Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

Bu prosedürün genel amacı, hücre-hücre etkileşimlerinin gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesinde kullanılmak üzere, meme mimarisi ve mikroçevre mühendisliği veya MAM olarak adlandırılan 3D ko-kültür modelleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle lamellerin fibroblast D söndürülmüş (DQ) kolajen one kolajen bir matrisi ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından, söndürülmüş (quenched) kolajen tip IV eklendi. Rekonstitüe bazal membran matrisi, katılaşmış DQ kolajen tip I matrisinin (içine fibroblastlar gömülmüş kolajen tip I matrisi) üzerine eklendi. Üçüncü adımda, hücrelerin DQ kolajen tip IV rekonstitüe bazal membran matrisine tutunmasını sağlamak amacıyla, lamel camların üzerine bir epitel veya tümör hücresi süspansiyonu tabaka halinde yerleştirildi ve ardından besiyeri eklendi.

Son olarak, canlı mam ko-kültürlerinin üç uzamsal boyuta ek olarak zaman boyutunu da analiz eden dört boyutlu (4D) görüntüleme gerçekleştirmek için konfokal mikroskopi kullanılır. Nihayetinde, 4D görüntüleme, meme tümör hücreleri ile tümör mikroçevresindeki diğer hücreler arasındaki ve invaziv bir fenotipe doğru ilerlemeyi etkileyebilecek olan dinamik etkileşimin görselleştirilmesine ve analiz edilmesine olanak tanır. Bu tekniğin intravital görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel bir avantajı, modelimizde gözlemlenen etkileşimlerin, örneğin insan tümör hücreleri ile fare stromal hücreleri arasında değil, tek bir türün hücreleri, yani insan tümör hücreleri ile insan tümör ilişkili hücreleri arasında olmasıdır.

Genel olarak, bu yöntemi ilk kez uygulayan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü ana çekirdek kültürlerinleme işleminin önce görselleştirilmesi, ardından başarı için orta düzeyde beceri ve pratik gerektirmektedir. Alkolle sterilize edilmiş dikdörtgen bir plastik örtü yerleştirerek başlayın. Bunu 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin veya bir IBI tree, 35 milimetrelik mu kap kullanın.

Ardından, istenilen sayıdaki fibroblastı DQ kolajen ile karıştırın. Sonra, 100 microliter mikro pipet kullanarak, 70 microliters fibroblast DQ kolajeni (bir kolajen bir matriks) lamelin tüm yüzeyine dikkatlice pipetleyip yayın ve kültür kabını karbondioksitsiz, nemlendirilmiş 37 degrees Celsius inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin. Matrisler katılaştıktan sonra, %5 carbon dioxide içeren 37 degree Celsius inkübatörde 10 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.

Ardından, oda sıcaklığına gelene kadar kabı bir davlumbaz altına yerleştirin. Katılaşmış DQ kolajen üzerine 60 µL DQ kolajen, dört yeniden oluşturulmuş bazal membran matrisi ve gömülü fibroblastlar içeren bir kolajen bir matrisi ekleyin. Daha sonra bir pipet ucu kullanarak, fibroblastların bulunduğu DQ kolajen bir kolajen bir matrisini çizmemeye dikkat ederek, DQ kolajen dört yeniden oluşturulmuş bazal membran matrisini dikkatlice ve eşit şekilde yayın.

Ardından, DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix katılaşırken, petriği ve lameli 10 dakika boyunca %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik inkübatöre aktarın; bu sırada tripsinize edilmiş gözleri analiz edin ve ko-kültür için hücreleri sayın. Şimdi, 50 µL hücre süspansiyonunu kaplamalı lamelin üzerine yerleştirin ve hücrelerin DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix yapısına tutunmalarını sağlamak için petriği 40 ila 60 dakika boyunca %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. Hücreler matrise tutunduktan sonra, 35 mm'lik petriğe %2 reconstituted basement membrane içeren 2 mL kültür ortamı ekleyin.

Ardından, PBS ile yıkadıktan sonra görüntüleme öncesinde istenen süre boyunca inkübe edin; ko-kültürleri, MEGM besiyerinde, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde, beş mikromolar cell tracker orange ile 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, ko-kültürleri tekrar PBS ile yıkayın ve 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde, önceden ısıtılmış MEGM besiyeri ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Ko-kültürleri düşük büyütmede görüntüleyin. Örneğin, konfokal mikroskopta su daldırma lensi ile 10 x büyütmede, yapıların tüm derinliği boyunca 10 mikron aralıklarla optik kesitler alın.

Velocity yazılımı veya benzeri bir program kullanarak görüntüleri 3D şeklinde yeniden oluşturmak için optik kesitleri kullanın. Yapıların, hücre-hücre etkileşimlerinin ve çevreleyen matrisle olan etkileşimlerin görselleştirilebilmesi için 3D yeniden oluşturmaların videolarını hazırlayın. Bir ana ko-kültürün bu temsili şematik diyagramında, bir IBI işlem görmüş mu kabı önce kolajen ile kaplanmış, bunlardan biri DQ kolajen içeriyor, diğeri ise burada macenta renginde görüldüğü üzere fibroblastlar içeriyor.

Ardından, DQ kolajen dört içeren yeniden oluşturulmuş bazal membranının ikinci bir tabakası eklendi. Sonrasında, kırmızıyla gösterilen tümör hücreleri %2 yeniden oluşturulmuş bazal membranı üzerine ekilerek kültürde bırakıldı.

Krem rengi noktalarla temsil edilen besiyeri, her besiyeri değişiminde üstten eklenmiştir. DQ kolajen bir ve dördün floresan cleavage ürünleri yeşil ile temsil edilmiştir. Bu temsili MCF 10 DCIS ve WS 12 TI ko-kültürünün 23 günü boyunca, burada ve sonraki şekillerde görüntülenen hücrelerin proliferasyonu (kırmızı) ile burada ve sonraki şekillerde gözlemlenen DQ kolajen dört ve birin degradasyonu (yeşil) ve ko-kültürlerin hacmindeki azalma ile belirtilen kolajen matrislerin yıkımı gerçekleşmiştir.

Söz konusu canlı ko-kültürler 23 gün boyunca gözlemlenmiş ve ko-kültürün 3, 16 ve 23. günlerinde konfokal mikroskopi ile görüntüler yakalanmıştır. Mame ko-kültürlerindeki etkileşimler dinamiktir ve zamanla değişebilir. Örneğin, hücre mam, ko-kültürünün 3. gününe ait bu 3D modelinde görüldüğü üzere, hücreler bu zaman noktasında matrislerde henüz çoğalmaya başlamaktadır ve yeşil floresansın yokluğuyla kanıtlandığı üzere hâlâ oldukça stabildirler.

Ancak, hücrelerin çoğalmaya devam etmesiyle birlikte, 16. güne gelindiğinde, burada yeşil renkteki DQ kolajen bir ve dört cleavage ürünlerinde görüldüğü üzere, hücrelerin matris yapısını yıkmaya başladıkları gözlemlenmiştir; matris ve hücrelerin sarı renkte birlikte floresan yaydığı alanlarda ise hücreler tarafından matrisin aktif olarak yıkımı gerçekleşmektedir. Ko-kültür hacminin 110,000 cubic micrometers olduğu üçüncü güne kıyasla, 23. güne gelindiğinde hızla çoğalan hücreler tarafından matrisin neredeyse yarısı yıkılmıştır. 16. günden 23. güne kadar geçen sürede, hacim bu güne gelindiğinde sadece 46,250 cubic micrometers'a düşmüştür.

16 ko-kültüründe, kırmızı ile gösterilen DCIS hücrelerinin yüzeyinde DQ kolajen dört proteolizi ve beyaz ile gösterilen fibroblastların yakınındaki bölgelerde yaygın DQ kolajen bir proteolizi gözlemlenebilir. Bu ko-kültürde kullanılan diferansiyel boyama, gelişim sonrası iki hücre tipinin belirgin göç ve proliferasyon modellerinin gözlemlenmesine de olanak tanır. Bu teknik, meme kanseri alanındaki araştırmacıların, kanser hücreleri ile çevreleyen stroma hücreleri arasındaki dinamik etkileşimlerin canlı hücre görüntülemesini kullanarak, tümör makroçevresinin kanser ilerlemesi üzerindeki etkilerini keşfetmelerinin önünü açmıştır.