Name: Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Öğrenin, Drosophila dokusunda kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yöntemiyle gen düzenlemesini in vivo koşullarda nasıl analiz edebilirsiniz. Bu teknik, kromatin durumunu doğru şekilde yansıtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar sıralama sonuçları sağlayarak yardım ettikleri için Dr Keji Zhao&#39;nun laboratuarı (NIH / NHLBI) teşekkür etmek istiyorum. Biz de eşlenen sıralama okur görselleştirmek için Genom Tarayıcı kullanımı için UCSC genom projesi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma start-up XC fon NICHD Lucile Parkard Vakfı ve Johns Hopkins Üniversitesi&#39;nden Bağımsızlık Ödülü ve R01HD065816 için R00HD055052 NIH Pathway tarafından desteklenmektedir

(Tüm ChIP prosedürü yaklaşık iki gün sürer. Yüksek verimlilik sıralaması için ChIP kütüphaneler hazırlanması 2-3 gün sürer.) 1. Inceleyin ve ChIP Experiment (~ 1 milyon hücre) için doku hazırlanması <ol><li> Soğuk PBS + 1x proteaz inhibitörleri (7x stok solüsyonu elde etmek için 1.5 ml 1x PBS içinde proteaz inhibitörü kokteyl 1 pelet erimesi) de (Drosophila testislerin örneğin 200 çift) ilgi doku teşrih + PMSF (son konsantrasyonu 100 mikrogram / ​​ml). Iki doku durulama ve inhibitörleri ile aynı PBS çözeltisinden 200 uL doku içinde yeniden süspanse. </li><li> Örnek düzeltmek için, 5.5 uL% 37 formaldehit (37 kullanmadan önce 1 dakika ° C su banyosunda sıcak formaldehit) ekleyin. 15 dakika, vorteks arasındaki her 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 2 dakika yerleşmek için doku için buz üzerinde örnek yerleştirin. 450 uL PBS (proteaz inhibitörleri ve PMSF ile) 2x durulayın. Örnek şimdi deposu olabilir-20 ° C&#39;de d ChIP için yeterli malzeme elde etmek diseksiyon birkaç kez tekrarlayın. </li></ol> 2. ChIP Assay için protein-DNA Konjugasyon ile Süpernatant hazırlayın <ol><li> Bir 1.75 ml Eppendorf tüp adım 1.3 yeterince örnek birleştirin. </li><li> Doku örneği PBS çıkarın. 200 lizis tamponu uL (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM CaCl2,% 0.2 Triton X-100 veya NP-40, 5 mM butirat, ve 1x proteinaz inhibitörü kokteyl). Ekleme Lizis tamponu (0.5 mM PMSF final konsantrasyon) taze PMSF stok çözeltisi ekleyin. Dokular 10 dakika RT (Oda sıcaklığı) &#39;de inkübe herhangi bir toplama olmadan, tamamen ayırmak kadar mavi homojenizör (Fisher Kedi # 749521-1590) ile homojenize edilir. </li><li> Sonikasyon: güç 20 kullanım mikrotip sonikatör (Misonix HS-XL200). 50 sn için buz üzerinde 10 sn ve dinlenme sonikasyon. (Uzun sonication küçük parçalara verecektir optimal sonication zaman, ampirik olarak belirlenmelidir. Histon karşı antikorlar kullanılarak ChIP için 4-5 kez tekrarlayınE değişiklikler, normalde yaklaşık 200-300 bp kromatin ses dalgalarına maruz; transkripsiyon faktörü veya kromatin regülatörü (örneğin Polycomb proteinler) için, biz normalde 200-1000 bp kromatin ses dalgalarına maruz. Bununla birlikte, uygun parçası boyutu ampirik olarak test edilmelidir. Not: HER ZAMAN DAHA YUKARI ISITMA DAN ÖRNEK ÖNLEMEK İÇİN SONICATING SIRASINDA BUZ ÜZERİNDE TÜP TUTUN! </li><li> 1,8 mL RIPA tamponu (ekleyerek Örnek 10 seyreltilir tarif edildiği gibi mM Tris-HCl, pH 7,6, aynı konsantrasyonda proteaz inhibitörleri ve PMSF ile 1 mM EDTA,% 0.1 SDS,% 0.1 Na-deoksikolat,% 1 Triton X-100, Daha önce). 65 2 uL 5M NaCl ve inkübe ekleyerek giriş kontrol olarak 40 uL kaydet ° C kroslink tersine çevirmek için (O / N) gece. </li><li> Boncuk antikor eşlenik için, 1.5 ml Eppendorf tüpüne 40 uL Protein A boncuk ekleyin, daha sonra, 2 dakika süreyle 4 ° C&#39;de 600 uL PBS ve kaya eklemek mıknatıs boncuk uygulamak ve supernatant çıkarın. 100 PBS uL ve ilgi antikoru ekleme (antikor miktarını empir tespit edilmelidirically). 4 saat için 1 saat ya da 4 ° C için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Mıknatıs tarafından boncuklar süpernatantı ve adım 2.4 boncuk 1mL kromatin ekstresi ekleyin. 4 at ° çevirin CO / N </li><li> Mıknatısa ChIP örnek uygulayın ve supernatant çıkarın. 10 dakika her biri için şu da 4 ° C tampon ile yıkanır boncuklar: RIPA tamponu 1 mL 2x [1,89 mL &#39;RIPA tamponu&#39; + ​​315 uL 7x proteaz inhibitörleri + 20 uL PMSF]; RIPA tamponu 1 mL 2x + 0.3 M NaCl [1,89 mL RIPA tamponu + 220 uL 3 M NaCl]; LiCI tamponu 1 mL (0.25 M LiCI,% 0.5 NP40,% 0.5 NaDOC) ile 2x; 1x 1x TE 1 mL +% 0.2 Triton X-100; 1x TE 1 mL ile 1x. </li><li> Çapraz bağ tersine çevirmek, 100 uL TE tampon içinde yeniden süspanse boncuklar + 3 uL% 10 SDS + proteinaz K (20 mg / mL) içindeki 5 ul. 65 inkübe ° CO / N </li><li> Mıknatıs boncuk uygulayın ve yeni bir tüpe süpernatant aktarın. Süpernatant SİZİN DNA ÖRNEĞİ CONTAINS. 100 uL TE + 0.5 M ile boncuk yıkayınNaCl ve iki süpernatan birleştirmektedir. </li><li> Fenol-kloroform DNA örneği ayıklayın. Kloroform: 200 ul Fenol ekle IAA (25:24:1) karışımı ve girdap. RT 5 dakika 14k döndürme. Alternatif olarak, DNA Qiagen PCR saflaştırma kiti kullanılarak elde edilebilir. </li><li> Yeni bir tüp içine süpernatan / sulu katman transferi ve 20 ug / mL (Alternatif olarak 20 mg / süpernatan her 1 mL için mL &#39;de glikojen 1 ul&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek lineer akrilamid eklemek de kullanılabilir. Glikojen için kullanılır Doğrusal akrilamid deneyleri sekanslama için kullanılır ise sonraki qPCR veya PCR analizi.) 3M NaOAc 20 uL ve 500 uL% 100 EtOH ekleyin. İyice karıştırın ve 80 inkübe ° C&#39;de 10 dakika. 4 azından 20 dakika için maksimum hızda dönerler ° C. </li><li> Süpernatantı ve 300 uL% 70 EtOH ile yıkayın. 50 uL TE tamponunda hava kuru ve Pastör pipetiyle örnek. Örnek şimdi -20 ° C&#39;de saklanabilir Örnek kantitatif PCR (qPCR) testi (Şekil 1) için kullanılabilir. </li></ol> 3a. QPCR kullanarak ChIP-ed DNA analiz <ol><li> Seyreltilmemiş, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000: Bir standart eğri yapmak için aşağıdaki konsantrasyonda genomik DNA sulandırınız. </li><li> Her primer çifti için, adım 3a.1, giriş kontrol ve ChIP-ed DNA genomik DNA ile 96-plaka olarak iki nüsha halinde qPCR kurmak: 10 uL 2x SYBR PCR karışımı (Fermentas, K0222); 1 ileri uL 10 uM astar; 1 uL 10 uM ters astar; x uL ChIP-ed DNA (giriş kontrolü, ya da genomik DNA); y uL nükleaz içermeyen H 2 O 20 uL için tepki seviyesini ayarlamak için. </li><li> Mini plaka spinner (Labnet) ile 96-plaka aşağı Spin. </li><li> Aşağıdaki koşul kullanarak ABI 7300 gerçek zamanlı PCR sistemi (veya diğer gerçek zamanlı PCR sistemi) ile qPCR gerçekleştirin: Aşama 1: 50 ° 2 dakika, 1 döngüsü için C; Aşama 2: 95 10 dakika, 1 döngüsü için ° C; Aşama 3: 95 ° 15 s, 60 ° C&#39;de 1 dakika süreyle C, 40 ° Cycles; 4. Aşama (ayrılma aşaması): 95 ° 15 s, 60 C ° 1 dakika, 95 C ° 15 s C. </li><li> Disosiasyon eğrisi kontrol edin: termal ayrışma arsa az bir tepe PCR reaksiyonu tek bir amplikon göstermektedir. Birden fazla pik primer çifti ile spesifik olmayan ürün gösterir, qPCR veri kullanılmamalıdır. </li><li> 3a seyreltilmiş genomik DNA dizisi kullanılarak standart eğri dayanmaktadır Ct (döngüsü eşik) değerine göre DNA miktarı gideren bir formül hesaplanarak, her bir primer seti için PCR reaksiyon üstel amplifikasyon doğrusal faz belirler. 1. </li><li> ChIP-ed DNA ve giriş kontrol Ct değeri Ct değeri lineer aralığında ise, ChIP-ed DNA ve 2.4 giriş kontrol sulandırma faktörüne göre, ChIP-ed DNA karşı giriş zenginleştirme hesaplayabilirsiniz. </li></ol> 3b. Yüksek verimlilik sıralaması için ChIP-ed DNA&#39;yı çoğaltmak. <ol><li> ChIP-ed DNA karışımı sonu-onarım (kullanınBuz üzerinde kurmak Epicentre DNA SON tamir kiti): Adım 2.12 (0,1-5 ug) 1-34 ul genomik DNA 5 ul 10x Sona onarım tampon 5 ul 2.5 mM dNTP karışımı 5 ul 10 mM ATP x ul H 2 O 49 ul için tepki seviyesini ayarlamak için 1 ul End-Onarım enzim karışımı (T4 DNA Polimeraz + T4 Polinükleotid Kinaz) Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Qiagen MinElute Reaksiyon kullanarak reaksiyon arındırın Temizleme kiti. 30 ul Elüsyon Buffer (EB) in Zehir. </li><li> 3 &#39;ucuna A-çıkıntılar ekleme: Adım 3b.1 gelen Elüsyonlanan DNA ürün 30 ul 5 ul 10x NEB Tampon # 2 10 ul 1 mM dATP 2 ul dH 2 O 3 ul 5 U / ml Klenow Fragment (3 &#39;→ 5&#39; exo-) 37 de 30 dakika inkübe ° C. MinElute ReactionCleanup kiti kullanılarak reaksiyon arındırın. 10 ul EB Zehir. </li><li> Solexa bağlayıcı ligasyonu: Adım 3b.2 gelen Elüsyonlanan DNA 10 ul 10 ul GKD 2 O 2.5 &amp;mu; l 10x T4 DNA ligaz tamponu Illumina 1 ul Adaptör oligo karışımı (stoktan 1/10-diluted) 2,5 ul T4 DNA ligaz (400 ünite / ul) RT az 1 saat inkübe edin. MinElute ReactionCleanup kiti kullanılarak reaksiyon arındırın. 20 ul EB Zehir. Örnek şimdi -20 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> E-jel aparat kullanarak adım 3b.3 gelen Yıkanan DNA örneği çalıştırın. Jel 300-500 bp bant yalıtmak ve Qiagen Jel Ekstraksiyon kiti (bu adım adaptörü oligo ligasyonu ile ~ 125 bp kendine bağlanan linkerler ortadan kaldırır) kullanarak arındırmak. 12 ul EB Zehir. </li><li> Illumina kütüphane eşleştirilmiş uç kullanarak (PE) primerleri Amplify: Adım 3b.4 gelen Elüsyonlanan DNA 10.5 ul Master miks 12.5 ul (2X Phusion HF, Finnzymes) PE1 PCR primer 1 ile 1 ul PE2 PCR primer 2 arasında 1 ul PCR koşulları: 98 ° C&#39;de 30 sn (98 ° C&#39;de 10 saniye, 65 ° C&#39;de 30 saniye, 72 ° C&#39;de 30 sn), tekrar 20 döngü 5 dakika süreyle 72 ° C. </li><li> Adım 3b.5 Örnekler 2 standardı% agaroz jel kullanılarak uygun büyüklükte DNA (300-500 bp) seçildikten sonra ChIP-SEQ için de kullanılabilir. Örnek şimdi -20 ° C&#39;de saklanabilir Bu kirliliği önlemek için tek bir jel her ChIP örnek izole etmek en iyisidir. Örnekler yüksek verimlilik sıralaması için sunulabilir. </li></ol> 3c. Solexa boru hattı analizi <ol><li> 25-bp sıralama okur Illumina Genome Analyzer (GA) boru hattından elde edilmiştir. </li><li> Tüm okuma referans dizi ile iki uyumsuzlukları kadar izin Eland (Nükleotid veri Verimli Yerel Hizalama) yazılımını kullanarak Drosophila genomu (dm3) hizalanmış edildi. </li><li> Eşsiz eşlenen okuma aşağı analiz için muhafaza edildi. Birden fazla özdeş okuma için, üç adede kadar kopya PCR gelen önyargıları olasılığını azaltmak için muhafaza edildi. </li><li> GA Boru Hattı&#39;nın çıkış tarayıcı genişletilebilir veri (BED) dosyalarını dönüştürüldü. </li><li> Üretmek içingörüntülenmesi için UCSC tarayıcısına yüklemek için wig dosyaları, bu pencere boyutu olarak 4 bp ve DNA fragmanı boyut olarak 160 bp&#39;lik bir önceki yayın 3 tarif edilmiştir python kese kullanılır. </li><li> Sessiz ve dile getirdikleri genlerine Drosophila genlerin sınıflandırmak için, RPKM adında bir dijital sayı (kilobaz başına / exonic bölge birleşti / milyonda eşlenmiş okur okur) kullanılır. RPKM = 0 ile Genler RPKM ≥ 1, düşük orta ve yüksek düzeyleri ile genler olmak üzere üç gruba ayrılabilir ifade gruplar ayrıldı ile sessiz grubu ve genler olarak sınıflandırılmış ve her bir grup yaklaşık aynı sayıda edildi genler. </li><li> Histon modifikasyonu düzeyi ve gen ekspresyonu karşılaştırmak için, bir önceki yayının 3 tarif edilmiş bir python komut dosyası kullanılır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Bam kullanarak ChIP-qPCR sonuçları örnekleri (mermer torba) mutant<html> Şekil 4 testisler 1 &#39;de gösterilmiştir. Bam testislerde proliferatif spermatogonia gelen spermatositler 5, 6 ayırt geçişte bir başarısızlık var. Bu doku tipi bakımından zengindir ve indiferansiye germ hücreleri için bir kaynak olarak bam testisler kullanın. Böyle erkek özgü transkripsiyon faktörü 87 (mst87F), don juan (dj), ve bulanık soğan (FZO) sperm farklılaşması için gerekli Farklılaştırma genler, bam testis ifade değildir. Bu genler çok baskıcı H3K27me3 histon modifikasyonu 7 (Şekil 1A) ile zenginleştirilmiş, ancak aktif H3K4me3 histon modifikasyonu 8 (Şekil 1B), biz &#39;monovalan&#39; 7 adlı bir kromatin imza yoksun edilir. H3K27me3 ya da H3K4me3 zenginleştirilmesi, bir yapısal olarak ifade siklin A (CycA) gen 4 ila normalizasyon tarafından belirlenir. bam mutant testisler (Şekil 2) Şekil 1&#39;de gösterildiği qPCR sonuçlar doğrulanmıştır. üç test terminal farklılaşma genler için mst87F, dj ve FZO ile antikor aynı set (yani baskıcı H3K27me3 ve aktif H3K4me3) kullanarak içerik &quot;&gt; ChIP-seq analizi , bunların genomik bölgeleri yüksek H3K27me3 ancak H3K4me3 (Şekil 2A-2C) zenginleştirilmiş. Bunun aksine, yapısal olarak ifade CycA geni önemli H3K4me3 ancak transkripsiyon başlama sitesi (TAD) (Şekil 2B) yakınında az H3K27me3 bağlayıcı sahiptir. Ayrıca, gen hariç dört sınıfın trafik ayırım şeritleri yakın H3K27me3 ve H3K4me3 ve ChIP profilleri, her histon modifikasyonu işlevi ile uyumludur. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, trafik ayırım şeritleri arasında H3K27me3 mansap zenginleşmesi ile ters gen ifadesi seviyesi ile ilişkilidir. Sessiz genler ise en yüksek H3K27me3 varyüksek genlerin hiçbir H3K27me3 bağlayıcı var. Bu veriler, gen ekspresyonu H3K27me3 baskıcı rolü ile tutarlıdır. Bunun aksine, trafik ayırım şeritleri etrafında H3K4me3 zenginleştirilmesi gen ifadesi üzerindeki H3K4me3 aktif rolü ile tutarlıdır gen ifadesi seviyesi (Şekil 3B) ile ters korelasyon gösterdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> Ya da baskıcı H3K27me3 histon modifikasyon (A) veya (B) bam hücre-zenginleştirilmiş andiferansiye mutant testisler aktif H3K4me3 histon modifikasyonu karşı antikor kullanılarak ChIP-ed DNA Şekil 1. QPCR analizi. (A) bam ise testisler, farklılaşma genler (Mst87F, dj, FZO) H3K27me3 baskıcı histon modifikasyonu ile zenginleştirilmiştir. (B) Farklılaştırma genler H3K4me3 aktif işareti ile tükenmiş. Hedef gen (Mst87F, dj ya FZO) at ChIP DNA düzeyi (ChIP DNA / girdi) ilk lev normalize edildi<html> Kontrol CycA geninde ChIP DNA el. Hata çubukları üç bağımsız biyolojik, standart sapma çoğaltır göstermektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> Şekil 2. UCSC genom tarayıcı H3K27me3 anlık ve (A) Mst87F (B) DJ ve (C) FZO, (D) CycA genler. (D) &#39;in H3K27me3 zenginleştirilmiş bölgenin bütün çember genomik bölgeler arasında H3K4me3 zenginleşme kromatin durumunu gösterir bam da asılıyor ifade edilir örtüşen bir gen CG7264, testis (RPKM = 1) ama son derece vahşi tip testis ifade (RPKM = 130) 8 (7 ChIP-seq veri). Şekil 1&#39;de ChIP sonuç kantitatif PCR analizinde kullanılan sondalar her bir parsel altında etiketlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. ChIP-seq profilleri testislerde 7 bam yılında H3K27me3 ve H3K4me3 kullanarak. Dört gen grupları (7,509 genler) RNA-seq sonuçları 8 dayanarak gen ekspresyon düzeylerine göre sınıflandırıldı. Genlerin temsilcisi sınıflar transkripsiyon başlangıç ​​siteleri (trafik ayırım şeritleri) ile 3kb memba için 3kb aşağı gelen dizileri kullanarak, belirli bir histon modifikasyonu zenginleştirilmesi için çizilmiştir. Bu (A) H3K27me3 (K27) ve her bir grupta (B) H3K4me3 (K4) ChIP-seq analizleri. Zenginleştirilmesi bir profil üreten <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakamı görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
<li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles%3A+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li>
<li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li>
<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol tartışılan ChIP analizlerin çok yönlülüğü, biyolojik ilgili sistemde kromatin devletin bir çalışma olanağı sağlar, farklı dokular üzerindeki kullanılabilir. Kültüre sistemlerinden hücreleri kullanılarak ChIP deneyler hücrelerinin büyük miktarda kolayca elde edilebilir çünkü gerçekleştirmek için uygundur. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücrelerde mutlaka bir çoklu-hücresel ortamda hücreleri göstermemektedir. Canlı hayvan disseke doku kullanarak bu tekniği geliştirerek, pek çok soru hitap edebilecek kültür hüc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Komple Mini proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehit (% 37) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pelet havaneli </td><td> Fischer Bilimsel </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR izolasyon kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Doğrusal poliakrilamid </td><td> Sigma </td><td> 56.575-1mL </td><td></td></tr><tr><td> Glikojen </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR yeşil / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini plaka spinner </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real Time PCR sistemi </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Küçük Hacim Ultrasonik İşlemci </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Model kesildi </td></tr><tr><td> Dynabeads, Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Mıknatıs Dynamag </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Fenol: kloroform: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA SON Tamir Takımı </td><td> Epicentre Biyoteknoloji </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Temizleme Kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow parçacığı (3 &#39;→ 5&#39; ekso-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA ligaz </td><td> Promega Şirketi </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adaptör oligonükleotidler </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Eşleştirilmiş-End Primer 1.0 ve 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Jel Electorphoresis sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

kullanarak kromatin immünopresipitasyon (chip) drosophila doku

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetik hızla gelişen bir alan kalır kromatin devletin farklı gelişim aşamalarında farklı hücre tiplerinde farklı gen ifadesini nasıl katkıda çalışmaları. Epigenetik düzenleme yetişkinlikte embriyonik gelişimi ve homeostazı sırasında hücresel farklılaşma da dahil olmak üzere biyolojik süreçleri, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. Epigenetik çalışmalar eleştirel bir strateji çeşitli histon modifikasyonları ve kromatin faktörleri gen ifadesinin düzenlenmesine nasıl incelemektir. Bu adres için, Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) ilgi hücrelerde DNA ile belirli faktörlerin dernek bir enstantane elde etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. ChIP tekniği yaygın olarak tekrarlanabilir verileri oluşturmak için bolluk ve homojenlik elde edilebilir malzeme, başlangıç ​​olarak kültür hücreleri kullanır. Bununla birlikte, birçok uyarılar vardır: İlk olarak, Petri tabağına hücrelerinin büyümesini ortamı, böylece, in vivo olarak farklı olan olabiliryaşayan bir organizma hücrelerin endojen kromatin devlet yansıtmamaktadır. İkinci olarak, hücreler değil, her türlü kültürü ex vivo olabilir. Insan ChIP tayini için yeterince malzeme edinebilecekleri hücre dizileri sadece sınırlı sayıda vardır. Burada Drosophila dokuları kullanarak ChIP deney yapmak için bir yöntem tarif. Başlangıç ​​malzemesi böylece doğru endojen kromatin devlet yansıtabilir, yaşayan bir hayvan dokusu diseke edilir. Dokusu çok farklı tipleri ile bu yöntemin uyum araştırmacılar biyolojik olarak daha bir çok in vivo 1, 2, epigenetik düzenleme konusunda ilgili soruları sağlayacaktır. Yüksek verimlilik sıralama (ChIP-seq) ile bu yöntemi birleştirerek daha araştırmacı bir epigenomic manzara elde sağlayacaktır.

Son zamanlarda yüksek verimlilik sıralama teknolojisi büyük ölçüde Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deney duyarlılığı artmış ve saflaştırılmış hücreleri veya disseke doku kullanarak uygulama açtı. İşte biz ChIP tekniği kullanılacak bir yöntem tasvir<em&gt; Drosophila</emIyi karakterize biyolojik sisteminde endojen kromatin devleti ele alabilir&gt; doku.

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetik, farklı hücre tiplerinde kromatin durumunun farklılaşmış gen ekspresyonuna nasıl katkıda bulunduğunu inceleyen ve hızla gelişmeye devam eden bir alandır...

Bu prosedür, in vivo drosophila dokusundaki kromatin durumunu doğru bir şekilde yansıtmak amacıyla, diseke edilmiş sinek dokusundan kromatin immünopresipitasyon verileri üretir. Bu çalışmada, yüzlerce testis el ile diseksiyon yoluyla toplanır. Kromatin immünopresipitasyon analizleri, ilgilenilen proteine karşı bir antikor kullanılarak gerçekleştirilir.Saflaştırılmış çiplerle elde edilen DNA'daki spesifik genomik bölgenin zenginleşmesi için takip quantitative R-T-P-C-R analiz deneyi uygulanır. Alternatif olarak, çip örneğinin yüksek verimli sekanslanması, genom genelinde bir profil oluşturur. Nihayetinde, diseke edilmiş dokunun çip analizi, hücrelerdeki kromatin durumunun fizyolojik koşullarındaki temsilini sağlar.Bu protokol, doğrudan organizmadan izole edilen dokuların analizi için optimize edilmiştir. Gerçek fizyolojik koşullar altındaki kromatin durumlarını ve epigenetik bilgileri elde etmek amacıyla, kromatin durumunu incelemek için drosophila'da ChIP kullanımını göstereceğiz. Bu protokol fare veya zebra balığı gibi diğer organizmalara da uygulanabilir.Çip kullanımı veya yüksek kapasiteli sekanslama için sekanslama kütüphanelerinin oluşturulması amacıyla yeterli kalitede ve mik

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Bu video protokol hazırlamak için Johansen laboratuvarında kullanılan kabak tekniği göstermektedir.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Cıvıldamak uzun kodsuz RNA'lar genomik bağlanma yerleri (lncRNAs) eşleştirmek için yeni ve hızlı bir tekniktir. Yöntemi lncRNA bağlı genomik sitelerin numaralandırılmasına izin anti-sense fayans oligonükleotidden özgüllük yararlanır.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.

Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Öğrenin, Drosophila dokusunda kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yöntemiyle gen düzenlemesini in vivo koşullarda nasıl analiz edebilirsiniz. Bu teknik, kromatin durumunu doğru şekilde yansıtır.

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Daha fazla video keşfet