Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Bu prosedürün genel amacı, intrakraniyal ortamın bozulmasına yol açmadan tekrarlı görüntülemeye olanak tanımak için fare korteksi üzerinde stabil ve ince bir kafatası penceresi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle başın görüntüleme cihazı altında sabit tutulmasını sağlayacak bir baş sabitleyicinin takılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, beynin dorsal yüzeyi üzerindeki bir bölgede kafatası dikkatlice inceltilir ve yüzey ince kumlu zımpara ile parlatılır.

Ardından, pencereyi güçlendirmek için pencerenin üzerini küçük bir miktar siyanoakrilat yapıştırıcı ve bir lamel ile kapatın. Son adım, hayvanı iki foton mikroskobu altında görüntülemeye hazırlamaktır. Nihayetinde in vivo iki foton mikroskobu; arteriyoller, venler, kapillerler ve nöronal dendritler gibi, korteksin 250 mikrometre derinliğine kadar haftalarca görüntülenebilen ince yapıları göstermek için kullanılır.

Bu kranial pencere tekniğinin temel avantajı, korteksin üzerindeki kafatasının etkilenmemesidir. İlk olarak, optik netlik sağlamak için kafatasını inceltiyoruz ve ardından kafatasını siyanoakrilat yapıştırıcı ve lamel ile güçlendiriyoruz. Bu yöntem, anestezili veya OIC durumlarındaki çeşitli floresan transgenik fareleri incelemek için kullanışlı olacaktır.

Bu prosedüre başlamak için gerekli cerrahi aletleri otoklavlayın ve yaklaşık üç ila altı haftalık bir fareyi ekteki makalede belirtilen yöntemlere göre anesteziye alın. Fareyle cerrahi anestezi düzeyinde olduğundan emin olmak için ayak parmaklarını sıkarak refleksi kontrol edin. Ardından, fareyi bir stereotaksik çerçeveye sabitleyin.

Fare vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun. Bunun için geri beslemeli bir rektal prob ve ısıtıcı ped kullanın. Nemliliği korumak amacıyla gözlerine oftalmik pomad uygulayın.

Ardından, kafa derisini küçük elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin. Bundan sonra kafa derisini Betadine ile temizleyin ve ardından %70 izopropil alkol ile silin. Daha sonra, mikroskop altında steril yapay beyin omurilik sıvısının bir alikotunu 37 °C'ye ısıtın.

Tüm dorsal kafatası yüzeyi üzerindeki saçlı deriyi bir cerrahi makasla çıkarın. Deriyi, kafatasının her iki yanındaki temporal kasların kenarlarına kadar lateral olarak ve boyun kaslarının posterioruna kadar kırpın. Ardından, kafatası yüzeyindeki ince periostu temizlemek için bir bistüri bıçağı kullanın.

Ardından kafatasını kurutun ve temizleyin. Bundan sonra, kafatası yüzeyine ince bir tabaka siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin.

Diş simanının uygun şekilde yapışması için bu yapıştırıcı katman gereklidir. Sonraki adımlarda, uyanık görüntüleme hazırlığı için delikler açın ve karşıt kafatası yüzeyine iki adet 0 0 0 numara kendinden kılavuzlu vida yerleştirin.

Ardından, iki bağlantı noktası bulunan özel yapım sert bir konnektörü kafatasına sabitleyin. Bu işlem, serbestlik derecelerini büyük ölçüde azaltır ve boylamsal çalışmalarda aynı görüntüleme alanının yeniden konumlandırılmasını kolaylaştırır. Geniş bir çapraz bar ayrıca elektrot yerleşimi ve vibrasyon stimülasyonu için yeterli alan sağlar.

Ardından, pencerenin bulunduğu konum hariç tüm kafatası yüzeyini bir tabaka dental siman ile kaplayın ve cildin açıkta kalan tüm kenarlarının simanla kaplandığından emin olun. Kafatasını inceltmeden önce, matkap uçlarının keskin olduğundan emin olun ve bunları tekrar kullanmaktan kaçının. Somatosensör korteks üzerinde iki milimetreye iki milimetrelik bir bölgeyi inceltmek için düşük hızda bir dental matkap ve yarım milimetrelik bir uç kullanın.

Ardından, ısınmayı önlemek için kafatasını periyodik olarak CSF ile ıslatarak, kuru kafatası yüzeyini her seferinde sadece birkaç saniye boyunca inceltin. Daha sonra kemiği inceltin. Ardından matkabı daha düşük bir hıza getirin ve kafatası yüzeyini sadece hafif dokunuşlarla tıraşlayın.

Matkap, yüzeye dikeyden yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yaklaşmalıdır. Kemik inceltme işlemine vasküler tabakanın ötesinde, beynin yüzeyinin hemen üstündeki ikinci kemik tabakasına kadar devam edin.

Matkabı küçük ve kontrollü hareketlerle tutun ve kuvveti yalnızca lateral yönde uygulayın. Kemik yaklaşık 50 mikron kalınlığa ulaştığında, soyulma damarları ıslak kemik üzerinden net bir şekilde görülmelidir. Bu derinlikte, kemik içindeki küçük beyaz noktalar birkaç saniyeliğine görünür hale gelecektir.

Kuru kafatası yüzeyi nemlendirildikten hemen sonra, nihai kemik kalınlığı yaklaşık 10 ila 15 mikron olmalıdır. Kemik yeterince inceldiğinde, kuru kafatası yüzeyi nemlendirildiğinde kemikteki küçük beyaz noktalar artık görünmeyecektir. Şimdi pencereyi kalay oksit tozu ile parlatın.

Pencerenin boyutunun yaklaşık dörtte biri kadar küçük bir tutam toz kullanın, silikon kamçılı hazır bir matkap ucu ile CSF içinde bir toz süspansiyonu karıştırın. Yüzeyi 10 dakika boyunca parlatın, kalay oksit tozunu pencereden tamamen yıkayarak uzaklaştırın ve kemiği kurulayın. Bu işlem, inceltme prosedürü sırasında matkap ucunun bıraktığı pürüzlü kenarların azaltılmasına yardımcı olacaktır.

Ardından, pencere boyutundan biraz daha küçük, sıfır numara lamelden birkaç kare parça kesin. Lamel üzerindeki ayrılmış yatay ve dikey çizgileri hafifçe çizmek için bir kalem uçlu kazıyıcı kullanın. Camı kırmadan düz bir kenar yardımıyla kaydırın.

Ardından lamelini bir Petri kabına yerleştirin. Kabı bir masa kenarına vurarak cam parçalarını birbirinden ayırın. Sonrasında, kırılmış bir pamuklu aplikatörün ahşap ucuyla pencerenin üzerine küçük bir miktar Sano ACRL yapıştırıcısı sürün.

Önceden kesilmiş bir lamel parçasını hızla yapıştırıcının üzerine yerleştirin. Yapıştırıcının 15 dakika boyunca tamamen kurumasına izin verdikten sonra lamelin altında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Lamelin üst yüzeyindeki fazla siyanoakrilat yapıştırıcıyı bir neşter ucuyla temizleyin.

Pencerenin kenarlarını dental siman ile mühürleyin. Ardından, işlemin sonunda daldırma lensi için su tutacak hafifçe yükseltilmiş bir havuz oluşturun. Hayvanı, anesteziden tamamen çıkana kadar sıcak bir kafese yerleştirin.

Bu adımda, görüntüleme için hayvanı bir optik breadboard üzerinde sabitleyin ve çerçeveyi kafa desteği olarak kullanın. Ayrı plakamız, hayvanı ve tüm fizyolojik izleme cihazlarını tek bir ünite olarak birleştirilmiş halde cerrahi alan ile iki fotonlu görüntüleme alanı arasında taşıyabilir. Kan akış görüntülemesi isteniyorsa, kan serumunu etiketlemek için infraorbital ven yoluyla 0.05 milliliters %5 floresan dekstran boya enjekte edin.

Bu işlem genel anestezi altında yapılmalıdır ve boya genellikle birkaç saat boyunca dolaşımda kalır. Vücut sıvılarını ve enerji gereksinimlerini korumak için her iki saatte bir gram başına üç mikrolitre hacminde laktatlı ringer çözeltisini intraperitonal olarak enjekte edin. İzofluranı keserek fareyi uyandırın.

Uyandıktan bir saat sonra, fare görüntüleme için hazırdır. Işık kontaminasyonunu önlemek için kafesi mikroskobun üzerine kapatın. Gösterildi. Burada, intravenöz dekstran konjuge Texas red enjeksiyonu ile işaretlenmiş bir YFP faresinin uyluk kortikal vaskülatürüne bir örnek yer almaktadır; dural damarlar sıklıkla dura mater içinde kortikal yüzeyin hemen üzerinde görünür.

Büyük peel arterleri ve venleri kortikal yüzeyde yer alır. Penetran damarlar bu yüzey ağından dallanarak kortekse dalar ve burada kortikal dokuyu besleyen yoğun bir kapiller yatağa ayrılırlar. Bu video, uyanık bir farede peel yüzeyindeki vaskülarizasyonu göstermektedir.

Hayvan sakin bir dinlenme halindeyken arter çapında spontan osilasyonlar görülebilir. Bu yöntem, hem anestezi altındaki hem de uyanık durumdaki çok çeşitli floresan transonik hayvanların incelenmesinde yararlı olacaktır.