Radyoaktif In situ Hibridizasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gen fonksiyonunun anlaşılmasına katkıda bulunmak için belirli gen ekspresyon bölgelerini belirlemek ve gen ekspresyonunun zamanlamasını ve seviyelerini karakterize etmektir. Bu, dokunun bütünlüğünü korumak amacıyla, prosedürde kullanılacak dokunun hızlıca hasat edilmesi ve hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, ribo probların arka plan bağlanmasını azaltmak için dokuya işlem uygulanır.

Ardından, ribo probları dokuyla hibridize edilir ve RIBA probunun bağlanması görselleştirilir. X-ışını filmi veya ışığa duyarlı emülsiyon kullanılarak, x-ışını görüntüleri veya karanlık ve parlak alan mikroskopisi ile analizine dayalı olarak gen ekspresyonunun konumunu ve seviyesini gösteren sonuçlar elde edilir. Image J yazılımı kullanılarak gerçekleştirilen süreçte, birçok kişinin hata yaptığı ve doğru yapılması gereken birkaç kritik adım vardır; bunlardan biri de arka plan gürültüsünü önlemektir.

Kötü doyurma veya doğru sıcaklıkta hibridizasyon yapmama gibi arka plan oluşmasına neden olabilecek bir dizi adım vardır. Bir diğer neden ise RNA probunuzu bozacak olan RNA kontaminasyonudur. Bu nedenle, her şeyi RNA'dan arındırılmış tutma konusunda dikkatli olmalısınız.

Üçüncü olarak, lamlar emülsiyona daldırıldığında, karanlık odanızda herhangi bir ışık sızıntısı olmadığından veya üç hafta kadar sürebilen bu sürecin tüm aşamaları boyunca emülsiyonun ışığa maruz kalmadığından emin olmanız gerekir. Bu tekniği, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Hun Chen gösterecek. Taze bir beyin hasadı yapıldıktan ve 1x PBS ile durulandıktan sonra, beyni oda sıcaklığında medyayı içeren bir kalıba daldırarak OCT doku teknik medyasıyla gömün.

Beynin kesim için gerekli şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Ardından, kuru buzu etanolle püskürttükten sonra, bloğu etanol ve kuru buz karışımına yerleştirerek dokuyu dondurun. Etanolün bloğun içine girmemesine dikkat ederek, bir kriyostat kullanarak dondurulmuş dokuyu 10 ila 12 mikron kalınlığında kesitlere ayırın ve beyin ile embriyonik dokular için uygun olan super plus lamlarına monte edin.

En uygun kesme sıcaklığı -18 °C ile -20 °C aralığındadır. Kesitleri -80 °C'de bir lam kutusunda saklayın. Lamları -80 °C'deki depolama alanından kuru buz üzerindeki bir metal rafa aktarın.

Ardından, sertifikalı bir çeker ocak altında çalışırken, rafı oda sıcaklığının üç ila beş derece üzerine önceden ısıtılmış %4'lük paraformaldehit çözeltisine yerleştirin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin; inkübasyonun ardından rafı paraformaldehitten çıkarın ve rafı 15 kez PBS içine daldırarak slaytları yıkayın. Bu yıkama adımını, her seferinde taze PBS çözeltisi kullanarak iki kez tekrarlayın.

Ardından, RIBA probunun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için lamları taze hazırlanmış asetilasyon tamponunda 10 dakika boyunca bekletin. Daha sonra lamları daha önce yaptığınız gibi yıkayın, ancak bu kez yıkama solüsyonu olarak 2X SSPE kullanın. Dokuyu, her bir solüsyonda ikişer dakika bekletecek şekilde %70, %95 ve %100'lük etanol serisi ileye dehidre edin.

Ardından lamları çeker ocakta en az 10 ila 15 dakika boyunca kurutun. Yazılı protokoldeki talimatlara göre RIBA probu sentezlendikten sonra, tüm lamlar için gerekli olan RIBA probu ve hibridizasyon çözeltisi hacmini hesaplayın. Ribo prob hibridizasyon karışımını beş dakika boyunca 65 °C'ye ön ısıtın.

Ribo probunu denatüre etmek için 100 µL Ribo probu hibridizasyon solüsyonu pipetleyin ve lamel boyunca yayın. Ardından, solüsyonu doku ve lamel üzerine eşit şekilde yaymak için ikinci bir cam lamel kullanın. Lamı yatay ve üst yüzeyi yukarı bakacak şekilde metal bir rafa yerleştirin ve tüm lamlar hazır olduğunda, rafı yavaşça 65 °C'lik bir yağ banyosuna daldırarak minimum dört saat ve maksimum 16 saat bekletin.

Yağ, inkübasyonun ardından lamel etrafında hava sızdırmaz bir mühür oluşturur; slaytları içeren metal raftaki fazla yağı temizleyin. Ardından, çeker ocak içerisinde kloroform içeren cam veya metal bir tepsiye rafı yerleştirin. Yıkama işlemini taze kloroform içeren ikinci bir tepsi ile tekrarlayın.

Ardından, lamel setlerini gevşetmek ve fazla hibridizasyon solüsyonunu çözmek için rafı %0,1 beta-mercaptoethanol ve 2x SSPE solüsyonu karışımına daldırın. Sonra lamları, taze %0,1 beta-mercaptoethanol ve 2x SSPE solüsyonundan oluşan ikinci bir çözeltiye aktarın. Lamelleri çıkarılmış lamları, bağlanmamış fazla RNA probunu uzaklaştırmak için oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilecek şekilde, 2x SSPE içinde %0,1 beta-mercaptoethanol içeren bir tepsideki taze bir rafa aktarın.

Ardından, slayt rafını 65 °C'de ön ısıtılmış, son konsantrasyonu %0,1 beta ME kapto etanol içeren 2x SSPE artı %50 ana geniş çözelti içerisine aktarın ve 65 °C'de bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bu çözeltiyi ve önceki tüm sulu yıkama çözeltileri ile lamelleri radyoaktif atık olarak imha edin. Sonrasında, slaytları 65 °C'de ön ısıtılmış 0,1x SSPE ile her biri 30 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın.

Ardından dokuyu, her bir solüsyonda iki dakika boyunca bekletilerek %70, %95 ve %100'lük etanol serisi ile dehidre edin. Son olarak lamları bir çeker ocakta en az 30 dakika boyunca kurutun. İlk olarak, dokuda radyoaktif bir sinyal olup olmadığını belirleyin.

Kurutulmuş lamları, güvenli ışık kullanılan karanlık bir odada çalışarak bir film kasetine yerleştirin ve lamların üzerine röntgen filmi koyun. Lamların filmin emülsiyon tarafına baktığından emin olun ve ardından kaseti kapatın. Transkriptlerin beklenen bolluğuna bağlı olarak, lamları bir ila yedi gün boyunca filme maruz bırakın.

Pozlama tamamlandıktan sonra, röntgen filmini standart geliştirici ve sabitleyicide geliştirin. Hibritleşme sinyali, hücre çözünürlüğünü belirlemek ve doku üzerindeki sinyali görmek için emülsiyondaki pozlanmış gümüş taneciklerinden kaynaklanan siyah alanlar şeklinde filmde görünecektir. Lamlar fotoğraf emülsiyonuna daldırılır ve ardından karşıt boyama yapılır.

Eğer lamlar kristal viyole ile karşıt boyanacaksa, kesitler yazılı protokoldeki talimatlara göre delikidize edilmelidir. Bu aşamada, karanlık odada çalışarak bir tüpe distile su doldurun. Bir miktar NTB emülsiyonu alın ve emülsiyonu distile su ile bire bir oranında seyreltin.

Emülsiyonu 42 °C'lik bir su banyosunda 20 ila 30 dakika boyunca erittikten sonra, 42 °C'lik bir su banyosu içindeki cam daldırma kabına aktarın. Dilüe edilmiş emülsiyon seviyesi, lam daldırıldığında lam üzerindeki tüm kesitleri örtecek düzeyde olmalıdır. Çok sayıda lam varsa, ekstra emülsiyon gerekebilir.

Şimdi lamları 42 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda seyreltilmiş emülsiyona daldırın ve ardından daldırılan lamları karanlık oda içerisinde ışık sızdırmayan kapalı bir kapta gece boyunca veya ışıklar kapalıyken 37 °C'deki bir fırında iki ila üç saat boyunca kurutun. Kurutma işleminden sonra lamları bir lam kutusuna aktarın. Kenarlarını siyah elektrik bandıyla mühürleyin ve ardından alüminyum folyo ile kaplayın.

Kutuları birkaç gün veya hafta boyunca 4 °C'de saklayın; geliştirme aşamasına gelindiğinde lamları oda sıcaklığına getirin. Ardından karanlık odada çalışırken, lamları içeren rafı kutulardan çıkarın ve 16 °C'de 3 ila 5 dakika boyunca codec D 19 geliştirici çözeltide geliştirin. Sonrasında, geliştirilen lamları oda sıcaklığındaki musluk suyunda bir dakika boyunca yıkayın.

Ardından lamları, fiksasyon çözeltisinde 19 °C'de altışar dakikalık iki inkübasyona tabi tutun; ikinci fiksasyon inkübasyonu sırasında oda ışıkları açılabilir. Şimdi lamları, oda sıcaklığındaki akar su altında en az 30 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, lamlar henüz ıslakken bir jilet yardımıyla lamın arkasındaki emülsiyonu kazıyın.

Son olarak, %0,3 kristal viyole ile karşı boyama yapın, ardından gerekirse yazılı protokoldeki talimatlara göre lamlarıydehidre edip kapatın. Lamların arkasındaki fazla emülsiyonu, suyla ıslatıp bir jilet yardımıyla kazıyarak temizleyin. Lamları %80 etanol çözeltisiyle durulayın ve kalıntı ile tozları temizlemek için bir veya iki kez nazikçe silin.

Karanlık alan veya aydınlık alan aydınlatması altında fotoğraflar çekin. Toz partiküllerinden arındırılmış kaliteli görüntüler elde etmek için kazıma ve temizleme adımlarının iki ila üç kez tekrarlanması gerekebilir; toz partikülleri, diseksiyon mikroskobunun karanlık alan modunda kolayca görülür. Aşağıdaki görüntüler, röntgen filmlerinden elde edilen in situ hibridizasyonun otoradyografi örnekleridir.

Bu röntgen filmi görüntüsü, Fox P1'e karşı antisens ribo prob ile hibritlenmiş, embriyonik 10. gündeki zebra ispinozu şarkı kuşunun sagital tüm baş kesitini göstermektedir. Film üzerindeki siyah pozlanmış tanecikler, beyinde görülebileceği üzere haberci RNA ekspresyonunu göstermektedir; burada Fox P1 haberci RNA'sı, mezalium striatum ve dorsal talamusta zenginleşmiştir. Röntgen filmi görüntüsü, Cuper'e karşı antisens RIBA prob ile hibritlenmiş aynı zebra ispinozu şarkı kuşundan alınan bir kesiti göstermektedir.

TF two Co.TF two, palam alium ve daha ventral talamusun ihtiyacına göre zenginleştirilmiştir. Aşağıdaki görüntüler, emülsiyon daldırma lamlarından alınan in situ hibridizasyon otoraadyografisi örnekleridir. Bir diseksiyon mikroskobu altında çekilen bu karanlık alan görüntüsü, Fox P one'a karşı antisense RIBA probu ile hibridize edilmiş, kuluçkadan sonra altıncı gündeki zebra ispinozunun sagital tüm kafa kesitini göstermektedir.

Dokunun üzerindeki emülsiyonda bulunan beyaz açık gümüş taneleri, haberci RNA ekspresyonunu göstermektedir. Kırmızı renk, kressel violet boyasını temsil eder. Ölçek çubuğu bir milimetreyi temsil etmektedir.

Buradaki görüntü, coop TF ikiye karşı antisens ribo kanıtı ile hibritlemiş olan aynı zebra ispinoz şarkı kuşundan bir kesiti göstermektedir. Aşağıdaki görüntüler, embriyonik 12. gündeki zebra ispinozundan alınan kafa kesitlerinin röntgen filmleri üzerindeki otoraadyografisinde farklı desenler sergileyen antisens ve sens işaretlemelerini karşılaştırmaktadır. Kesikli çizgi tüm beynin konturunu, C harfi ise serebellumu belirtmektedir.

PAC six'ın antisens zincirinin beyinde, özellikle ventriküler bölgede ifade edildiği görülmektedir. Pak six'ın sens zinciri ile hibridize edilen bitişik kesit, embriyo başı genelinde herhangi bir arka plan ifadesi göstermezken, antisens zincirde olduğu gibi retinanın pigment tabakasında belirgin bir ifade göstermektedir. Aşağıdaki görüntüler, geç embriyonik aşamalardaki zebra ispinozu beyninden alınan emülsiyon daldırma lamlarında, parlak alan ve karanlık alan görünümleri altında C'de iki gen ifadesi sinyalini göstermektedir.

Bu parlak alan görüntüsü, embriyonik 10. gündeki D one B ekspresyonunu göstermektedir. Emülsiyona yapılan normal bir pozlamada, siyah görünen işaretleme bu büyütmede güçlükle seçilebilmektedir. Bu görüntü, önceki görüntüyle aynı kesiti ve büyütmeyi göstermektedir; ancak striatum ve talamustaki işaretlemeleri beyaz renkte gösteren karanlık alan görünümüne geçilmiştir.

Bu aydınlık alan görüntüsü, embriyonik 12. gündeki slit three ekspresyonunu göstermektedir. Emülsiyona aşırı pozlama yapıldıktan sonra, siyah etiket kolayca görülebilmektedir. SC spinal kordun konumunu, CB ise serebellumun konumunu işaret eder.

Rostral yön soldadır. Burada gösterilen görüntü, aynı kesit ve büyütmenin karanlık alan görünümüdür; spinal korddaki beyaz etiketlemeler, parlak alan görüntüsüyle örtüşmektedir. Aşağıdaki görüntüler, hücresel düzeydeki gümüş tanesi çözünürlüğünü göstermektedir.

Burada, zebra ispinoğunun ön beynindeki Fox P1 haberci RNA etiketlemesi gösterilmiştir; gümüş tanecikleri, kristal menekşe ile boyanmış hücrelerin üzerinde siyah noktalar şeklinde görünmektedir. Bu görüntü, yetişkin zebra ispinoğunun mesoalium bölgesindeki bireysel hücrelerde yüksek bollukta ekspresyonu göstermektedir. Bu görüntü ise aynı kesitin bitişik alium bölgesindeki bireysel hücrelerde düşük bollukta ekspresyonu göstermektedir.

Hi Fox P1 haberci RNA ekspresyonu, embriyonik 12. gün mezalium hücrelerinde görülür.

Burada görülen embriyonik hücreler, önceki iki görüntüde görülen yetişkin hücrelere kıyasla daha küçük ve daha sıkı yerleşimlidir. Son olarak, bu görüntü aynı kesitteki komşu alium üzerindeki hücrelerde düşük düzeyde ekspresyon göstermektedir. Bu prosedür takip edildikten sonra, hedef genin hangi hücre tipinde eksprese olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla immünokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, in situ hibridizasyonun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür sırasında kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.