Name: Radyoaktif In situ Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: Öğrenin, radyoaktif in situ hibridizasyon yöntemiyle omurgalı dokularda mRNA ekspresyon desenlerini ve düşük yoğunluklu transkriptleri nicel olarak tespit etmeyi. Bu protokol, gelişim biyolojisi ve gen fonksiyonu çalışmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar yılda protokolü geliştirilmiş tüm Jarvis laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

MRNA in situ hibridizasyon Radyoaktif yaygın bölgesel doku organizasyonu, hücre tipi ve beyin fonksiyonel aktivite 2-5,10,12-14 eğitim dahil olmak üzere farklı amaçlar için kullanılır. Daha sonra kullanmak olan mRNA beyinde artan sinirsel aktivite, sık sık adı verilen aktivite bağımlı genler veya erken genler bağlıdır genler üzerinde. Yavruların / yenidoğan, gençler de dahil olmak üzere ve çoklu yaş; birden dokularda, beyin, deri ve kas dahil olmak üzere; bu kullanımlar ile, yöntem memeliler (örneğin insan), balık ve amfibiler, kuşlar da dahil olmak üzere, birden fazla tür arasında uygulanmış , yetişkin ve burada bütün embriyo bölümlerde 2,3,5,15-17. Bizim protokolünün özel özellikleri şunlardır: (1) Bu anatomik özgüllük ve nicel özgüllük arasında bir denge oluşturur. X-ray film üzerinde gen ekspresyonu ölçmek için, görüntülerin dijital resimler (. Örn: Şekil 1A ve 1B) almak, Pho kullanınilgi bölgelerinde piksel yoğunluğu ölçmek ve doku dışında film arka plan seviyeleri çıkarmak ama hala cam slayt 2,4 açık olarak toshop (Adobe) histogram fonksiyonu. Hücresel düzeyde ifade ölçmek için, yüksek büyütme (; Şekil 4 40-100X) altında hücreleri üzerinde gümüş taneleri görüntüleri çekin. Daha sonra cam slayt üzerine hücreler olmadan benzer bir alanda arka sayımı dışarı çıkarmak, görüntü gümüş tanelerinin sayısını saymak için NIH at Wayne Rasband tarafından Image J eşik ve tedbir işlevlerini kullanın, hücrelerin sayısına göre bölmek hücre başına ifade. 4,18 bir değerleri (2), aynı anda 100-200 slayt işleme izin, mineral yağ banyosu tarafından oluşturulan sıkı coverslip mühür nedeniyle nispeten yüksek verimlilik olabilir. elde etmek için Standart in-situ hibridizasyon yöntemleri parafilm, oje ve slaytlar çok yer kaplayacak diğer araçlar ile slaytlar imzalamak için uzun sürer; (3) yüksek olduğuDekstran sülfat ve hibridizasyon tamponu 2,13 olarak Denhardt çözümü sayesinde düşük bolluk transkript için hassas; (4) karanlık alan içinde görüntüleme yaklaşımı 4,5 bir mikroskop üzerinde karanlık alan aydınlatma altında fotoğraf çekerken nedeniyle yüksek kontrastlı görüntüler verir. Ayrıca, bu tür faaliyetlere bağlı gen ekspresyonu olarak gen ekspresyonu küçük değişiklikler, hassas algılama 19 özel davranış algı ve üretim sırasında aktive spesifik beyin bölgelerinde belirlemenizi sağlar. Radyoaktif olmayan protokoller göre sınırlamalar ikinci hücresel çözünürlük ve hücre içinde mRNA konumunu daha net olduğunu, ve emülsiyon ile çalışan manipülasyon ve ışığa karşı çok duyarlıdır. Aynı doku 10,17,20 birden fazla genin mRNA etiketlemek için in situ hibridizasyon gibi radyoaktif olmayan gibi diğer yöntemlerle birlikte bizim yöntemi birleştirmek mümkündür. Bu immünsitokimya ile kombine edilebiliramacıyla aynı örnek RNA ve protein ifadesini hem etiketlemek için belirli bir hücre tipleri ile 10 mRNA co-lokalize. Bu çifte etiketleme deneyler için gerekli olan protokol modifikasyonlar bahsedilen referanslarda tarif edilmektedir. Özetle, bizim yaklaşım bölge örgütü, doku fonksiyonel aktivite ve gen fonksiyonu anlamak için zamanlama ve gen ekspresyon hücresel konumun anlamayı kolaylaştırır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Asetik anhidrit </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Kresil violet asetat </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Termo bilimsel </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Deiyonize formamid </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Kalıp gömülmesi </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marka SuperFrost Plus slayt </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN kiti </td><td> Q-Bio gen </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak BioMax MR filmi </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emülsiyon </td><td> Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Profesyonel geliştirici D19 </td><td> Kodak </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Profesyonel Fixer </td><td> Kodak </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Madeni yağ </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poli A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> RATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Emniyet-çözün çözüm </td><td> Güvenliği Araştırma Ürünler Uluslararası çözün </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Asetat </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat dibazik </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum fosfat monobazik </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA polimeraz </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> Metal raf boyama </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Doku-Tek Ekim </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Transkripsiyon tampon </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolamin </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Çözümler: <ol><li> Riboprobes yapımı için Reaktifler: 1.5 ul DNA örneğinin (0.2-0.3 mg / ml), 5x optimize transkripsiyon tampon 2 ul, 100 mM DTT 1 ul (Promega gelen Polimeraz ile gelir, mixayrıca, oda sıcaklığında), 0.3 ul RNasin (40 ünite / ul), AGC ribonukleotid karışım çözeltisi, G 35 UTP 3.5 ul, ve 1 ul RNA polimeraz 1.5 ul. Nükleaz içermeyen su ile 10 ul kadar getir. </li><li> AGC ribonükleotid karışım çözeltisi: 10 mM ATP, GTP ve birlikte CTP eşit miktarda karıştırın. </li><li> 40 ul RNaz ve DNaz ücretsiz su, 3M Sodyum asetat ve% 100 EtOH 125 ul 5 ul: ücretsiz S 35 UTP kaldırmak EtOH yağış Sodyum asetat çözeltisi. </li><li> Hibridizasyon tampon maddesi (10 ml stok):% 100 deiyonize formamid, 5M NaCl 600 ul, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 5 ml, 0.5 M EDTA 240 ul (pH = 8.0), 100 kat Denhart çözümü 100 ul, 1M DTT, 20mg/ml tRNA, 20 mg / ml poli A 125 ul, ve sodyum dekstran sülfat ile 1 g, 250 ul 100 ul. 10 ml kadar toplam hacme getirmek için DEPC-arıtılmış su ilave edilir. Tüm sodyum dekstran sülfat eriyene kadar 55 ° C&#39;de inkübe sonra şiddetle çalkalanır ve. Içinde hibridizasyon tamponu Mağaza~ 6 ay boyunca iyi -20 ° C,. </li><li> 4% paraformaldehit çözeltisi tamponlu: paraformaldehit için tasarlanmış, 50 ° C ısıya kadar bir sıcak plaka üzerinde karıştırılarak bir şişeye 760 ml saf suda paraformaldehit ile 40 g ekleyin. Paraformaldehit eritmek için 10N NaOH 320 ul ekleyin. (~ 10 dk) çözüldükten sonra, 10x PBS 100 ml ekleyin ve 1 litre kadar saf su ile ses getirmek. Karıştırın ve paraformaldehit eriyene kadar çözüm ısıtın. PH 7.4 olmalıdır. </li><li> Asetilasyon tamponu: trietanolamin 13.6 ml damıtılmış su artı 1 litre asetik anhidrit 2.52 ml. </li><li> 20x SSPE çözüm: 3M NaCl 200 mM NaH 2 PO 4-H 2 O, ve distile su ile 200 mM EDTA. 10N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlamak çözeltisi. </li><li> 10x PBS tamponu: 80g NaCl, KCl 2.0g, Na 2 HPO 4 14.4g, ve KH 2 2.4 g distile su PO 4. PH 7.0 &#39;çözüm ayarlayın ve 1 lite toplam hacmi getirecekr. </li><li> İkinci yıkama solüsyonu:% 0.1 β-merkaptoetanol ve 2x SSPE% 50 formamid </li><li> Cresyl viyole asetat çözeltisi: musluk suyunda% 3 cresyl viyole asetat (damıtılmış su iyi boyama önler), oda sıcaklığında, bir döküm kalıbı içinde karıştırma ile bir gece boyunca eritildi. Bir 1mm Whatman filtre kağıdı ve Büchner hunisi ile suction filtre. </li></ol>

radyoaktif in situ</emdoku Çeşitli gen patterns saptayan> hibridizasyon

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Bir gen ile ifade edilen bir zamanlama, seviye, hücresel yerleşimi ve hücre tipi bilmek genin işlevinin anlayışımıza katkıda bulunmakta. Bu özelliklerin her biri hücre içinde mRNA in situ hibridizasyon ile gerçekleştirilebilir. Burada Clayton ve ark. (1988) 1 özellikle yetişkin omurgalı beyinleri 2-5 için, yıllardır bizim laboratuarımızda başarıyla çalışmaktadır modifiye in situ hibridizasyon yöntemi radyoaktif bir sunuyoruz. Hedef diziyle uzun tamamlayıcı RNA (cRNA) probları düşük bolluk transkript 6,7 tespiti için izin verir. CRNA problar radyoaktif nükleotidlerin Kuruluş düşük bolluğu transkript ve kantitatif analizleri daha da algılama hassasiyetini sağlar, ya da ışığa duyarlı x-ray film veya doku üzerinde kaplı emülsiyon tarafından. Bu yöntemler hedef gen ekspresyonunun uzun vadeli bir kaydın sağlar. Radyoaktif olmayan prob met ile karşılaştırıldığındaBöyle DIG-etiketleme gibi ODS, radyoaktif prob hibridizasyon metodu düşük bolluğu transkriptlerin algılamak için HRP-antikorları ve / veya TSA kiti kullanılarak çok sayıda amplifikasyon adımları gerektirmez. Bu nedenle bu yöntem kantitatif analiz için sinyal şiddeti ve hedeflenen mRNA miktarları arasında doğrusal bir ilişki sağlar. Aynı anda 100-200 slaytlar işleme izin verir. Bu embriyolar farklı gelişim evreleri için de çalışıyor. Embriyonik doku zor doku bölümleri ile hücre popülasyonu arasındaki sınırları görmek için yapım, hücreler arasında daha az uyum ile, yetişkin dokuya göre daha kırılgan olduğu için gen ekspresyonu pek çoğu gelişimsel çalışmaları kısmen insan embriyosu ve radyoaktif olmayan yaklaşımlar 8,9 kullanın. Buna karşılık, hassasiyet büyük aralığı nedeni ile radyoaktif yaklaşımı, daha kolay popülasyonlar arasındaki sınırları görmek için yapım, doku bölgeleri arasında gen ekspresyonu çözünürlükte yüksek kontrast elde edebilmektedir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar ortaya koyabilirBir yeni tanımlanan gen mümkün önemi, ve daha da ilgi genindeki fonksiyonu tahmin.

Bu protokol başarıyla kantitatif omurgalı türlerin birden çok doku tipleri düzeyleri ve mRNA mekansal kalıpları tespit etmek için kullanılır. Yöntem, düşük bolluk transkript algılamak ve aynı anda slayt yüzlerce işleme izin edebilirsiniz. Biz örnek olarak kuş embriyonik beyin oluşumu ekspresyon profili kullanarak bu protokolü sunarız.

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Bir genin hangi zamanda, hangi düzeyde, hangi hücresel lokalizasyonda ve hangi hücre tipinde eksprese olduğunun bilinmesi, genin fonksiyonuna dair anlayışımıza katkıda bulunur. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gen fonksiyonunun anlaşılmasına katkıda bulunmak için belirli gen ekspresyon bölgelerini belirlemek ve gen ekspresyonunun zamanlamasını ve seviyelerini karakterize etmektir. Bu, doku bütünlüğünü korumak amacıyla, prosedürde kullanılacak dokunun hızlıca hasat edilmesi ve hazırlanmasıyla sağlanır. İkinci bir adım olarak, ribo probların arka plan bağlanmasını azaltmak için dokuya işlem uygulanır.Ardından, ribo probları doku ile hibritlenir ve RIBA probunun bağlanması görselleştirilir. X-ray filmi veya ışığa duyarlı emülsiyon kullanılarak, x-ray görüntüleri veya karanlık ve parlak alan mikroskobu ile analizlere dayalı olarak gen ekspresyonunun konumunu ve seviyesini gösteren sonuçlar elde edilir. Image J yazılımı kullanılarak gerçekleştirilen süreçte, birçok kişinin hata yaptığı ve iyi yapılması gereken birkaç kritik adım bulunmaktadır; bunlardan biri de arka plan gürültüsünü önlemektir.Kötü doyurma veya uygun sıcaklıkta hibridizasyon yapmama gibi arka plan gürültüsüne neden olabilecek bir dizi adım vardır. Bir diğeri ise RNA probunuzu degrade edecek olan RNA kontaminasyonudur. Bu nedenle, her şeyi RNA'dan arındırılmış tutma konusunda dikkatli olmalısınız.Üçüncü olarak, lamlar emülsiyona daldırıldığında, karanlık odanızda herhangi bir ışık sızıntısı olmadığından veya üç hafta sürebilen bu sürecin tüm aşamalarında emülsiyonun ışığa maruz kalmadığından emin olmanız gerekir. Bu tekniği, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Hun Chen uygulamalı olarak gösterecek. Taze bir beyin hasat edilip 1x PBS ile durulandıktan sonra, beyni oda sıcaklığında medya içeren bir kalıba daldırarak OCT doku teknik medyasına gömün.Beynin kesit alma işlemi için gerektiği şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Ardından, kuru buzun üzerine etanol püskürttükten sonra, bloğu etanol ve kuru buz karışımına yerleştirerek dokuyu dondurun. Etanolün bloğun içine girmemesine dikkat ederek, bir kriyostat yardımıyla donmuş dokuyu 10 ila 12 mikron kalınlığında kesitler halinde dilimleyin ve beyin ile embriyonik dokular için uygun olan super plus lameller üzerine monte edin.En iyi kesme sıcaklığı -18 °C ile -20 °C aralığındadır. Kesitleri -80 °C'de bir lam kutusunda saklayın. Lamları -80 °C depolama alanından kuru buz üzerindeki bir metal rafa aktarın.Ardından, sertifikalı bir çeker ocak içerisinde çalışırken, rafı oda sıcaklığının üç ila beş derece üzerine önceden ısıtılmış %4'lük paraformaldehit çözeltisine yerleştirin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından rafı paraformaldehitten çıkarın ve rafı PBS içine 15 kez daldırarak lamları yıkayın. Bu yıkama adımını, her seferinde taze PBS çözeltisi kullanarak iki kez tekrarlayın.Ardından, RIBA probunun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için lamları taze hazırlanmış asetilasyon tamponu içerisinde 10 dakika bekletin. Sonra lamları daha önce yaptığınız gibi yıkayın, ancak bu kez yıkama solüsyonu olarak 2x SSPE kullanın. Dokuyu, her bir solüsyonda iki dakika kalacak şekilde %70, %95 ve %100'lük etanol serisi ileyerekdehidre edin.Ardından slaytları çeker ocakta en az 10 ila 15 dakika boyunca kurutun. Yazılı protokoldaki talimatlara göre RIBA probunu sentezledikten sonra, tüm slaytlar için gerekli olan RIBA probu ve hibridizasyon çözeltisi hacmini hesaplayın. Ribo prob hibridizasyon karışımını beş dakika boyunca 65 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun.Ribo probu denatüre etmek için 100 µL Ribo probu hibridizasyon solüsyonu pipetleyerek lam üzerine yayın. Ardından, solüsyonu doku ve lam üzerine eşit şekilde yaymak için ikinci bir lam kullanın. Lamı yatay ve yüzü yukarı bakacak şekilde bir metal rafa yerleştirin ve tüm lamlar hazır olduğunda, rafı yavaşça 65 °C'lik bir yağ banyosuna minimum dört saat ve maksimum 16 saat süreyle daldırın.Yağ, inkübasyonun ardından lamel çevresinde hava sızdırmaz bir mühür oluşturur; lamları içeren metal raftaki fazla yağı temizleyin. Ardından, çeker ocak içerisinde kloroform içeren cam veya metal bir tepsiye rafı yerleştirin. Yıkama işlemini, taze kloroform içeren ikinci bir tepsiyle tekrarlayın.Ardından, lamelleri gevşetmek ve fazla hibridizasyon çözeltisini çözmek için rafı %0,1 beta-merkaptoetanol artı 2x SSPE çözeltisine daldırın. Daha sonra lamları, taze %0,1 beta-merkaptoetanol artı 2x SSPE çözeltisinden oluşan ikinci bir çözeltiye aktarın. Lamelleri çıkarılmış lamları, bağlanmamış fazla RNA probunu uzaklaştırmak amacıyla oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilmek üzere, %0,1 beta-merkaptoetanol içeren 2x SSPE çözeltisi bulunan bir tepsideki taze bir rafa aktarın.Ardından, lamların bulunduğu kaseti, 65 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş, final konsantrasyonu %0,1 beta ME içeren 2x SSPE artı %50 ana geniş çözeltiye aktarın ve 65 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bu çözeltiyi ve önceki tüm sulu yıkama çözeltileri ile lamelleri radyoaktif atık olarak bertaraf edin. Sonrasında, lamları 65 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş 0,1x SSPE içerisinde, her biri 30 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.Ardından dokuyu, her bir çözeltide iki dakika boyunca %70, %95 ve %100'lük etanol serisi ilele dehidre edin. Son olarak lamları bir çeker ocakta en az 30 dakika boyunca kurutun. İlk olarak, dokuda radyoaktif bir sinyalin mevcut olup olmadığını belirleyin.Kurutulmuş lamları, güvenli ışık kullanılan karanlık bir odada çalışarak bir film kasetine yerleştirin ve lamların üzerine röntgen filmi koyun. Lamların filmin emülsiyon tarafına baktığından emin olun ve ardından kaseti kapatın. Transkriptlerin beklenen bolluğuna bağlı olarak, lamları bir ila yedi gün boyunca filme maruz bırakın.Pozlama tamamlandıktan sonra, röntgen filmini standart geliştirici ve sabitleyicide geliştirin. Hibritleme sinyali, hücresel çözünürlüğü belirlemek ve sinyali dokunun üzerinde görmek için emülsiyondaki pozlanmış gümüş taneciklerinden kaynaklanan siyah alanlar şeklinde filmde görünecektir. Lamlar fotoğraf emülsiyonuna daldırılır ve ardından karşı boyama yapılır.Slaytlar kristal viyole ile karşıt boyanacaksa, kesitler yazılı protokoldeki talimatlara göre dilikize edilmelidir. Bu aşamada, karanlık odada çalışarak bir tüpe distile su doldurun. Bir miktar NTB emülsiyonu alın ve emülsiyonu distile su ile bire bir oranda seyreltin.Emülsiyonu 42 °C'lik bir su banyosunda 20 ila 30 dakika boyunca erittikten sonra, 42 °C'lik su banyosundaki cam daldırma kabına aktarın. Seyreltilmiş emülsiyon seviyesi, lam daldırıldığında lam üzerindeki tüm kesitleri kapatacak düzeyde olmalıdır. Çok sayıda lam varsa, ekstra emülsiyona ihtiyaç duyulabilir.Şimdi lamları, 42 °C'lik bir su banyosundaki seyreltilmiş emülsiyona daldırın ve ardından daldırılan lamları karanlık odada kapalı, ışık geçirmeyen bir kapta gece boyunca veya bir fırında ışıklar kapalıyken 37 °C'de iki ila üç saat boyunca kurutun. Kurutma işleminden sonra lamları bir lam kutusuna aktarın. Kenarları siyah elektrik bandı ile mühürleyin ve ardından alüminyum folyo ile kaplayın.Kutuları birkaç gün veya hafta boyunca dört derece Celsius'ta saklayın; geliştirme aşamasına gelindiğinde lamları oda sıcaklığına getirin. Ardından, karanlık odada çalışırken, lamları içeren rafı kutulardan çıkarın ve 16 derece Celsius'ta üç ila beş dakika boyunca codec D 19 geliştirici ile geliştirin. Sonrasında, geliştirilmiş lamları oda sıcaklığındaki musluk suyunda bir dakika boyunca yıkayın.Ardından lamları, 19 °C'de altışar dakika süreyle iki kez tespit çözeltisinde inkübe edin; ikinci tespit inkübasyonu sırasında oda ışıkları açılabilir. Şimdi lamları oda sıcaklığında akan su altında en az 30 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra bir jilet kullanarak, lam hâlâ ıslakken arka yüzündeki emülsiyonu kazıyın.Son olarak, %0,3 kristal viyole ile karşı boyama yapın, ardından gerekirse yazılı protokoldeki talimatlara göre lamları susuzlaştırıp kapatın. Lamların arkasındaki fazla emülsiyonu, suyla ıslatıp bir jiletle kazıyarak temizleyin. Lamları %80 etanol çözeltisinde durulayın ve kalıntılardan ve tozdan kurtulmak için bir veya iki kez nazikçe silin.Karanlık alan veya parlak alan aydınlatması altında fotoğraflar çekin. Toz partikülleri, bir diseksiyon mikroskobu altında karanlık alanda kolayca görülebildiği için, tozsuz kaliteli görüntüler elde etmek amacıyla kazıma ve temizleme adımlarının iki ila üç kez tekrarlanması gerekebilir. Aşağıdaki görüntüler, röntgen filmlerinden elde edilen in situ hibridizasyon otoradyografisi örnekleridir.Bu röntgen filmi görüntüsü, Fox P1'e karşı antisens ribo prob ile hibridize edilmiş, embriyonik 10. gündeki zebra ispinoz şarkı kuşunun sagital tüm baş kesitini göstermektedir. Film üzerindeki siyah pozlanmış tanecikler, beyin içinde görülebildiği üzere haberci RNA ekspresyonunu göstermektedir; burada Fox P1 haberci RNA, mesoalium striatum ve dorsal talamusta zenginleşmiştir. Röntgen filmi görüntüsü, Cuper'e karşı antisens RIBA prob ile hibridize edilmiş aynı zebra ispinoz şarkı kuşundan alınan bir kesiti göstermektedir.TF iki Co.TF iki, palam alium ve daha ventral talamus ihtiyacında zengindir. Aşağıdaki görüntüler, emülsiyon daldırma lamlarından alınan in situ hibridizasyon otoraidiyografisi örnekleridir. Bir diseksiyon mikroskobu altında çekilen bu karanlık alan görüntüsü, Fox P bir'e karşı antisens RIBA probu ile hibridize edilmiş, kuluçka sonrası altıncı gündeki zebra ispinozunun sagital tüm baş kesitini göstermektedir.Dokunun üzerindeki emülsiyonda bulunan beyaz açık gümüş granülleri, haberci RNA ekspresyonunu göstermektedir. Kırmızı renk, kressel violet boyasını temsil etmektedir. Ölçek çubuğu bir milimetreyi temsil eder.Buradaki görüntü, antisense ribo probu ile coop TF two için hibridize edilmiş aynı zebra ispinoz şarkı kuşundan alınan bir kesiti göstermektedir. Aşağıdaki görüntüler, embriyonik 12. gündeki zebra ispinozundan alınan sagittal kafa kesitlerinin röntgen filmleri üzerindeki otoradiografisinde farklı kalıplar sergileyen antisense ve sense işaretlemelerini karşılaştırmaktadır. Kesik çizgi tüm beynin konturunu, C ise serebellumu belirtmektedir.PAC altı'nın antisens sarmalının beyinde, özellikle ventriküler bölgede eksprese olduğu görülmektedir. Pak altı'nın sens sarmalı ile hibridize edilen komşu kesitte, embriyo başı boyunca herhangi bir arka plan ekspresyonu görülmezken, antisens sarmalda olduğu gibi retinanın pigment tabakasında belirgin bir ekspresyon görülmektedir. Aşağıdaki görüntüler, zebra ispinozu beyninin geç embriyonik evrelerinden alınan, parlak alan ve karanlık alan görünümleri altındaki iki gen ekspresyon sinyalini ve emülsiyon daldırma lamlarını göstermektedir.Bu aydınlık alan görüntüsü, embriyonik 10. gündeki D one B ekspresyonunu göstermektedir. Emülsiyona yapılan normal bir pozlamada, siyah görünen etiket bu büyütmede zar zor seçilebilmektedir. Bu görüntü, önceki görüntüdeki ile aynı kesit ve büyütmeyi göstermektedir ancak karanlık alan görünümüne geçilmiş olup striatum ve talamustaki etiketlemeler beyaz renkte görülmektedir.Bu aydınlık alan görüntüsü, embriyonik 12. gündeki slit three ekspresyonunu göstermektedir. Emülsiyona aşırı pozlama yapıldıktan sonra, siyah etiket kolayca görülebilir. SC omuriliğin konumunu, CB ise serebellumun konumunu belirtmektedir.Rostral yön sola doğrudur. Burada gösterilen görüntü aynı kesittir ve büyütme aynıdır; ancak parlak alan görüntüsüyle eşleşen spinal korddaki beyaz işaretlemeleri gösteren karanlık alan görünümüne geçilmiştir. İlerideki görüntüler, hücresel düzeydeki gümüş tane çözünürlüğünü göstermektedir.Burada zebra ispinozunun ön beynindeki Fox P1 haberci RNA işaretlemesi gösterilmiştir; gümüş tanecikleri, kristal viyole ile boyanmış hücrelerin üzerinde siyah noktalar şeklinde görünmektedir. Bu görüntü, yetişkin zebra ispinozu mesoalium bölgesindeki münferit hücrelerde yüksek düzeyde ekspresyonu göstermektedir. Bu görüntü ise aynı kesitteki komşu alium bölgesindeki münferit hücrelerde düşük düzeyde ekspresyonu göstermektedir.Hi Fox. P one haberci RNA ekspresyonu, embriyonik 12. gün mezalyumunda hücreler üzerinde görülmektedir.Burada görülen embriyonik hücreler, önceki iki görüntüde görülen yetişkin hücrelere kıyasla daha küçük ve daha sıkı yerleşimlidir. Son olarak, bu görüntü aynı kesitin bitişik aliumundaki hücreler üzerinde düşük düzeyde ekspresyon göstermektedir. Bu prosedür uygulandıktan sonra, hedef genin hangi hücre tipinde eksprese olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla immünokimya gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, kurum hibridizasyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür sırasında kişisel koruyucu ekipmanlar gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

Bu videoda, mRNA problarının belirli hedef mRNA'ya hibritleştirilmesini içeren sıralı bir hibridizasyon stratejisi açıklanmaktadır. Prob hibridizasyonunu takiben, histolojik numunelerin RNA-CISH sırasında sinyal-gürültü oranının azaltılması yoluyla çözünürlüğü artırmak için sinyal amplifikasyonu gerçekleştirilir.

RNA In Situ Hibridizasyonda Prob Hibridizasyonu ve Sinyal Amplifikasyonu: Doku Kesitlerinde Spesifik RNA Dizilerini Tespit Etmek İçin Bir Teknik

Bu video, RNA kromojenik in situ hibridizasyonulama sırasında sinyal algılama protokolünü sunar. Bu teknik, sağlam bir doku örneğinde aktif bir onkojenik enfeksiyonu görsel olarak teşhis etmek için kullanılabilir.

RNA CISH Sinyal Tespiti: Sağlam Doku Örneklerinde RNA In Situ Hibridizasyon Sırasında Kromojenik Sinyalleri Tespit Etme Tekniği

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

Öğrenin, radyoaktif in situ hibridizasyon yöntemiyle omurgalı dokularda mRNA ekspresyon desenlerini ve düşük yoğunluklu transkriptleri nicel olarak tespit etmeyi. Bu protokol, gelişim biyolojisi ve gen fonksiyonu çalışmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

Radyoaktif In situ Hibridizasyon

Daha fazla video keşfet