Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Bu prosedür, in vivo drosophila dokusundaki kromatin durumunu doğru bir şekilde yansıtmak amacıyla, diseke edilmiş sinek dokusundan kromatin immünopresipitasyon verileri üretir. Bu çalışmada, yüzlerce testis el ile diseksiyon yoluyla toplanır. Kromatin immünopresipitasyon analizleri, ilgilenilen proteine karşı bir antikor kullanılarak gerçekleştirilir.

Saflaştırılmış çiplerle elde edilen DNA'daki spesifik genomik bölgenin zenginleşmesi için takip quantitative R-T-P-C-R analiz deneyi uygulanır. Alternatif olarak, çip örneğinin yüksek verimli sekanslanması, genom genelinde bir profil oluşturur. Nihayetinde, diseke edilmiş dokunun çip analizi, hücrelerdeki kromatin durumunun fizyolojik koşullarındaki temsilini sağlar.

Bu protokol, doğrudan organizmadan izole edilen dokuların analizi için optimize edilmiştir. Gerçek fizyolojik koşullar altındaki kromatin durumlarını ve epigenetik bilgileri elde etmek amacıyla, kromatin durumunu incelemek için drosophila'da ChIP kullanımını göstereceğiz. Bu protokol fare veya zebra balığı gibi diğer organizmalara da uygulanabilir.

Çip kullanımı veya yüksek kapasiteli sekanslama için sekanslama kütüphanelerinin oluşturulması amacıyla yeterli kalitede ve miktarda DNA elde etmek için bu protokolün görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. İlk olarak, proteaz inhibitörü ve 100 µg/mL PMSF içeren soğuk PBS içerisinde, bu vaka için yaklaşık 200 çift drosophila testis dokusunu diseke edin. Dokuyu iki kez duruladıktan sonra, inhibitörler içeren aynı PBS çözeltisinin 200 µL'si ile yeniden süspanse edin.

Ardından örneği 5,5 µL ısıtılmış %37 formaldehit ile fikse edin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her beş dakikada bir vorteksleyerek dokunun buz üzerinde çökmesini sağlayın.

İnhibitör içeren 450 µL PBS ile iki kez yıkayın. Örnekleri -20 °C'de saklayın. 200 oph testes örneğini 1,75 mL'lik bir eppendorf tüpünde birleştirin.

Tampon çözeltiyi aspire edin ve örnekleri 200 µL lizis tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Mavi bir homojenizatör kullanarak, hiçbir agregat kalmadığından emin olacak şekilde dokuyu tamamen ayrıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Ardından örneği bir mikroçip sonikasyon cihazı ile fragmante edin ve 50 saniye boyunca buz üzerinde bekletin. Çip hedefi için optimum fragman boyutunu elde etmek amacıyla bu işlemi dört ila beş kez tekrarlayın. Daha sonra, kromatin ekstraktı stok çözeltisi hazırlamak için 1,8 milliliters ripper buffer ile seyreltin. Başarılı bir chip analizi için DNA fragmanlarının boyutunun ampirik olarak belirlenmesi kritik önem taşır.

Çip deneyine geçebilmek için jel elektroforezi gerçekleştirmemiz gerekiyor. Giriş kontrol örneğinden 50 µL alın. İki µL 5 M sodyum klorür ekleyin ve 65 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ters çapraz bağlamayı geri çevirmek için, antikoru Protein A boncuklarına konjuge etme işlemine geçin. 1.5 mililitrelik bir fendor tüpüne 40 mikrolitre protein A boncuğu ve 600 mikrolitre PBS ekleyip dört derece santigrat sıcaklıkta iki dakika boyunca sallayarak karıştırın.

Ardından boncukları mıknatısa uygulayın ve süpernatantı atın. Şimdi 100 µL PBS ve ilgili antikoru ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Boncuklar magnet yardımıyla toplandıktan sonra, bir mililitre doku kromatin ekstraktı ekleyin. Dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca döndürün. Ardından, çip örneğini bir magnete yerleştirin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Toplanan boncukları, her bir yıkama 10 dakika sürecek şekilde 4 °C'de bir mililitre ile yıkayın, ardından boncukları 100 µL TEA tamponunda yeniden süspande edin. Protein-DNA komplekslerinin çapraz bağlarını geri döndürmek için 3 µL %10 SDS ve 5 µL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin; 65 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Boncukları bir mıknatıs yardımıyla çöktürün. DNA içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Boncukları bir kez yıkayın ve DNA içeren süpernatantları birleştirin.

Ardından, DNA'yı fenol kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. DNA'yı 20 µg/mL lineer akrilamid veya glikojen, 20 µL 3 M sodyum asetat ve 500 µL %100 Ethanol ile çöktürün.

İyice karıştırın ve -80 °C'de 10 dakika inkübe edin. DNA'yı santrifüj ile çöktürün. Üst fazı uzaklaştırın ve hava ile kuruttuktan sonra peleti bir kez 300 µL %70 etanol ile yıkayın.

DNA peletlerini 50 µL TE tamponunda süspanse ederek yeniden çözün. Parçalanmış DNA örneklerini -20 °C'de saklayın. Standart eğrisi için genomik DNA'nın seri dilüsyonlarını hazırlayın.

Seyreltilmiş genomik DNA girdi kontrolü veya fragmanlanmış DNA şablonları kullanılarak 96 kuyucuklu bir plakada, her birini duble olacak şekilde 20 µL'lik qPCR kurulumu yapın; ardından 96 kuyucuklu plakayı mini plaka santrifüjünde döndürün. Verileri doğrulamak için örnek plakasını bir gerçek zamanlı PCR sisteminde çalıştırın. İlk olarak, termal dissosiyasyon grafiğinde PCR'dan kaynaklanan tek bir amplikonu işaret eden tek bir pik olduğunu doğrulayın.

Ardından, standart eğriyi çizin. Seyreltilmiş genomik DNA serisinden elde edilen verileri kullanarak, DNA miktarını döngü eşiğine (Ct) göre belirleyen formülü hesaplayın. Ayrıca, her primer seti için PCR'ın eksponansiyel amplifikasyonunun lineer fazını belirleyin.

Çip DNA'sı ve girdi kontrol örneklerinin CT değerleri, CT değerinin lineer aralığı içindeyse, girdi dikkate alınarak çip DNA'sının zenginleşmesini hesaplayın. Seyreltme faktörü; T4 DNA polimeraz ve T4 polinükleotid kinaz içeren 50 µL'lik reaksiyonlarda 0,1 ila 5 µg çiplenmiş DNA'nın uç onarımını gerçekleştirir. Üretici talimatlarına uygun olarak oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Ardından, DNA'yı bir MinLu reaksiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın. DNA polimeraz I, büyük bir CLA NOW fragmanı ve DATP kullanarak üç prim uçlarına çıkıntılar eklemeye devam edin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. DNA'yı saflaştırmak ve konsantre etmek için reaksiyonu tekrar bir spin kolondan geçirin.

Adaptör oligo ile ligasyona geçin. Illumina'dan temin edilen T four DNA Ligase ile karıştırıp oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından örneği MinLu reaksiyon temizleme kitinden geçirin.

DNA 20 µL içerisinde elüe edilir. Ardından, DNA örneği egel aparatı kullanılarak elektroforez ile ayrıştırılır. Jel üzerindeki 200 ila 400 baz çifti aralığındaki bant izole edilir ve KYOGEN jel ekstraksiyon kiti kullanılarak saflaştırılır.

Şimdi, Illumina'nın fusion HF ve pH enzimlerini ve paired end primerlerini kullanarak 20 PCR döngüsü ile bir kütüphane amplifiye edin. Ardından, standart bir %2AOSE jel üzerinde, Ellen'ın yazılımında yüksek verimli dizileme (high throughput sequencing) yapmak için 200 ila 400 baz çiftlik DNA fragmanlarını izole edin. Tüm okumaları, referans diziyle en fazla iki uyumsuzluğa izin vererek drosophila genomuna hizalayın.

Birden fazla özdeş okumanın bulunduğu durumlarda, sonraki analizler için benzersiz şekilde eşleşmiş okumaları saklayın. PCR amplifikasyonundan kaynaklanabilecek yanlılık olasılığını azaltmak için en fazla üç kopya saklayın. Ardından, GA hattının çıktısını tarayıcı tarafından genişletilebilir veri dosyalarına dönüştürmek için bir Python betiği kullanın.

Dört baz çiftlik bir pencere boyutu ve 160 baz çiftlik bir DNA fragman boyutu belirleyin. Drosophila genlerini RPKM değerine göre sessiz ve eksprese olan genler olarak sınıflandırın. Dijital sayı olarak, RPKM değeri sıfıra eşit olan genleri tanımlayın.

Sessiz bir grup olarak, RPKM değeri birden büyük olan genleri; düşük, orta ve yüksek ekspresyon seviyelerinden oluşan üç alt gruba sahip bir eksprese grup olarak sınıflandırın. Sonra, basal 2007'de daha önce tanımlanan "bag of marbles" Python betiğini kullanarak histon modifikasyonu ve gen ekspresyon seviyelerini karşılaştırın. Mutant testislerde, proliferatif spermatogonyumların farklılaşan spermatositlere geçişinde başarısızlık görülür.

Bu chip QPCR deneyi, sperm diferansiyasyonu için gerekli temel genlerin kromatin durumunu, histon modifikasyonu zenginleşmesini (histon üç lizini 27 trimetil veya histon üç lizini 4 trimetil) sorgulamak amacıyla diferansiye olmamış germ hücreleri kaynağı olarak BAM testislerini kullanır. Diferansiyasyon genlerinin seviyesi, konstitütif olarak eksprese edilen bir cycling geni ile normalizasyon yapılarak belirlenir. BAM testislerinde eksprese edilmeyen diferansiyasyon genleri male specific transcription factor 87 Don Juan ve fuzzy onion, baskılayıcı histon üç lizini 27 trimetil histon modifikasyonu açısından oldukça zengindir.

Ayrıca, aktif histon modifikasyonundan yoksundurlar. Üç, lizin dört metil üç histon modifikasyonu. Her iki histon üç lizin dört metil üç ve histon üç modifikasyonunun bulunduğu valensle karşılaştırıldığında, monovalan olarak adlandırdığımız bir kromatin imzasıdır.

Embriyonik kök hücrelerdeki farklılaşma genlerinde Lizin 27 metil üç zenginleşmiştir. Aynı antikor seti kullanılarak elde edilen Chip sekans verileri. Şekil bir A'da gösterilen chip QPCR sonucunu doğrulayın; test edilen her üç terminal farklılaşma geninin genomik bölgeleri, histon üç lizin dört metil üç ile değil, ancak üç lizin 27 metil üç ile yüksek düzeyde zenginleşmiştir.

Buna karşılık, konstitütif olarak eksprese edilen cyclin aging, transkripsiyon başlangıç bölgesinin yakınında yüksek histone three lysine, four methyl three ancak düşük histone three lysine 27 methyl three düzeylerine sahiptir. Bu şekil, farklı şekilde eksprese edilen dört gen sınıfının transkripsiyon başlangıç bölgeleri yakınındaki iki histon modifikasyonuna ait ChIP-seq verilerini göstermektedir. Histone three, lysine 27 methyl three, transkripsiyon başlangıç bölgelerinin aşağısında zenginleşmiştir ve bu durum gen ekspresyon düzeyi ile ters korelasyon göstermektedir.

Sessiz genler en yüksek histon 3 lizin 27 trimetil seviyesini sergilerken, yüksek düzeyde ifade edilen genler, histon 3 lizin 27 trimetilin gen ifadesi üzerindeki baskılayıcı rolüyle uyumlu olarak hiçbir histon 3 lizin 27 trimetil bağlanması göstermez. Aksine, transkripsiyon başlangıç bölgeleri çevresindeki histon 3 lizin 4 trimetil modifikasyonunun zenginleşmesi, histon 3 lizin 4 trimetilin gen ifadesi üzerindeki aktif rolüyle uyumlu olarak gen ifadesi düzeyi ile ters yönlü bir korelasyon göstermiştir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, iki ila üç gün içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Fenol, kloroform ve formaldehit kullanırken güvenlik önlemlerini almayı unutmayın. Bu protokolün, in vivo dokulardaki kromatin yapısını incelemek için kromatin immünopresipitasyon kullanımına dair size yeterli anlayışı kazandırdığını umuyoruz.