Bireysel hazırlanması Drosophila Yumurta Chambers

Aşağıdaki deneyin amacı, yaşayan drosophila U bölgelerindeki dinamik süreçleri kaydetmektir. Bu, öncelikle iyi beslenmiş iki günlük dişi sineklerden sağlam yumurtalıkların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, yumurta odacıklarını görüntülemek için yumurtalıklardan bireysel aerialler çıkarılır.

Ardından, uygun bir floresan protein eksprese ediyorlarsa, tekil yumurta odaları doğrudan görüntülenebilir veya görüntüleme öncesinde floresan markerların mikroenjeksiyonu gibi ileri manipülasyonlara tabi tutulabilir. Nihayetinde, film dizilerinin analizi yoluyla hücre içi bileşenlerin dinamik etkileşimi ortaya çıkarılabilir. Bu yöntem, RNA transportu ve lokalize translasyon alanındaki bazı temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olmuştur.

Örneğin, vücut planını oluşturan proteinlerin ekspresyonu, canlı organizmada zaman ve mekan açısından nasıl regüle edilir? Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, işlem önemli ölçüde hız ve el becerisi gerektirdiği için zorlanacaklardır. Her iki durumda da pratik yaparak daha iyi sonuçlar elde edilecektir.

Yumurta odacıklarının manipülasyonlarını metinle aktarmak zor olduğundan ve sabırlı bir teknik uzmanlık ile emin ellere ihtiyaç duyulduğundan, bu yöntemin görsel demonstrasyonu kritik öneme sahiptir. Bu prosedüre, bir lameli üzerine küçük bir damla halokarbon yağı damlatarak ve lameli kenara ayırarak başlayın. Ardından, hazırlanan sinekleri karbondioksit ile anestezi edin.

Şişman bir dişi sineği, abdomenin ön kısmından yakalamak için ince uçlu, keskin bir pens kullanın. Abdomen merkezinden yakalamayın. Dişiyi, hazırlanmış lamellenin yaklaşık iki ila üç santimetre üzerinde tutun.

İkinci bir pens çifti kullanarak, dişinin en arka kısmındaki dokuyu uzaklaştırın. Bu işlem genellikle temiz pensler yardımıyla bağırsak dokularını da kapsayacaktır. Karın bölgesini, bir tüpten diş macunu sıkar gibi, ön uçtan arka uca doğru nazikçe masaj yaparak itin.

Overler büyük opak yapılar gibi görünür ve forsepsin ucuna yapışır. Overlere lam üzerindeki halo karbon yağına dokundurarak onları toplayın. Ardından, dört ila altı over toplanana kadar işlemi tekrarlayın.

Hava kısımlarını izole etmeden önce, mikroskoptaki ışık kaynağını, aydınlatma lamete sığ bir açıyla gelecek ve dokular üzerinde kontrastlı gölgeler oluşturacak şekilde ayarlayın. Sinekleri diseke ederken doğru aletleri kullanmak çok önemlidir.

Kullandığımız prob, dokuya zarar vermemesi için çok keskin değil, ancak kullandığımız cımbızları kavrayabilmemiz için yeterince kütlemiştir. Aynı şekilde, cımbızlar da dokulara zarar vermeyecek kadar keskin olmayacak, fakat aleti bükmeden manipülasyon yapabileceğimiz kadar hassas olmalıdır. Ayrıca, araçların temiz olması çok önemlidir, bu nedenle prosedür boyunca kapalı forsepsler kullanarak bunları düzenli olarak temizliyoruz.

Arka uçtaki bağlantı dokusunu temizleyerek iki yumurtalığı birbirinden ayırın. Arka uç, en olgun yumurta odacıklarını içerir. Yumurtalıklardan birini, en genç yumurta odacıkları baskın elinize bakacak şekilde yatay olarak konumlandırın.

Ardından, posterior ucu kalan bağ dokusundan nazikçe kavrayın ve tekil oositleri ayırmak için bir disseksiyon probu veya tungsten iğne kullanın; Jamar evresinden evre 10'a kadar olan tekil yumurta odacıkları birbirinden ayrılacak, ancak daha yaşlı yumurta odacıkları ovaryuma tutunmaya devam edecektir. Prob ile 15 ila 25 adet ayrılmış oositi dikkatlice yağ damlasının merkezine sürükleyin. Birden fazla ovaryumun disseksiyonu gerekiyorsa, her birini farklı bir sinekten seçin.

Sitositler stres nedeniyle fenotipik değişiklikler göstermeye başlayacağı için fazla yumurtalık dokusunu atın ve hızlı çalışın. Yumurtalıktan ayrıldıktan 40 dakika sonra, fazla yumurtalık dokusunu yağdan çıkarın. Orta aşamadaki sitositlerin enjeksiyonu için temiz aletler kullanarak, antenleri lamelin uzun eksenine dik şekilde konumlandırın. Geç evre yumurta odacıklarını izole etmek için.

Daha önce açıklandığı gibi overin posterior kısmını tutarken farklı bir yöntem gereklidir. Diseksiyon probunu, forsepsin yakınındaki overin posterior ucundan içeri yerleştirin. Yumurta odalarını delmemek için probu geç evre yumurta odalarının arasına yerleştirin.

Diseksiyon iğnesini, erken evre yumurta odacıklarından çıkana kadar overin içinden geçirin. İşlem doğru yapıldığında, prob, ariolleri ve geç evre yumurta odacıklarını yerinde tutan bağ dokusunu temizleyecektir. Arioller lam üzerinde yayılana kadar bu adımı tekrarlayın.

Yumurta odacıkları artık üst üste istiflenmediğinde, bu adım tamamlanmış olur. Görüntülemeyi kolaylaştırmak için bir diseksiyon probu kullanarak geç evre yumurta odacıklarını ayırın; Evre 14'ü konumlandırmak için boyun odacıklarının dorsal eklerini pensetle kavrayın.

Enjekte edilecek solüsyonları, kısa süreli yüksek hızda santrifüj ederek hazırlayın. Bu işlem, enjeksiyon iğnesini tıkayabilecek katı çökmelerin pelitlemesini sağlayacaktır. Ardından, enjeksiyon iğnesini bir yükleme ucuyla doldurun ve yüklü enjeksiyon iğnesini dikkatlice enjektöre takın.

Şimdi, örneklerin yanına küçük bir cam parçası yerleştirin ve lamı mikroskop tablasına sabitleyin. Cam, kırmak veya açmak için bir duvar görevi görecektir. İğneyi çıkarın.

Mikroskobu ve enjeksiyon düzeneğini deney için hazırlayın. İğne ucunu kırmamaya dikkat edin. Mümkünse, enjeksiyon için tüm sekizinci ve dokuzuncu evre sitlerini işaretlemek amacıyla nokta ziyaret yeteneğine sahip otomatik bir tabla kullanın.

Şimdi, enjeksiyon iğnesini yağa değene kadar indirin. İşaretli noktalar listesinden ilk noktayı seçin ve hücreye odaklanın. İğneyi, hücreyle aynı odak düzlemine gelene kadar manuel olarak indirin.

Manipülatör kontrollerini kullanarak, enjeksiyon iğnesinin ucunu U bölgesinin içine girene kadar hareket ettirin. Hızlı bir saplama hareketi genellikle yavaş bir hareketten daha başarılı olur. İğne içeri girdikten sonra, iğneden küçük bir hacim boşaltın ve etkileri görsel olarak değerlendirin.

Tekrar gereklidir. Enjeksiyon başarılı olursa, hücre içindeki sitoplazma yer değiştirir. Enjekte edilen sıvı miktarını kesin olarak belirlemek zordur.

Enjekte edilen hacmi artırmak için enjeksiyon darbesinin basıncını veya süresini ayarlayın. İğne açıklığını hafifçe artırmak için iğne ucunu kırın veya bir sonraki mark.Cyte'ı seçmeden önce basitçe birden fazla enjeksiyon darbesi uygulayın. Enjeksiyon iğnesini, diğer sytelerle çarpışmayacağı şekilde yağ içerisinde yeterince yükseltin.

İğneyle hücre içine çok fazla girip çıkmak veya iğneyi içeride uzun süre tutmak, yumurta odasına ciddi zarar verir. Bu nedenle hızlı olun. Enjeksiyon işlemi 10 saniyeden kısa sürmelidir.

Bir hata yapıldığında, bir sonraki işaretleme bölgesine geçin. Hasarlı bölgelerle vakit kaybetmeyin. İğne tıkandığında, iğneyi camın kırık parçasına hareket ettirin.

Cam ve iğne aynı odak düzlemindeyken, iğneyi nazikçe cama saplayın. Enjeksiyon düğmesine basarak iğnenin ucundan herhangi bir sıvının çıkıp çıkmadığını kontrol edin ve iğnenin tıkanmadığını doğrulayın. Tüm US bölgeleri enjekte edildikten sonra, iğneyi manuel olarak yağdan çıkarın ve mikroskop ışın yolunun dışına yönlendirin.

Göz hasarını önlemek için güvenli bir yönlendirmede olduğundan ve ışıkların kapalı olduğundan emin olun. Floresan görüntüleme hızını kolaylaştırmak zorunluluktur. Yumurta odacığı izolasyonu ile sit enjeksiyonu arasında bir saat veya daha fazla süre geçtiyse, sitleri enjekte etmek zor olacaktır ve stresle ilişkili fenotipik değişiklikler sergileyeceklerdir.

Benzer sorunlar, cyte'ın kaba elleçlenmesi veya aşırı hacimlerde enjeksiyon yapılmasıyla da ortaya çıkabilir. Trenchgenik floresan proteinler eksprese eden yumurta odaları, enjeksiyon gereksinimi olmadan görüntülenebilir. Endojen RNA'nın MS iki etiketlemesi, in vitro sentezlenen tam prosedür kullanılarak gerçekleştirilen doku izolasyon prosedürleri ile iyi sonuçlarla görüntülenebilir.

Alexa, 5 46 kin, RNA bir ME 31 BGFP yumurta odasına enjekte edildiğinde, RNA hücrenin dorsal ön kısmına lokalize olmuş ve çekirdek etrafında bir başlık oluşturmuştur. Bu teknik, disseksiyon anından görüntülemenin başlamasına kadar yaklaşık 10 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, hızlı ancak dikkatli çalışarak dokuyu korumaya özen gösterin. Bu videoyu izledikten sonra, canlı Drosophila hücrelerindeki dinamik süreçlerin nasıl kaydedileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.