Name: Melezleme In situ Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin sivrisinek dokularında ve embriyolarında gen ifadesi lokalizasyonunu belirlemek için hibridizasyon in situ protokolünü. Bu yöntem, fonksiyonel genomik araştırmalarında transkript birikim desenlerini görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar sonrasında uyarlanmış ve hibridizasyon için buraya açıklanan protokolü geliştirmek için modifiye edilmiştir Anofel gambiae embriyoların, in situ hibridizasyon için protokollerin tartışma için yumuşak doku ve Yuri Goltsev in situ yöntemler geliştirmek hibridizasyon tavsiye için Marika Walters teşekkür etmek istiyorum Aedes ve Culex embriyoların yerinde. Ayrıca Adam Pare ve David Kosman tarafından verilen yararlı öneriler kabul ediyorsunuz. Biz bilimsel tartışma Osvaldo Marinotti teşekkür ediyor ve protokol metin düzenleme.

<ol><li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit.+Vectors%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1(2011).</li>
<li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228(2007).</li>
<li>Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).</li>
<li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSappington%2C+TW+%22The+Molecular+Biology+of+Insect+Disease+Vectors%3A+A+methods+manual%22">The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual</a>. , Chapman & Hall. London. (1997).</li>
<li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li>
<li>Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research.+Malaria+Research+and+Reference+Reagent+Resource+Center+%28MR4%29%22">Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</a>. , (2007).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes%2C+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li>
<li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+nanos+%28nos%29+and+oskar+%28osk%29+orthologues+of+the+vector+mosquito%2C+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).</li>
<li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg%5BTitle%5D)+AND+%22Izv.+Akad.+Nauk+SSSR+ser.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li>
<li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li>
<li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584(2011).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29+I.+Description+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir açıklamaları var.

Situ ve kolorimetrik boyama protokolünde hibridizasyon tüm montaj sivrisinek doku ve embriyolar için buraya sunulan belirli organ ve hücre tipleri içinde transkript lokalizasyonu için yararlı bir tekniktir. Bu prosedürler bizim daha önce bildirilen yöntemlere göre, hem geniş yıkama adımları hızlandırarak ve ek teknik bilgi ve reaktif kaynaklardan sağlayan bir iyileşme vardır. Deneyimlerimize göre, melezleme sinyallerin kolorimetrik tespiti floresans tabanlı algılama düzenleri göre melezleşme sinyali hassasiyet ve netlik açısından üstündür. Ayrıca kolorimetrik tespiti gereği otomatik floresan olan embriyolar, sinyal ayrımcılık ile ilgili sorunları circumvents. Düşük bolluk transkript hedeflenen zaman hibridizasyon sinyalleri tespit Sınırlamalar, meydana ve arka plan boyama açıktır. 65 hibridizasyon sıcaklığının artmasıyla ° C geri azaltmak için bulunmuşturzemin hibridizasyon sinyalleri, ama tek hedefi özgü RNA probları tasarımı için önerilen bir alternatifi değildir. Bu protokol tüm montaj tükürük Aedes aegypti bezler ve yumurtalıklar ve Anofel gambiae, Anofel stephensi, Ae embriyoların in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. aegypti ve Culex quinquefasciatus. Bu yöntem diğer sivrisinek dokulara uygulanan ve muhtemelen diğer böceklerin gelenler. Ayrıca, üç vektör sivrisinek, Ae embriyonik gelişim evreleme için ilk kez karşılaştırmalı kılavuzlar için derlenmiş. aegypti, An. gambiae ve Cx. fatigans. Gözlemler sağduyulu yetiştirme koşullarında bu üç türün belirli suşları için bildirilmiştir. Bu gelişme süresi tabii sivrisinek türlerinin farklı suşları için ve farklı yetiştirme koşullarında değişiklik dikkat etmek önemlidir. In situ ekinde hibridizasyonları ana çabaları devam edenSivrisinek ve diğer eklembacaklıların transcriptomes lyze ve bu organizmaların gen ifadesinin düzenlenmesinde daha iyi bir görüntü sağlayabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml mikrofüj tüpler </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Örnekleri görselleştirilmesi yardımcıları; az standart tüplere göre daha opak </td></tr><tr><td> Deiyonize formamid </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> DEPC su </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> % 5.25 Sodyum hipoklorit </td><td> Austin&#39;in </td><td></td><td> A-1 Marka </td></tr><tr><td> T3 RNA Polimeraz-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> % 95 Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand atılabilir polietilen transferi pipetler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> % 37 Formaldehit </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grade metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop cam kapak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-heptan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-ksilen </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-iyi Nokta Plaka </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum hidroksit </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus mikroskop </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Kırmızı Clear-liner peruk bant </td><td> Doğrudan Saç </td><td> KIRMIZI-75R12 </td><td> Poly / x 12 yd bant rulo Cilt temel malzeme 0.75 </td></tr><tr><td> One ile Sequening için TOPOTA Klonlama Takımı Top10 kimyasal yetkili E. Shot coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reaksiyonlar 40 reaksiyonlar </td></tr><tr><td> Sonicated somon sperm DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-AP Fab fragmanları </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etiketleme mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> NBT / BCIP stok solüsyonu </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> Batı Engelleme Reaktif </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech polyester mesh (330,130) </td><td> Saati Yazdır </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 Konuları / inç, 34 mikron iplik çapı, turuncu renkli </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> PBT% 70 </td></tr><tr><td> Heparin sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> % 37 Formaldehit </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Amber ampul içinde 10 ml hacme </td></tr><tr><td> 16 oz. Kapaklı Yalnız Kağıt konteynerleri </td><td> Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam scintillatbekâr vidalı kapaklı iyon flakon </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 500, 20 ml durumda </td></tr><tr><td> Mühürlü Balonlu şal hücresel yastıklama malzemesi </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 / ayak rulo 0,188 inç kalınlığında </td></tr><tr><td> Tavuk serumu </td><td></td><td></td><td> Tam kan ya kanat damardan ya da bir yavru tavuktan kalp ponksiyonu ile toplanır edildi. Kan soğutulmuş ve daha sonra 30 dakika süreyle buz üzerinde yerleştirilmiş kadar 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edildi. Serum 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de toplandı ve santrifüje edildi. Oluşan yüzey maddesi (serum açıklık), kullanılıncaya kadar toplandı ve -20 ° C&#39;de muhafaza edildi. </td></tr></tbody></table> Tablo 4. In situ melezleştirme için spesifik reaktifler ve ekipman Tablo.

melezleme<em&gt; in situ</em&gt; bezler, yumurtalık ve vektör sivrisinek ve embriyoların

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Sivrisinekler Arbovirüsler, protozoon parazit ve nematod gibi patojenlerin çeşitli bir dizi için bir vektör. Üreme yer sivrisinek host ve patojen etkileşim ve organlarda sivrisinek yoluyla bulaşan hastalık bulaşmasını azaltmak ve yumurta gelişimini bozabilir stratejileri için büyük ilgi oldugu dokularda ifade edilir transkript ve gen düzenleyici Araştırılması. Araçların bir dizi gen ekspresyonu zamansal ve doku-spesifik düzenlemeler incelemek ve onaylamak için istihdam edilmiştir. Burada, belirli genlerin ifade ve ürünleri birikir nerede anlayışımızı geliştiren mekansal bilgi elde etmek için geliştirilen protokoller açıklanmaktadır. Açıklanan protokolü yeniden, hangi ifadeyi doğrulamak ve bu kadın tükürük bezlerinin yanı sıra yumurtalık ve embriyoların Subselüler bölmeleri gibi sivrisinek kaynaklı patojen iletimi ile ilgili dokularında transkript birikimi desenleri belirlemek için kullanılmıştırsivrisinek üreme ve gelişme için geç. Aşağıdaki işlemleri hedef spesifik hibridizasyon sinyalleri kaybı olmadan protokolü çeşitli adımlardan etkinliğini arttırır iyileştirilmiş bir yöntem temsil eder. Toplanması, tespiti, ön hibridizasyon ve sivrisinek embriyoların hibridizasyon için belirli adımlar Bölüm B. ayrıntılı iken RNA prob hazırlanması için rehber, yumuşak doku ve fiksasyon ve hibridizasyon için genel prosedürü diseksiyonu, Bölüm A anlatılan

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj hibridizasyon<em&gt; In situ</em&gt; Doku ve hücre içi bölmeler içinde transkriptlerin Lokalizasyon belirlemek açısından faydalıdır. Burada bir hibridizasyon ana hatlarıyla<em&gt; In situ</emSivrisinekler belirli hedef dokulara değişikliklerle&gt; protokolü.

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Sivrisinekler; arbovirüsler, protozoon parazitler ve nematodlar da dahil olmak üzere çok çeşitli patojenler için vektörlerdir. Transkriptlerin ve genlerin incelenmesi...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sivrisinek dokuları ve embriyoları içindeki spesifik transkriptlerin lokalizasyon ve akümülasyon modellerini belirlemek için in situ hibridizasyon gerçekleştirmektir. Bu işlem, önce doku ultrastürktürünün ve mRNA hedeflerinin korunarak antisense RNA problarıyla hibridizasyona uygun hale getirilmesi için sivrisinek dokularının veya embriyolarının fikse edilmesiyle sağlanır. Ardından, antisense RNA probları, fikse edilmiş dokular veya embriyolar içindeki hedef transkriptlerle hibridize edilir.Ardından, hedef mRNA lokalizasyonunu ve birikim modellerini tespit etmek amacıyla kolora metrik antikor boyama yöntemleri uygulanır. C iki ve kolorimetrik saptama yöntemlerindeki hibridizasyona dayalı olarak RNA birikiminin mekansal modellerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, gen ürünlerinin sivrisinek içerisinde ne zaman ve nerede biriktiği gibi fonksiyonel genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu prosedür, üreme gelişimi ve sivrisinek-patojen etkileşimleri gibi biyolojik süreçler için gen ekspresyonunun nasıl düzenlendiğini daha iyi anlamamızı sağlayacak uzamsal lokalizasyon bilgilerini elde etmemize de olanak tanır. Digoksigen işaretli RNA problarını sivrisinek dokularıyla hibridize etmeye hazırlanmak için, önce yumurtalıkları ve tükürük bezlerini diseke ederek başlayın. Ardından dokuyu sabitleyin ve gerekirse proteinaz K ile işlemden geçirin.Dokular post-fikse edildikten sonra, 30 dakika boyunca mutasyonla birlikte 1 mL oranında bire bir karışım halindeki PBT veya HIB PBT hibridizasyon çözeltisinde dengeleyin, dokunun çökmesini bekleyin ve ardından mümkün olduğunca fazla HI PBT'yi süzerek uzaklaştırın. Daha sonra her bir numune tüpüne 1 mL HIB ekleyin. Numune tüpünü baloncuklu naylon gibi sızdırmaz hava korumalı bir paketle sarın ve bir hibridizasyon şişesinin içine yerleştirin.Şişeyi bir hibridizasyon şişe kapağı ile kapatın ve 30 dakika boyunca rotasyonla 55 °C'de inkübe edin. Şişeyi inkübatörden çıkardıktan sonra dokunun çökelmesini bekleyin ve numune kaybını önlemek için tüpte 50 µL çözelti bırakacak şekilde pre-hibridizasyon tamponunu dikkatlice dökün. Ardından, aynı numuneye 50 µL ön ısıtılmış yüksek tampon ekleyin ve 55 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı bloğa yerleştirin; daha önce hazırlanmış RNA probunu 85 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin.Ardından, hemen beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Sonra, RNA probunu örnek tüpüne pipetleyin. RNA probu, HI solüsyonu üzerinde yüzeye çıkacaktır.Tüpe hafifçe vurarak karıştırın. Örnekleri, bir hibridizasyon fırını içinde, sabit bir mikro santrifüj rafında 55 °C'de 16 ila 24 saat boyunca nazikçe inkübe edin. Ardından, yazılı protokolde belirtildiği üzere RNA'lar, bir işlem ve antikor boyaması uygulayın.Doku örneklerini, önce 200 µL'lik bir pipet ucu kullanarak bir Pyrex spot plakanın ayrı yuvarlak tabanlı kuyucuklarına aktararak sabitleyin. PBT'nin mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın ve örneği suda %70 gliserol ile kaplayın. Gliserolün örneğe nüfuz etmesi için örnekleri dört °C'de gece boyunca bekletin.Mikroskop lamlarını hazırlamak için, öncelikle lam yüzeyini Kimwipe ile temizleyin. Ardından, bir resim fırçası kullanarak paralel iki adet şeffaf bant yapıştırın ve böylece dar bir kanal oluşturun. Örnekleri tek tek alın ve her bir örneği anterior, posterior ve dorsal ventral hizalamalarına göre aynı yönde olacak şekilde kanal boyunca yerleştirin.Her bir örnek yerleştirildikten sonra, dokuların etrafındaki fazla gliserol çözeltisini emmek için bir Kim wipe pamuklu çubuk kullanın. Fazla gliserolün uzaklaştırılması, monte edilen örnekler lam üzerine bir lamelya ile kapatılırken hava kabarcığı oluşumunu önlemek için önemlidir; hizalanmış örnekleri içeren kanalın üzerine dikkatlice bir lamelya yerleştirin. Şeffaf oje kullanarak, köşelere tampon uygulayıp lamelyayı lama yarı kalıcı olarak sabitleyin. 200 microliter pipet kullanarak, kanalı ve lamelya altındaki alanı kalıcı olarak doldurmak için %70 gliserolü kanalın bir ucundan yavaşça boşaltın.Kapak lamının dört kenarı boyunca oje sürerek monte edilmiş numuneleri mühürleyin. Numuneleri görüntülemeden önce ojenin yeterince kurumasını bekleyin. Çiftleşmiş 300 yetişkin dişi sivrisineğin bulunduğu bir kafesten embriyoları topladıktan ve istenen aşamalara gelene kadar gelişimlerine izin verdikten sonra, embriyoları toplama kabından seksen embriyo kapasiteli bir tylene ağ dekorasyon yakalama tüpüne aktarın.Yakalama tüpünü, hacminin yarısı dolacak kadar distile su ile doldurulmuş bir behere yerleştirin. Embriyoları tylene ağdan ayırmak ve suyla dolu yakalama tüpüne aktarmak için bir resim fırçası kullanın. Çok sayıda embriyo için tylene ağı toplama kabından ayırın ve ağı dikkatlice katlayarak bir huni oluşturun, huni şeklinde katlanmış ağı bir elinizle tutun.Embriyoları toplama tüpüne yıkamak için diğer elinizle huninin kenarları boyunca su püskürtün. Bu yöntem, yumurtaların uygun yüzeylere yapışmasını sağlayan yapışkan maddenin eksik olması nedeniyle anomali gösteren embriyolara uygulanabilir. 40 mililitre dekortikasyon solüsyonu hazırlayın ve solüsyonu 100 milimetrelik bir Petri kabına dökün.100 mililitrelik bir behere 50 mililitre distile su ekleyin ve kenara ayırın. Ardından embriyoları dekortikasyon çözeltisi içeren Petri kabına yerleştirin. Embriyoların dekortikasyon çözeltisi içinde batık ve hareketli kalması için toplama tüpünü döndürürken, embriyoları yıkamak için tek kullanımlık bir polietilen transfer pipeti kullanın.Dekorasyon, protokolün en hassas adımlarından biridir ve sodyum hipoklorit işleminin sekizli embriyolarda aşırı uygulanması, endokoriyonun düzgün oluşumunu engelleyecektir. Sekizli embriyolar için maksimum 35 saniye gerekirken, QX'teki anomalilerli embriyolar için 75 saniye yeterlidir. Dekorasyonu, düşük büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında doğrulayın. Sekizli embriyolarda ağ benzeri eksokoriyon bulunmayacak, anomalilerli embriyolarda ise yalnızca siyah endokoriyonun düz pürüzsüz yüzeyi mevcut olacaktır.Embriyolar kaplandıktan sonra ekzo koryon yüzen kısımları ve çıkıntı yapıları kaybolacaktır. Yazılı protokolde belirtilen prosedüre uygun olarak endo koryonun fikse edilmesi ve parçalanması işlemine geçiniz. Parçalanmış endo koryonu soyup almak için, geniş ağızlı 200 µL pipet ucu kullanarak üç santimetrelik bir Petri kabının merkezine bir parça çift taraflı peruk bandı yerleştiriniz.Embriyoları metanolden çift taraflı bandın üzerine aktarın. Embriyoların çökelmesi ve bant yüzeyine yapışması için bir ila iki dakika bekleyin, fazla metanolü süzün ve yüzeyin bir ila iki dakika boyunca hafifçe kurumasını sağlayın. Ardından, embriyoları bant üzerinde daha fazla sabitlemek için Petri kabına %95 etanol ekleyin; etanolün içine 600 µL distile su pipetleyin ve karıştırmak için çalkalayın.Ardından, bir mililitrelik şırınga gövdesine takılı 27.5 iğne kullanarak çatlamış endokoryonu soyun. İnce uçlu bir resim fırçasıyla beyaz embriyoyu siyah endokoryon kalıntılarından ayırdıktan sonra, embriyoları banttan hızlıca Petri kabındaki etanol rezervuarına aktarın. Daha sonra, üç milimetrelik bir pipet ucu kullanarak embriyoları, 500 µL %100 etanol içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın; son olarak embriyoları %100 etanol ile iki ila üç kez yıkayın ve embriyoları -20 °C'de saf etanol içerisinde saklayın.Bu şeklin C kısmında, female Aedes aegypti'nin tüm tutam tükürük bezlerinin amylase 1D seven S two ve D seven L two'yu hedefleyen mRNA probları ile iki hibridizasyonu, sırasıyla bu transkriptlerin proksimal lateral, distal lateral ve distal lateral medial loblarda biriktiğini göstermektedir. Bu deneyde, üç sivrisinek türünün tüm tutam kistleri, Oscar'ın ilgili otolog transkriptlerini spesifik olarak hedefleyen mRNA probları ile hibridize edilmiştir. Burada C kısmında, Anopheles gambiae, Aedes aegypti ve Culex quinquefasciatus'un tüm tutam embriyolarının, ilgili sivrisinek Oscar otolog transkriptlerini hedefleyen antisens RNA probları kullanılarak iki hibridizasyonu gerçekleştirilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, transkriptlerin belirli sivrisinek dokularındaki veya embriyolarındaki lokalizasyonunu ve birikimini belirlemek için bir C iki hibridizasyon deneyinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Alphavirus uyum sistemlerini kullanarak in vitro ve erişkin sivrisinek floresan gazetecilere ifade etmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu teknik, yerine ya da ek olarak bir muhabir ilgi herhangi bir protein ifade etmek için adapte olabilir.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu içeren bu metodoloji, midgut ve / veya tükürük bezi bariyerlerinin arbovirüs enfeksiyonu üzerindeki etkisini etkili bir şekilde değerlendirebilir.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Basit anatomileri göz önüne alındığında, Anofel testisleri spermatogenezi incelemek için iyi bir sitolojik model sunar. Bu protokol, bu biyolojik süreci araştırmak için kullanılan bir teknik olan tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun yanı sıra sperm üretiminde yer alan genlerde mutasyonları barındıran transgenik suşların fenotipini açıklar.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Makale, sivrisinek anteni ve maksiller palptaki kemosensoriyel reseptör genlerinin uzamsal ve hücresel çözünürlüğüne ilişkin içgörüleri ortaya çıkarmak için hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (HCR, RNA, WM-FISH) gerçekleştirmek için gerekli yöntemleri ve reaktifleri açıklamaktadır.

Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu,

Sivrisineklerdeki mikrobiyal topluluklar, vektör biyokontrol stratejileri için büyük umut vaat ediyor. Simbiyontların çoğu yetiştirilemez ve metagenomik analizler gerektirir. Dişi sivrisinekleri incelemek ve yumurtalıkları, orta bağırsakları ve tükürük bezlerini ayırmak, çapraz kontaminasyonu önlemek, organ düzeyinde mikrobiyom çalışmalarını kolaylaştırmak ve mikroorganizmaların sivrisinek biyolojisindeki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım,...

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Öğrenin sivrisinek dokularında ve embriyolarında gen ifadesi lokalizasyonunu belirlemek için hibridizasyon in situ protokolünü. Bu yöntem, fonksiyonel genomik araştırmalarında transkript birikim desenlerini görselleştirmeyi sağlar.

Melezleme

Daha fazla video keşfet