Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Bu prosedürün genel amacı, nöral krist hücrelerinin göçünü ve akıbetini izlemek amacıyla, bir sülün embriyosundan alınan dorsal nöral tüp eksplantını, gelişim evresi eşleşmiş bir tavuk embriyosuna nakletmektir. Bu işlem, öncelikle nöral tübe erişmek için konak tavuk embriyosunun IGN membranında küçük bir delik açılarak gerçekleştirilir. Ardından, donör sülün embriyosu, greft eksizyonu için hazırlamak amacıyla yumurtasından çıkarılır.

Bir sonraki adımda, ilgi alanı konakçı embriyonun nöral tüpünden eksize edilir. Ardından, greftleme için donör nöral tüpten benzer bir bölge eksize edilir. Sonrasında, donör nöral tüp konakçı nöral tüpe transplant edilir.

Son olarak, seçilen organdaki nöral kriste varan hücrelerin tespit edilmesi için kimera embriyo istenen evreye kadar inkübe edilir. Nihayetinde, donör kaynaklı nöral krist hücrelerinin konak embriyodaki çeşitli bölgelere göçü ve farklılaşması, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla görselleştirilebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir; çünkü mikro diseksiyon ve greftleme adımları çok hassas motor beceriler gerektirdiğinden öğrenilmesi zordur.

Civciv yumurtalarındaki tüm kalıntıları ılık suyla yıkayarak başlayın. Yumurtaları bir tepsiye yatay olarak yerleştirin ve ardından embriyonun konumlanacağı bölgeyi belirtmek için üstte kalan kısımları kurşun kalemle işaretleyin. Donör embriyoların X ovo hazırlığı için bıldırcın bacaklarını küt tarafı aşağı gelecek şekilde inkübe edin.

Sıradaki adımda, yumurtaları 38 °C sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin ve sallama fonksiyonunu açın. Yumurtaların inkübasyon süreci tamamlandıktan sonra, üzerlerini %70 etanol püskürterek sterilize edin ve ardından bir Kim wipe ile hızla silin. Yumurta kabuğundan herhangi bir emilim olmasını önlemek için, sterilize edilen her yumurtayı, burada görülen katlanmış Kim wipe'lar ile döşenmiş Petri kabına benzer şekilde, ayrı bir yumurta tutucuya yerleştirin. Ardından, sterilize edilmiş AA pens kullanarak yumurtanın sivri ucundaki üst yüzeye küçük bir delik açın.

Beş mililitrelik bir şırıngayı 18,5 gauge'lik bir hipodermik iğne ile donatın. Ardından, iğnenin eğimli ucu yumurtanın sivri ucuna bakacak şekilde, iğneyi yumurta kabuğundaki deliğe dikey olarak yerleştirin. Vakumlama yoluyla sarının yanlışlıkla zarar görmesini önlemek için, deliği daha önce olduğu gibi %70 etanol ile temizleyin ve deliği şeffaf yapışkan bant ile kapatın.

Ardından, çift A forsepsi ile yatay bacağın işaretlenmiş üst yüzeyine, tam tepe noktasına gelmeden başka bir delik açın. Sonra, kavisli iris forsepsinin bir ucunu yumurtaya paralel olacak şekilde deliğe yerleştirin. Ardından kabuğu aşağıya doğru sıkarak dairesel hareketlerle çalışın.

Tavuk yumurtasının kabuğunda iki santimetre çapında bir pencere açın ve çıkarılan yumurta kabuğunu atın. Embriyo, sarısının üzerinde opak bir disk şeklinde görünmelidir. Sarının yüzeyindeki küçük beyaz bir leke ile veya blastodermin yokluğu ile tespit edilen döllenmemiş yumurtaları ayırın.

Şimdi uygun göz koruyucu ekipman takılıyken, 26,5 gauge'lik hipodermik iğneyi iğnenin tabanından başlayarak 45 derecelik bir açıyla bükün. Bükülmüş iğneyi, eğimli tarafı yukarı gelecek şekilde bir mililitrelik bir şırıngaya taktıktan sonra iğneyi seyreltilmiş Hindistan mürekkebi ile doldurun. Blaster'ın çevresinin dışındaki vitellus membranını delin ve iğne ucunu, embriyonik tabakalara girmeden, vitellus yüzeyine yakın olacak şekilde embriyonun altına kaydırın.

Ardından, hava kabarcığı enjekte etmekten kaçınarak, embriyoyu çevreleyecek kadar mürekkep enjekte edin. İğneyi dikkatlice geri çekin. Şimdi, burada gösterilen fiber optik esnek boyunlu lamba gibi ısı yükü sınırlı bir ışık kaynağı ve bir stereo mikroskop kullanın.

Embriyoları Hamburger ve Hamilton'a göre evreleyin. Evreyi yumurta kabuklarının üzerine kaydedin. Ardından, dehidrasyonu ve kontaminasyonu önlemek için embriyoların yüzeyine iki ila üç damla sıcak steril ringer solüsyonu uygulayın.

Ardından, pencereleri geçici olarak kapatmak için yumurtaların yüzeyini parafilm ile gererek örtün. Sonra, bıldırcın yumurtalarını transplantasyon için hazırlayın. Yumurtaları inkübatörden çıkarmadan önce, bir Petri kabını ringer çözeltisi ile doldurun.

Ardından, embriyoyu ortaya çıkarmak için yumurtaları kavisli pens yardımıyla küt tarafından açın. Diseksiyon makası kullanarak, embriyonun dışındaki vili membran ve blastoderm boyunca, tüm kesimlerin birleştiğinden emin olarak kare şeklinde dört kesik atın. Daha sonra kavisli iris pensi kullanarak, kesik kenarlardan birini nazikçe tutun, embriyoyu yumurtadan kaldırın ve hazırlanan petri kabına transfer edin.

Son olarak, vitellin membranı 5 numara pens ile nazikçe kaldırın ve ardından embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında evreleyin. Konak civciv embriyosunun üzerindeki parafilm tabakasını çıkarın. Daha sonra, sivriltilmiş bir tungsten iğne kullanarak, nöral tüpün istenen bölgesindeki VII membranında küçük bir delik açın.

Embriyoya bir damla ringer solüsyonu ekleyin. Ardından, bu videoda gerçekleştirilen gibi tek taraflı greftler için, çekilmiş bir cam iğne kullanarak nöral tüpün orta beyin bölgesine, lümeni aşmayacak şekilde dikkatle transvers rostral ve kordal insizyonlar yapın. Daha sonra, dorsal nöral tüp ile paryetal mezoderm arasını bilateral olarak kesin.

Son olarak, eksize edilen X eksplanını sinir tüpünden dikkatlice ayırın ve ardından bir cam mikropipet yardımıyla aspire ederek embriyodan çıkarın. İlk olarak, evre uyumlu bir sülün embriyosu kullanın. Ardından, az önce gösterildiği gibi benzer büyüklükte bir sinir tüpü bölgesini eksize edin ve donör X eksplanını Ringer çözeltisi içeren bir cam mikropipete aspire edin.

X eksplantını, civciv konakçısının eksize edilmiş bölgesinin yanına transfer edin. Ardından, çekilmiş bir cam iğne kullanarak, eksplantı ablate edilmiş bölgeye nazikçe yönlendirerek yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek için embriyoya dikkatlice birkaç damla Ringer solüsyonu ekleyin.

Son olarak, bandın pencereli yumurtanın tüm bölgesini kapattığından emin olarak pencereyi paketleme bandı ile mühürleyin ve yumurtayı istenen evreye kadar inkübatöre geri yerleştirin; kyira inkübe edilirken sallama fonksiyonunu kapatın, canlılığı artırmak için X günde iki kez elle nazikçe döndürülebilir. Gelişimin daha sonraki evreleri hedefleniyorsa, HH 11'e kadar altı saatlik yeniden inkübasyon sonrası nöral tüpün greftlenen bölgesine ait olan bu temsili görüntü, greftlenen sülün donör dokusunun konak civciv nöral tüpüne beklenen entegrasyonunu göstermektedir. HH 11'deki greftlenmiş bölgeden alınan bu kesit, hnk ile işaretlenmiş nöral krista hücrelerini ve bunlardan birinin nöral tüpten lateral olarak göç ettiğini göstermektedir.

Nöral krista hücresi göç akımına ve nöral tüpe katkıda bulunan bıldırcın hücreleri, QCPN ile net bir şekilde işaretlenmiştir. Daha sonraki aşamalarda, bıldırcın nöral krista hücresi kaynaklı hücreler nihai hedef dokularına kadar takip edilebilir. Bu şekilde görülebileceği üzere, QCPN işaretli hücreler, civciv embriyosunun maksiller prosesi içerisinde dağılmış durumdadır. E5 aşamasında, bıldırcın kaynaklı nöral krista hücrelerinin farklılaşmasını incelemek için QCPN antikoru diğer antikorlarla kolayca kombine edilebilir.

Konak ortamında. Burada görüldüğü üzere, bıldırcın nöral krest hücresi kaynaklı trigeminal duyusal nöronlar QCPN ve T UJ one antikorları ile işaretlenmiştir. Bu prosedürün ardından, nöral krest hücrelerinin hangi dokuları oluşturduğu ve çeşitli dokulara farklılaşırken hangi genleri eksprese ettikleri gibi ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya ve in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.