Name: Bireysel hazırlanması Drosophila Yumurta Chambers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Öğrenin Drosophila yumurta odacıklarının canlı görüntülenmesi için diseksiyon ve mikroenjeksiyon yöntemlerini. Bu teknik mRNA lokalizasyonu ve hücre içi dinamik süreçleri incelemek için geliştirme biyolojisinde kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma I. Davis için bir Wellcome Trust Kıdemli Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.

Diseksiyon için önce 1. Drosophila hazırlığı (E. Gavis, Princeton Üniversitesi Göre) <ol><li> Seyrek ekilmiş şişe yetişkin atın ve ° C deneme öncesinde 25 şişe aktarın. Yeni yetişkin çıkmaya başladı sonra, iki gün bekleyin. </li><li> Katı gıda yaklaşık 10 ml içeren bir sineğin şişeye atın ve 45 derecelik bir açı üzerinde kuru maya 0.5-0.7 gram (bkz. tablo) ekleyin. Maya ile sinek yiyecek tüm yüzeyi örtmeyin. </li><li> Hidrat (Şekil 1A) için yeterli, maya için su birkaç damla ekleme. 45 derece şişe yerleştirin ve maya için yaklaşık 3 dakika su (Şekil 1B) kadar emmek için izin verir. </li></ol> Not: Alternatif olarak, premix bir ayrı bir kapta yapıştırın maya ve bir spatula ile flakonuna salçayı ilave edin. <ol start="4"><li> CO 2 gazı enjekte edilerek şişe içinde sinekler uyutmak. Onlar hareket durdurduğunuzda, CO 2 üzerine bilinçsiz sinekler bahşiş </ssıralama (Şekil 1C) için ub&gt; sinek pad. </li><li> Ince uçlu bir boya fırçası (Şekil 1D) ile bir diseksiyon kapsamında 10-15 kadın ve istenen genotip 5 erkek izole edin. Erkeklerde claspers varlığında, bunların arka tarafında koyu renkli bir çıkıntı yapı ile belirgindir. </li><li> Mayalı flakon (Şekil 1E) seçilen sinekler ekleyin. 24-60 saat boyunca 25 ° C &#39;de yer. Orta aşamada yumurta odaları ve geç dönem yumurta odaları için daha uzun süreler için genç daha büyük bir yüzde daha kısa sürelerde inkübe edin. </li></ol> 2. Drosophila over diseksiyonu <ol><li> Bir No 1,5, 22 x 50 mm kapak kayma (Şekil 2A) üzerine halokarbon yağı, küçük bir damla yerleştirin. Bu şekilde olmayacak tarafına hazırlanmış kapak kayma ayarlanır. </li><li> Bir CO 2 ped üzerine CO 2 gazı ve ucu enjekte mayalı aşağılık içinde sinekler uyutmak. </li><li> (Değil tarihleri ​​arasında bireysel bir karnın ön az kadın besiye kavramak için keskin ince burunlu forseps kullanmae karın ve göğüs) (Şekil 2B-C). </li><li> Forseps ile kadın tutun ve kabaca 2-3 cm hazırlanmış coverslip yukarıda, bir mikroskop altında görmek. </li><li> Hala ön az tutarak, kadın aşırı posterior (Şekil 2D) de doku çıkarmak için forseps ikinci bir set kullanabilirsiniz. Not: Gut doku genellikle posterior ucundan dışarı çeker. Forseps kaldırıldı doku silin. </li><li> Hala ön kısmındaki kadın tutarken, yavaşça gerisinde ön çalışarak, karın sıkmak veya masaj sildi forseps kullanabilir. Bir tüp ucundan diş macunu kaldırılmasıyla aynı şekilde karın masaj yapın. </li><li> İki büyük opak yapıları forseps (Şekil 2E-F) ucundaki karın ve sopa ile itilmiş olacaktır. Bu eşleştirilmiş yumurtalıklar vardır. </li><li> Aşağıdaki slaytta halokarbon yağı üzerine yumurtalıklar dokunun. </li><li> (Figür coverslip üzerine yağda 4-6 yumurtalıkların toplam vermek için diseksiyon 1-2 kez tekrarlayıne 2G). </li></ol> 3. Yalıtımlı ovaryolleri Not: Her bir ovaryum bir dize 10 boncuk gibi dizilmiş farklı aşamalarında 6 ile 10 yumurta odalarından oluşan yaklaşık 16 ovaryolleri içerir. Not: Ön ovaryolleri izole etmek aydınlatma örnek sığ bir açıyla çarptığı, böylece mikroskop üzerinde ışık kaynağı ayarlayın. Bu örnek bir kontrast sağlar ve genç aşamada yumurta odaları görselleştirme sağlar. <ol><li> Yağ olarak, kapalı forseps (Şekil 3A) ile arka ucunu (eski aşamaları) azından bağlayan doku kaldırarak iki yumurtalık ayırmak. </li><li> Sağa sola ve genç sahneye en eski aşamaları ile Orient bireysel over. Overde genç aşamada yumurta odaları şeffaf ve yumurtalık daha sivri ucunu oluşturur. </li><li> Dominant el forseps bir çift ile, hafifçe tercihen th kalıntılarından, bir yumurtalık arka kavramake bağ dokusu. Forseps ile yerde over tutarken, bireysel ovaryolleri (Şekil 3B-D) didiklemek için (veya tungsten iğne) Bir kesme prob kullanın. </li></ol> Not: eski aşamalarında tam yumurtalıktan ayrılması için çok büyük olduğu gibi bireysel ovaryolleri genç aşamaları (germarium 10 sahneledi) arasında kıracak. Not: diseksiyon prob ile geç evre oosit batırılarak yağ sızması sitoplazma neden ve bireysel ovaryolleri çıkarılması çok zor hale getirecek. Geç bir aşamada oosit delinirse, taze bir yumurtalık taşımak. <ol start="4"><li> Ovariole over ücretsizdir sonra, deneme için istenen yönde yağ damlası ve doğunun merkezine sürükleyin diseksiyon prob kullanın. Not: yağda ovaryolleri yerleşmek ve cama yapışır. </li><li> 15-25 bireysel ovaryolleri kadar bu süreci (3,3-3,4) tekrarlayın. Not: Bu multip diseksiyonu gerektirebilirle yumurtalıklar. Tüm süreç 15 dakikadan az sürer. </li></ol> Not: Daha çok deney için sineklerin n sayısını artırmak için daha az sinek her iki yumurtalık diseksiyon daha birçok sineklerden bir yumurtalık her teşrih tavsiye edilir. Not: ovariole Kaba işleme sağlıksız oosit neden olur ve deneyde eserler yol açabilir. Not: Oosit over (F Şekil 7E karşılaştırın) diseke edildikten sonra 40 dakika stres nedeniyle fenotipik değişiklikleri görüntülemek için başlayacaktır. <ol start="6"><li> Bir kez ovaryolleri yeterli bir oryantasyon (Şekil 3E) vardır, yağ fazlalığı yumurtalık dokusu dışına taşımak için diseksiyon prob ve kapalı forseps kullanabilir. Bu malzeme bir kağıt havlu üzerine forseps silinebilir. </li></ol> 4. Yalıtımlı bireysel geç dönemde yumurta odaları (E. Gavis, Princeton Üniversitesi Göre) <ol><li> Domin forseps bir çift ilekarınca yandan, tercihen bağ dokusunun kalıntıları tarafından, izole edilmiş bir yumurtalık posterior kavramak. Forseps ile yerde over tutarken, forseps yakın over (Şekil 4A) arka ucunu diseksiyon prob tanıtmak. Geç dönemde yumurta odacıkları arasındaki probu takarak herhangi bir yumurta odaları delinmesiyle kaçının. </li><li> Erken evre yumurta odaları (Şekil 4B) az çıktığında kadar over ile diseksiyon iğnesi çekin. Doğru yapıldığı zaman, sonda yer ovaryolleri ve geç dönem yumurta odaları tutan bağ dokusu kaldıracaktır. </li><li> Ovaryolleri coverslip üzerine serilen kadar 4.2 adımı yineleyin. Not: Yumurta odaları artık birbirlerinin üstüne yığılmış zaman, bu adımı tamamlandı. </li><li> Anatomi prob kullanarak, kolay görüntüleme (Şekil 4C) izin vermek için geç oosit ayırın. </li></ol> Not: İleri evre yumurta odaları diseksiyon sırasında bir oosit delme i diseksiyon gibi kınayan gibi değilgenç aşamaları için ndividual ovaryolleri. Not: Sahne 14 yumurta odaları için yönlendirme için dorsal uzantıları kavramak için forseps kullanabilir. 5.. Enjeksiyon hazırlığı Not: orta evre oositlerin enjeksiyon için, şark ovaryolleri dik kapak kayma uzun eksenine. <ol><li> [Olgumuzda Uygulamalı Hassas bir DeltaVision Çekirdek] görüntüleme mikroskop açın ve uygun görüntüleme ayarları (Şekil 5A-B) yükleyin. </li><li> Enjeksiyon aparatı (Şekil 5C) açın. </li><li> Bir yükleme ucu (Şekil 5D-E) ile enjeksiyon iğnesi yükleyin. Enjekte edilecek Çözümler enjeksiyon iğnesi engelleyebilir birikmeleri önlemek için yüksek hızda kısaca santrifüj edilmelidir. </li><li> Enjektör için yüklenen enjeksiyon iğnesi takın. Iğne (Şekil 5F) bozulmaması için özen gösterin. </li><li> Tıkanıklıkları açar iğne yardımcı olmak için, bir kesik veya kırık coverslip bir cam 2x10 mm&#39;lik küçük bir parça yerovaryolleri içeren yağ damla t bir tarafı. Bu cam parçası petrole bulanmış olduğundan emin olun. Bu cam iğne kırılma veya tıkanıklıkları açar için karşı ram iğne ucu kadar hizmet verecek. </li></ol> 6. Floresan RNA Enjeksiyon Başlamadan önce: enjeksiyon cihazı ve bir iğne görüş alanının merkezi üzerinde konumlandırılmış bu tür mikro-manipülatör kontrolleri ayarlayın. <ol><li> Mikroskop sahnede enjekte edilecek örnek monte edin. </li><li> 20x hedefi seçin. Daha yüksek veya daha düşük bir büyütme amaçları da kullanılabilir. </li></ol> Not: nokta Ziyaret yeteneği ile otomatik bir sahne kullanılarak Eğer enjeksiyon için 8-9 oosit başlamadan önce tüm sahneye işaretlemek için tavsiye edilir. Bu kolay Ziyaret ve seçilmiş oosit enjeksiyon için izin verir. <ol start="3"><li> Bu yağ değene kadar enjeksiyon iğnesi indirin. Objektif lens üzerinden Merkezi&#39;nde iğne ucu. </li><li> ÇevirmekOdanın lambalarını kapatın ve mikroskop için parlak alan ışığı açın. İşaretli noktaları listesinde ilk noktaya (oosit) seçin. Oküler bakarken, oosit (Şekil 6A) odaklanır. </li><li> Bu oosit ve oosit görünür gelecek gibi odak aynı düzlemde kadar elle iğne indirin. </li><li> Bunun içindeki yumurta olduğu kadar, manipülatör kullanılarak kontroller, enjeksiyon iğne noktası hareket eder. Hızlı bir bıçaklama hareketi genellikle yavaş bir ilerleme daha başarılı olur. İçeri girdikten sonra, iğnenin küçük bir hacim çıkarın ve görsel etkilerinin değerlendirilmesi, gerektiği gibi tekrarlayın. Enjeksiyon başarılı olursa bu, tekrar belirgin değilse, oosit içine sitoplazma, yerinden edilecektir. Bu malzeme enjekte edilmiş olup olmadığını belirlemek üzere floresans görüntü için gerekli değildir. Enjeksiyondan sonra, oosit (Şekil 6B-G) içindeki iğne çıkarılır. </li><li> Enjekte edilen sıvı miktarını kesin olarak ölçmek için zordur. Enjekte edilen hacim, adju artırmak içinenjeksiyon nabız basıncı veya zaman st, biraz açılış artırmak veya tekrarlanan enjeksiyon darbeleri kullanmak iğne ucu bölünürler. </li></ol> Not: düzgün çalıştırıldığında tüm enjeksiyon işlemi 10 saniyeden daha az almalıdır. Bıçaklama veya oosit için iğne içinde olan kalıcı kapsamlı yumurta odasına ciddi hasara neden olur. <ol start="8"><li> Sonraki işaretli oosit seçmeden önce, böylece seyahat yoldaki diğer oosit temas etmeyecek yağ enjeksiyon iğnesi yeterince yüksek yükseltmek. </li><li> Yeni oosit anda, adım 6.6 tekrarlayın. Gerekli tüm oositler enjekte kadar bu sekilde devam ediyor. </li></ol> Not: katarken, bir hata yapılırsa, sonraki işaretlenmiş oosit geçmek. Hasarlı oositlerde zaman kaybetmeyin. Not: iğne enjeksiyonu oturumu sırasında tıkanmış olabilir. Bu durumda, coverslip üzerindeki yağ içinde cam parçası kırık iğne bitişik hareket eder. Zekâh aynı odak düzlemi içinde cam ve iğne, yavaşça cam (Şekil 6H) içine iğne koç. Iğne enjeksiyon düğmesini iterek ve herhangi bir sıvı çıkar iğne ucu olmadığına bakarak unclogged olduğunu test edin. <ol start="10"><li> Tüm oositler enjekte edilmiştir zaman, elle mikroskop için ışın yolu petrol ve şark dışarı dışarı, iğne yukarı hareket ettirin. Bunu göz hasarı önlemek için, güvenli bir yönelim olduğundan emin olun. </li></ol> Not: Uzun bir süre yumurta odasına izolasyon ve oosit enjeksiyon arasında geçmiş ise, oosit stresle ilişkili fenotipik değişiklikler ekleme ve sergilemek zor olacak. Benzer sorunları oosit veya aşırı hacimli enjeksiyon (Şekil 6i karşılaştırmak, J, K) kaba işleme ile ortaya çıkabilir. 7. Görüntüleme deneysel tasarım Canlı <ol><li> Listeden ilk enjekte oosit seçin. Enjeksiyon floresans görüntüleme bir çerçeveden (a tarafından yumurta içinde olduğu TestiŞekil 6g s). </li><li> Dalgaboyu, emisyon yolu, uyarılma süresi, Z-yığını ve koleksiyonları arasında zaman: dahil, deneysel parametreleri, yapılandırın. Not: Bu ile ilgili daha fazla bilgi için bkz: Parton R., ve ark. (2010) 2. </li><li> Veri seti toplayın. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Alexa-546 GRK RNA sentez in vitro bir Me31B :: GFP yumurta haznesi (Şekil 7A) içine enjekte edildi. RNA oosit dorsal anterior lokalize ve çekirdeğin etrafında bir kap (Şekil 7B) oluşturur. RNA yerelleştirme daha fazla örnek için MacDougall N., ve ark. (2003) 11. Floresan etiketli proteini (Tau-GFP, Şekil 7C) veya RNA etiketleme sistemleri (GRK * mCherry, Şekil 7D) ifade Orta ve geç evre oosit enjeksiyonu olmadan görüntülenebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Şekil 1.. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Şekil 2. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Şekil 3. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Şekil 4. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Şekil 5. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> 6 Şekil. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Şekil 7.

<ol><li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParton%2C+RM+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory%22">Live Cell Imaging: A Laboratory</a>. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).</li>
<li>Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+messages%3A+the+intracellular+localization+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Moving messages: the intracellular localization of mRNAs.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).</li>
<li>Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Message+on+the+Move%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Message on the Move.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).</li>
<li>Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gurken+and+the+I+factor+retrotransposon+RNAs+share+common+localization+signals+and+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery.</a> Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).</li>
<li>Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Squid%2FhnRNP+helps+Dynein+switch+from+a+gurken+mRNA+transport+motor+to+an+ultrastructural+static+anchor+in+sponge+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies.</a> Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).</li>
<li>Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+fluorescently+labeled+endogenous+gurken+mRNA+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila.</a> J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).</li>
<li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+endogenous+mRNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).</li>
<li>Bertrand, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gurken+%28TGFalpha%29+mRNA+localizes+as+particles+that+move+within+the+oocyte+in+two+dynein-dependent+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps.</a> Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+migrating+border+cell+cluster+in+living+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers.</a> Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+bicoid+mRNA+anchoring+highlight+conserved+mechanisms+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition.</a> Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

<html> Canlı hücre görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel süreçler incelenmesi için güçlü bir tahlil oluşturmaktadır. Basit parlak saha gözlem ek olarak, proteinler ve ilgi RNA&#39;lar için flüoresan etiketlerin Ayrıca çok önemli gelişmeler yol açmıştır. Burada genetik ve biyokimyasal testler ile birlikte kullanılabilir görüntüleme bireysel yaşam oositler için bir protokol özetlediğim. Bu protokol, biz de deneysel enjeksiyon yoluyla yaşam oosit işlemek için nasıl açıklayabilir. Doğrudan bir RNA Lokalizasyon (Ball ve Davis, yayınlanmamış) ve proteinlerin 6 işlevini inhibe antikorlar deneyi için ikincil bir yapının özelliği flüoresan etiketli RNA sentez in vitro dahil olmak üzere enjekte etmek için malzeme için pek çok olasılık, bulunmaktadır. Gelecekteki çalışmalar olasılıkla diğer etiketleme bileşenleri ve moleküler mekanizmaları test edilmesi sağlanarak yaşam oosit hücresel makine tanıtımı göreceksiniz. t &quot;&gt; canlı hücreler çalışırken dokusunun canlılığını ve sağlık esastır. korunması bu protokol, biz yumurta odasının strese yol açabilecek bir dizi adım işaret. Örneğin, petrol görüntüleme için üstün olmasına rağmen, petrol genişletilmiş kültür yumurta odasında stres neden olabilir. Bu kolay (Figure7F için Şekil 7E (stressiz) karşılaştırmak (stres altında deforme ve bleb edecek nükleer morfoloji ve konumu, oosit zarı inceleyerek parlak alan maruziyeti altında izlenebilir )) vurguladı. Sahne 9 yumurta odaları RNA lokalizasyon ve çoklu saat boyunca sınır hücre migrasyonu 12 gösteriyor. Ancak, bir sahne 7/8 yumurta odasına kaldırılıyor over yaklaşık 40 dakika sonra halo karbonlu yağ kötü etkileri sergilemeye başlayacak kadın. Geç aşamada yumurta odaları, 14 sahne 11, çünkü bu aşamalar 13 folikül hücrelerinden yumurta kabuğu salgılanması yağı veya sulu ortam ya da normal gelişebilir. Bu repo oldusulu böcek orta insülin Ayrıca 6 saate 14 ve germaria kadar 14 saat 15 için sahne 9 oosit koruyabilirsiniz rted. Bu oosit vurguluyor ve canlılığı azaltır gibi tüm durumlarda, yumurta odasının agresif manevralar, kaçınılmalıdır. Görüntüleme yumurta odaları az ve tedavi etmek için özen her yavaşça optimum canlılığı sağlamak için en iyi yoldur.

Diseksiyon kullanılan araçlar temiz olmalıdır ama otoklavlanabilir gerekmez. ETOH ile araçları silin ve onları başından önce kurumasını bekleyin. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnce uçlu bir boya fırçası (Sanatçılar Sable, yuvarlak, büyüklüğü 00 veya 0) </td><td> Çoğu sanat malzemeleri çıkışlarından Mevcut </td><td></td><td> İyi bir fırça önemlidir </td></tr><tr><td> Halokarbon Ürünleri A.Ş., Seri 95 </td><td> Halokarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Avrupa dağıtıcısı: Solvadis (GMBH) Yağ ile hava gazı ile oksijen emin olun. </td></tr><tr><td> Slip-Hayır örtün. 50mm 1,5, 22 x </td><td> Uluslararası-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; ucu da iyi ama daha kırılgan </td></tr><tr><td> Prob Kesme </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Kesme </td><td> Olympus </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 pad </td><td> Üzerinden kullanılabilir <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Genesee Bilimsel bir bölümü) </td><td> 59-114 (789.060 Dutscher) </td><td> Avrupa dağıtıcısı: www. dutscherscientific. com</a> / Özel kendi sinek yastıkları inşa etmek de nispeten kolaydır </td></tr><tr><td> KimCare </td><td> Kimbery Clark-KimCare Medikal mendil </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop-DeltaVision </td><td> Uygulamalı Hassas </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipülatör </td><td> Burleigh mikromanipülatörler Lümen Dynamics Grup inc gelen. 2260 Argentia Road, Toronto, Ontario, L5N 6H7 Kanada </td><td> Burleigh PCS-5000 serisi, TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Eski adıyla Exfo) </td></tr><tr><td> Enjeksiyon aparatı </td><td> TriTech Research, Inc 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> Eppendorf Femptotips almak için bir tutucu ile Modifiye </td></tr><tr><td> Enjeksiyon iğne </td><td> Eppendorf Steril Femtotips I ve II </td><td> 930000043 </td><td> Farklı ipuçları farklı uygulamalar için daha iyi </td></tr><tr><td> Ipuçları 20μl Yükleniyor </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Kuru aktif maya </td><td> Fleischmann Mayası </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

bireysel hazırlanması drosophila</emcanlı görüntüleme için> yumurta chambers

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Canlı hücre görüntüleme gibi eksen özellikleri, hücre farklılaşması ve organogenez 1 gibi konuları araştırmak için model olarak kullanılan Drosophila dokuların bir dizi uygulanan önemli bir tekniktir. Deney örneklerinin Doğru hazırlık çok önemli, ihmal, bir adımdır. Hazırlık amacı fizyolojik uygunluğu sağlamak ve optimal görüntüleme koşulları oluşturmaktır. Doku canlılığını korumak için, dehidratasyon, hipoksi, aşırı ısınma veya orta bozulma 2 önlemek için önemlidir. Drosophila yumurta odası beden desenleme, mRNA lokalizasyon ve hücre iskeleti organizasyonu 3,4 ile sınırlı ilişkin soruları inceleyerek değil, iyi kurulmuş bir sistemdir. Erken ve orta dönem yumurta odaları için, halokarbon petrol montaj bu, oksijen serbest difüzyon sağlar dehidratasyon ve hipoksi önler ve mikroskopi için mükemmel optik özelliklere sahip olduğunu hayatta kalmak için iyidir. Imfloresan proteinlerin yaşlanma yumurta odası veya etiketli RNA, protein ya da 5-7 antikorların fiziksel enjeksiyon transgenlerin getirilmesi ile mümkündür. Örneğin, hayvanların genomuna MS2 yapıları Ayrıca yumurta 8&#39;de mRNA&#39;lar gerçek zamanlı gözlem sağlar. Bu yapıları da 9 kat protein ile MS2 bakteriyofaj RNA kök döngü etkileşim kullanımı yoluyla mRNA in vivo etiketleme için izin verir. Burada, biz de dişi Drosophila tek tek ovaryolleri ve yumurta odaları izole olarak yumurtalıkların çıkarılması için bir protokol mevcut. Drosophila oogenez see Allan C. Spradling (1993, 2009 basıldı) 10 ayrıntılı bir açıklama için.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta oda mRNA lokalizasyon mekanizmaları eğitim için mükemmel bir modeldir. Lokalizasyon ve süreçlerini desteklemek dinamik olayları yakalamak için, canlı dokuda hızlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü görüntüleme gereklidir. Burada, diseksiyon ve minimum kesinti ile canlı örnekleri görüntüleme için bir protokol mevcut.

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Canlı hücre görüntüleme, eksen belirleme gibi konuları araştırmak için model olarak kullanılan birçok Drosophila dokusuna uygulanan önemli bir tekniktir...

Aşağıdaki deneyin amacı, canlı drosophila U bölgelerindeki dinamik süreçleri kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle iyi beslenmiş iki günlük dişi sineklerden sağlam yumurtalıkların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, yumurta odacıklarını görüntülemek için yumurtalıklardan tekil ariolalar çıkarılır.Ardından, eğer uygun bir floresan protein eksprese ediyorlarsa, tekil yumurta odacıkları doğrudan görüntülenebilir veya görüntüleme öncesinde floresan markörlerin mikroenjeksiyonu gibi ileri manipülasyonlara tabi tutulabilir. Nihayetinde, film dizilerinin analizi yoluyla, hücre içi bileşenlerin dinamik etkileşimi ortaya çıkarılabilir. Bu yöntem, RNA taşınımı ve lokalize translasyon alanındaki bazı temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olmuştur.Örneğin, vücut planını oluşturan proteinlerin ekspresyonu, canlı organizmada zaman ve mekan açısından nasıl düzenlenir? Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, yöntem önemli ölçüde hız ve beceri gerektirdiği için zorluk yaşayacaklardır. Her iki durumda da pratik yaparak daha iyi sonuçlar elde edilecektir.Yumurta odacıklarının manipülasyonlarının metinle aktarılmasının zor olması ve sabırlı bir teknik uzmanlık ile emin ellere ihtiyaç duyulması nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu prosedüre, bir lamel üzerine küçük bir damla halokarbon yağı damlatıp kenara ayırarak başlayın. Ardından, hazırlanan sinekleri karbondioksit ile anestezi altına alın.Şişman bir dişi sineği abdomenin ön kısmından yakalamak için ince uçlu keskin bir pens kullanın. Abdomen merkezinden yakalamayın. Dişiyi, hazırlanmış lamelin yaklaşık iki ila üç santimetre üzerinde tutun.İkinci bir pens kullanarak, dişinin en arka kısmındaki dokuyu çıkarın. Bu işlem genellikle temiz penslerle bağırsak dokularını da kapsayacaktır. Karın bölgesini, bir tüpten diş macunu sıkar gibi, ön uçtan arka uca doğru nazikçe masaj yaparak itin.Yumurtalıklar büyük, opak yapılar gibi görünür ve pensetin ucuna yapışacaktır. Yumurtalıkları, lam üzerindeki halo karbon yağına dokundurarak toplayın. Ardından, dört ila altı yumurtalık toplayana kadar bu işlemi tekrarlayın.Hava organlarını izole etmeden önce mikroskoptaki ışık kaynağını, aydınlatmanın lama sığ bir açıyla vurmasını ve dokular üzerinde kontrast gölgeler oluşturmasını sağlayacak şekilde ayarlayın. Sinekleri diseke ederken doğru aletleri kullanmak çok önemlidir.Kullandığımız işaretleyici, dokuya zarar vermemesi için çok keskin değil, ancak kullandığımız cımbızları kavrayabilmemiz için yeterince kütle sahiptir. Yine, dokulara zarar vermeyecek kadar keskin olmayan ancak aleti bükmeden manipülasyon yapabilmemiz için yeterli olan bir uç yapısına sahiptir. Ayrıca, aletlerin temiz olması çok önemlidir, bu nedenle prosedür boyunca kapalı penset kullanarak onları düzenli olarak temizliyoruz.Arka uçtaki bağ dokusunu uzaklaştırarak iki ovaryumu birbirinden ayırın. Arka uç, en olgun yumurta odacıklarına sahiptir. Bir ovaryumu, en genç yumurta odacıkları baskın elinize bakacak şekilde yatay olarak konumlandırın.Ardından, posterior ucu kalan bağ dokusundan nazikçe kavrayın ve tek tek egg chamber'ları ayırmak için bir diseksiyon probu veya tungsten iğne kullanın; Jamar aşamasından 10. aşamaya kadar olan egg chamber'lar birbirinden ayrılacaktır, ancak daha yaşlı egg chamber'lar ovaryuma tutunmuş halde kalacaktır. Prob ile, ayrılan 15 ila 25 egg chamber'ı dikkatlice yağ damlasının merkezine sürükleyin. Birden fazla ovaryumun disseke edilmesi gerekiyorsa, farklı bir sinekten bir tane seçin.Fazla yumurtalık dokusunu atın ve hızlı çalışın, çünkü sitler stres nedeniyle fenotipik değişiklikler göstermeye başlayacaktır. Yumurtalıktan diseke edildikten 40 dakika sonra, fazla yumurtalık dokusunu yağdan çıkarın. Orta evre sitlerin enjeksiyonu için temiz aletler kullanarak, aerialleri lamelin uzun eksenine dik şekilde konumlandırın. Geç evre yumurta odacıklarını izole etmek için.Daha önce açıklandığı üzere, yumurtalığın posterior kısmının tutulmasıyla farklı bir yöntem gereklidir. Diseksiyon probunu, forsepslerin yakınındaki yumurtalığın posterior ucundan içeri yerleştirin. Yumurta odacıklarını delmemek için, probu geç evreli yumurta odacıklarının arasına yerleştirin.Diseksiyon iğnesini, erken evre yumurta odacıklarından çıkana kadar overin içinden geçirin. Doğru yapıldığında, prob, aerialleri ve geç evre yumurta odacıklarını yerinde tutan bağ dokusunu temizleyecektir. Aerialler lam üzerinde yayılana kadar bu adımı tekrarlayın.Yumurta odacıkları artık üst üste istiflenmediğinde, bu adım tamamlanmış demektir. Görüntülemeyi kolaylaştırmak için bir diseksiyon probu kullanarak geç evre yumurta odacıklarını birbirinden ayırın; Evre 14 boyun odacıklarını konumlandırmak için dorsal eklerini tutmak üzere penset kullanın.Enjekte edilecek solüsyonları, yüksek hızda kısa süreli santrifüj ederek hazırlayın. Bu işlem, enjeksiyon iğnesini tıkayabilecek katı çökmeleri pellete dönüştürecektir. Ardından, bir yükleme ucuyla enjeksiyon iğnesini doldurun ve yüklü enjeksiyon iğnesini dikkatlice enjektöre takın.Şimdi küçük bir cam parçasını numunelerin yanına yerleştirin ve lamı mikroskop tablasına monte edin. Cam, kırılmayı veya açılmayı önlemek için bir duvar görevi görecektir. İğneyi çıkarın.Mikroskobu ve enjeksiyon düzeneğini deney için hazırlayın. İğne ucunu kırmamaya dikkat edin. Mümkünse, enjeksiyon yapılacak tüm sekizinci ve dokuzuncu evre sitlerini işaretlemek için nokta ziyaret kapasitesine sahip otomatik bir tabla kullanın.Şimdi, enjeksiyon iğnesini yağa değene kadar indirin. İşaretli noktalar listesinden ilk noktayı seçin ve hücreye odaklanın. İğneyi, hücre ile aynı odak düzlemine gelene kadar manuel olarak indirin.Manipülatör kontrollerini kullanarak, enjeksiyon iğnesinin ucunu U bölgesinin içine girene kadar hareket ettirin. Hızlı bir saplama hareketi genellikle yavaş bir hareketten daha başarılı olur. İğne içeri girdikten sonra, küçük bir hacimde sıvı boşaltın ve etkileri görsel olarak değerlendirin.Tekrar gereklidir. Enjeksiyon başarılı olursa, hücrenin içindeki sitoplazma yer değiştirmiş olacaktır. Enjekte edilen sıvı miktarının kesin olarak belirlenmesi zordur.Enjekte edilen hacmi artırmak için ya basıncı ya da enjeksiyon impuls süresini ayarlayın. İğne açıklığını hafifçe artırmak için iğne ucunu kırın veya bir sonraki mark.Cyte'ı seçmeden önce sadece birden fazla enjeksiyon impulsu uygulayın. Enjeksiyon iğnesini, diğer sitlelere çarpmayacak şekilde yağ içerisinde yeterince yükseğe kaldırın.İğneyle sit içerisinde aşırı batırma veya bekleme, yumurta odasına ciddi şekilde zarar verir. Bu nedenle hızlı olun. Enjeksiyon 10 saniyeden daha kısa sürmelidir.Bir hata yapıldığında, bir sonraki işaretleme alanına geçin. Hasarlı bölgelerde zaman kaybetmeyin. İğne tıkandığında, iğneyi kırık cam parçasına götürün.Cam ve iğne aynı odak düzlemindeyken, iğneyi nazikçe camın içine itin. Enjeksiyon düğmesine basarak iğnenin ucundan sıvı çıkıp çıkmadığını kontrol edin ve iğnenin tıkalı olmadığını test edin. Tüm US bölgeleri enjekte edildiğinde, iğneyi manuel olarak yağdan çıkarın ve mikroskobun ışın yolunun dışına yönlendirin.Göz hasarını önlemek için güvenli bir yönlendirmede olduğundan ve ışıkların kapalı olduğundan emin olun. Floresan görüntüleme işlemini kolaylaştırmak için hız büyük önem taşır. Yumurta odacığı izolasyonu ile sit enjeksiyonu arasında bir saat veya daha fazla süre geçtiyse, sitlerin enjekte edilmesi zorlaşacak ve stresle ilişkili fenotipik değişiklikler görülecektir.Cyte'un kaba taşınması veya aşırı hacimlerin enjeksiyonu ile benzer sorunlar ortaya çıkabilir. Trenchgenic floresan proteinler eksprese eden yumurta odacıkları, enjeksiyona gerek kalmadan görüntülebilir. Endojen RNA'nın MS iki etiketlemesi, in vitro sentezlenen tam prosedürün kullanıldığı doku izolasyon prosedürleri ile iyi sonuçlarla görüntülenebilir.Alexa 546 işaretli RNA, bir ME 31 BGFP yumurta odasına enjekte edildiğinde, RNA sitoplazmanın dorsal anterior bölgesinde lokalize olmuş ve çekirdeğin etrafında bir kap oluşturmuştur. Uzmanlaşıldığında, bu teknik diseksiyondan görüntüleme başlangıcına kadar yaklaşık 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, hızlı ancak dikkatli çalışarak dokuyu korumaya özen gösterin. Bu videoyu izledikten sonra, canlı Drosophila sitoplazmalarındaki dinamik süreçlerin nasıl kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila embriyolar canlı görüntüleme analizi hazırlama, basit, ucuz ve etkili bir yöntem sunulmuştur. Bizim protokol nem ve gaz değişimi sağlar ve Drosophila embriyo sıkıştırmak değil. Bu yöntem, GFP tabanlı bir stereomikroskopta ya da dik bileşik mikroskop kullanarak Drosophila embriyoların canlı görüntüleme için uygundur.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar.  Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Bu protokolün amacı, Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır.

Canlı Görüntüleme Kullanarak Oksidatif Hasarın Drosophila Yumurta Odaları Üzerindeki Etkilerini Görselleştirme

Drosophila'da, oosit çekirdeği oogenez sırasında mikrotübül bağımlı göçe uğrar. Burada, yumurta odaları ex-vivo üzerinde canlı görüntüleme yaparak göçü takip etmek için geliştirilen bir protokolü açıklıyoruz. Prosedürümüz, iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak çok konumlu 3D hızlandırılmış filmler elde etmek için yumurta odalarını 12 saat boyunca canlı tutar.

Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin Drosophila yumurta odacıklarının canlı görüntülenmesi için diseksiyon ve mikroenjeksiyon yöntemlerini. Bu teknik mRNA lokalizasyonu ve hücre içi dinamik süreçleri incelemek için geliştirme biyolojisinde kullanılır.

Bireysel hazırlanması Drosophila Yumurta Chambers

Daha fazla video keşfet