia mürekkep </td><td> Herhangi bir sanat malzemeleri satan bir mağazadan </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep (Penisilin, Streptomisin) Çözüm </td><td> VWR International </td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td> Şeffaf Ambalaj bant </td><td> Herhangi bir ofis malzemeleri satan bir mağazadan </td><td></td></tr><tr><td> İğne çekme aparatı </td><td> Narashige, Japonya </td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> Çekti cam iğne, 1.5-1.8 x 100mm borosilikat cam kılcal tüp yapılmış </td><td> Kimble kovalamaca </td><td> 34500 99 </td></tr><tr><td> 5 yapılmış cam pipet, ¾ &quot;Pasteur pipeti çekti </td><td> Fisher Scientific </td><td> : 13-678-6A </td></tr><tr><td> Ağız pipet aparatı (kalibre microcapillary pipet için aspiratör tüp montajı) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-30 </td></tr><tr><td> Tungsten tel, 0.1mm çap </td><td> VWR International </td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td> Iğne tutucu (Nikel kaplama pin tutucu) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26018-17 </td></tr><tr><td> QCPN antiserum </td><td> Gelişim Çalışmaları, Hibridoma Bankası, University of Iowa </td><td> QCPN </td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekonder antikor (örneğin, Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG1) </td><td> Invitrogen </td><td> A21125 </td></tr><tr><td> Ringer çözeltisi (2L): <ul><li> 14.4g NaCl </li><li> 0.34g CaCl 2 </li><li> 0.74g KCl </li><li> 0.230g Na 2 HPO 4 </li><li> : 0.04g KH 2 PO 4 </li><li> GKD 2 O 2L için </li><li> Filter ve otoklav </li></ul></td><td> Fisher Scientific Tüm reaktifler </td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

Çapraz türler nakli sinir crest göç ve farklılaşma analiz

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Kuş embriyo yumurta içinde embriyo kolay erişim nedeniyle birçok omurgalı gelişimsel süreçleri, çalışmak için benzersiz bir platform sağlar. Bıldırcın donör doku, ovo içinde bir civciv embriyo nakli olduğu kimerik kuş embriyo, hücre popülasyonlarının, silinmez genetik etiketleme güç kuş embriyosunun tarafından sunulan manipülasyon kolaylığı ile birleştirir. Bıldırcın civciv kimeralar, 1-3 göç eden nöral krest hücrelerinden (NCCS) izlemek için klasik bir araçtır. NCCS embriyo hücreleri gelişmekte olan nöral tüp 4 dorsal bölgede kaynaklanan geçici bir göçmen nüfus vardır. Onlar, mezenkimal geçiş için bir epitel geçmesi ve daha sonra onlar, kıkırdak 5-13, melanositlere 11,14-20, nöronlar ve glia 21-32 dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri ayırt embriyonun diğer bölgelerine göç. NCCS multipotent, ve kendi nihai kaderini etkiler.1) bunlar, 11,33-37 embriyo, 2-kaudal postero ekseni boyunca kaynaklı olduğu sinirsel tüp bölge), bunlar 38-44 geçirmek olarak komşu hücreler sinyalleri, ve 3) nihai microenvironment tarafından çalışmalar la 45,46 embriyo içinde hedef. Embriyo içinde nihai pozisyon ve kaderine, nöral tüp kökenli bu hücreler izleme, modelleme ve organogenez düzenleyen gelişim süreçlerine önemli ipuçları sunuyor. , Donör nöral tüp (aşılama Homotopik) veya donör nöral tüp (heterotopik aşılama) farklı bölgelerinde tamamlayıcı bölgelerinde Nakli, 2,47 postero-kaudal eksen boyunca ön özellikli NCCS farklılıklar ortaya çıkarabilir. Bu teknik, daha fazla nöral tüp tek taraflı donör doku elde edilir bu tür tek taraflı bir bölmesi, nakli için uyarlanmış ve taraf kalıntıları ana embriyo yi soğukkanlı edilebilir2,47 içinde aynı örnek bir iç kontrol Elding. Bu, ayrıca ön sinirsel tüp 47 kapatıldı, HH10 sonra daha sonraki embriyolarda, beyin segmentlerinin transplantasyonu için adapte edilmiş olabilir. Burada nöral tüpün ayrı bir segment türetilen göçmen NCCS izlemek için izin nöral tüp nakli yoluyla bıldırcın-chick kimeralar üretme teknikleri sunduk. ,, Bıldırcın özel QCPN antikor 48-56 donör kaynaklı hücre türlerinin özel etiketleme araştırmacı deneysel uç noktasında donör ve alıcı hücreleri ayırt etmek için izin verir. Bu teknik, ucuz, kolay, ve kader haritalama, izleme hücre soyu, ve postero-kaudal ekseni 45 boyunca desenlendirme öncesi olayların saptanmasını da dahil olmak üzere birçok uygulama vardır. , Kolaylığı, avyan embriyo için erişim,-chick bıldırcın graft teknikle dahil olmak üzere diğer manipülasyonlar ile kombine edilebilir fakat, lens Ablasyon 4 sınırlı değildir0, embriyonun gelişim programı salınımları ile NCCS özellikle göç akımlarının yanıt belirlemek için inhibitör molekülleri 57,58, veya ifade plazmidler 59-61 elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyon, enjeksiyon. Ayrıca, bu aşılama tekniği fare genetik kuş embriyo manipülasyonu kolaylığı ile gücünü birleştirmek için, kraniyofasiyal morfonogenezi, ya da fare civciv kimeralar KKK katkısını incelemek için bıldırcın-ördek kimeralar gibi diğer arası kimerik embriyo oluşturmak için kullanılan olabilir . 62

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Kuş embriyoları, yumurta içindeki embriyolara kolay erişim sağlanabilmesi nedeniyle, birçok omurgalı gelişim sürecini incelemek için benzersiz bir platform sunar. ...

Bu prosedürün genel amacı, nöral krist hücrelerinin migrasyonunu ve kaderini izlemek amacıyla, bir sülün embriyosundan alınan dorsal nöral tüp eksplantını, gelişim evresi uyumlu bir tavuk embriyosuna nakletmektir. Bu işlem, öncelikle nöral tübe erişmek için konakçı tavuk embriyosunun IGN membranında küçük bir delik açılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, donör sülün embriyosu, greft eksizyonuna hazırlamak için yumurtasından çıkarılır.Bir sonraki adımda, ilgi bölgesi konakçı embriyonun nöral tüpünden eksize edilir. Ardından, greftleme için donör nöral tüpten benzer bir bölge eksize edilir. Sonrasında, donör nöral tüp konakçı nöral tüpe nakledilir.Son olarak, seçilen organdaki nöral kriste varan hücrelerin tespiti için kimera embriyo istenen evreye kadar inkübe edilir. Nihayetinde, donör kaynaklı nöral krist hücrelerinin konak embriyodaki çeşitli konumlara göçü ve farklılaşması, immunofloresan mikroskopi ile görselleştirilebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir çünkü mikrodisseksiyon ve greftleme adımları çok hassas motor beceriler gerektirmekte ve bu da öğrenilmelerini zorlaştırmaktadır.Civciv yumurtalarındaki tüm kalıntıların ılık suyla yıkanmasıyla baş

analysis-neural-crest-migration-differentiation-cross-species

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

In vitro nöral krest kök hücreler (NCSC) yetiştirmek için özel bir orta (NCSCM) gereklidir. NCSCM önemli bir parçası civciv embriyo ekstraktı (CEE). Biz burada, izolasyon, maserasyon, santrifüj ve filtrasyon işlemleri gibi ayrıntıları da dahil olmak üzere saf ve kaliteli CEE maksimize miktarda üretmek için doğru teknikleri anlatıyoruz.

Civciv Embriyo Özü murin Sinir Crest Kök Hücre Yetiştiriciliği Üretimi

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri...

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Bu protokol Xenopus laevis neurulas gelen premigratory kranial sinir kret (NC) teşrih nasıl açıklanır. Bu eksplantlar, fibronektin ve in vitro kültürlenmiş üzerine kaplanır, ya da arka ana embriyolara aşılanabilirler. Bu teknik NC epitel-to-mezenşimin geçiş, göç, ve farklılaşma mekanizmaları eğitim veriyor.

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Fare embriyonik kök hücrelerinden kraniyal nöral krest hücreleri üretmek için tekrarlanabilir boyutta nöroküreler üreten üç boyutlu (3D) bir in vitro farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu metodolojinin önceki protokollere kıyasla değişkenliği azalttığını ve kraniyal nöral krest hücre gelişimini incelemek için çoğullanmış test için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Öğrenin, bıldırcın-tavuk kimerik embriyolarda sinir kretası hücrelerinin göç ve farklılaşmasını izlemek için dorsal sinir tüpü greftleme tekniğini. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji ve nörobilim araştırmalarında hücre kaderini güvenilir şekilde analiz etmeyi sağlar.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Daha fazla video keşfet