Name: İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Öğrenin, CysTMT etiketleme ve kütle spektrometresi kullanarak domateste Pseudomonas syringae'nin redoks düzenlenmiş proteinler üzerindeki etkilerini nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem, bitki stres yanıtlarını anlamak için sağlam bir proteomik yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar DC3000 zorlanma, domates tohumu, ve tavsiye sağlamak için Dr Greg Martin (Cornell Üniversitesi) ve onun grubuna teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Zhonglin yöntem geliştirme konusunda yardım almak için Biyoteknoloji Araştırma için UF Disiplinlerarası Merkezi DAB protokolü ve Proteomik Bölümü yardım için Mou teşekkür etmek istiyorum. Protein ekstraksiyonu için protokol Hurkman ve Tanaka 16 güncellenmiştir. 6 cysTMT etiketleme, adım 4 protokol orijinal Pierce Thermo Fisher Scientific ürün kılavuzuna 17 dayanmaktadır uyarlanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (S Chen MCB 0.818.051) tarafından finanse edildi.

1. Büyüyen fidan ve hazırlanması Bakteriler <ol><li> Fideler bir büyüme oda (22 az 8 saatlik bir ışık periyodu ile 160 ľmol fotonlar m -2 s -1 MetroMix 500 toprak karışımı (BWI ​​Şirketler) içinde çimlenmiş olan 20 karanlık ° C ve 16 saatlik ° C 1 hafta boyunca. Bağıl nem oranı% 70 olarak saptanmıştır. kuru hale gelen toprak tutmak için gerektiği gibi fideler musluk suyu ile sulandı. </li><li> Benzer büyüklükteki iki fidan sonra MetroMix 500 toprak içeren 4 &quot;çap tencere nakledilen ve 1.1 aynı koşullarda ek olarak 3 hafta boyunca yetiştirilir. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) Kings Yatak Orta (KBM) plakaların (litre başına: 20 g proteoz Peptonlu, 0,1975 g MgSO 4,% 1 Gliserol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) üzerine ilk T-çizikli ve yetiştirilen 28 az iki gün ° C. Tek bir koloni 300μl sıvı Kings karıştırılarak, toplanan B Orta (20 g proteoz pepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, 10 mL gliserol, 100x K 2 HPO 4 stokunun 10 ml (H 2 O 10 mL K 2 HPO 4 1,5 g), ve Kings B levha üzerine yayılmıştır. Bu 28 ° C&#39;de gece boyunca kültürlenir </li><li> Bakteriler inokulum 20 mL H 2 O. içine KBM plakadan kültüre bakteri kazıma ile hazırlanır 0,03 bir OD 600 (~ 10 6 cfu / ml), (10 mM MgCl2 + 400 uL Silwett-70) inokulasyon tamponu 1 L içinde hazırlanır. Aşılama tampon eksi bakterileri kontrol çözümü için hazırlanmıştır. </li></ol> 2. Pst ve H 2 O 2 ile Domates Aşılama Leke Histokimyasal <ol><li> Dört haftalık bitkiler 30 saniye için yukarıdaki aşılama çözüm içine batırarak ekildi. Şeffaf plastik poşet inokülasyondan hemen sonra bitkilerin üzerine konuldu. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin (DAB) 11 (H2O içinde 1 mg / ml DAB, pH 3.8 (HCI)) üç d hazırlandı lekeays önce tam çözünürleştirme ulaşmak için kullanabilirsiniz. Çözelti, oda sıcaklığında karıştırarak sallandı edildi. </li><li> Yirmi dört saat tedaviden sonra, tam genişletilmiş yaprak epidermal tarafı yukarı leke DAB yerleştirilir, kaldırılır, ve vakum 15 dakika infiltre edildi. Yaprakları daha sonra boyama için gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta konuldu. </li><li> Yapraklar 10 dakika süreyle% 95 etanol içinde kaynatıldı ve sonra% 75 etanol içinde tutuldu. </li></ol> 3. Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Hasattan sonra, domates yaprakları havanda kullanarak sıvı nitrojen ile ince toz topraklı edildi. </li><li> Doku 0.5 g, 1.25 mL fenol Tris pH 8.8 tamponlu ekleyin ve ekstraksiyon tamponu 1.25 mL / 0.5 g (0.1 M Tris-HCI pH 8.8, 10 mM EDTA, 0.9 M sukroz) daha sonra bir de birkaç dakika için devam taşlama çeker ocak. </li><li> Oakridge santrifüj tüpü (Termo Fisher Scientific Nalgene Company) ile özü aktarılır ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca ajite. </li><li> 5000 xg&#39;de santrifüjleyinve 15 ° C&#39;de 10 dakika süreyle. Yeni ve temiz bir tüpe üst fenol fazı aktarın. </li><li> Eşit hacimde Back-ayıklamak sulu faz fenol tampon ayıklanır; 30 dakika için bir çalkalayıcı kışkırtma. Santrifüj ve yeni bir Falcon tüpüne özü aktarmak. </li><li> Yukarıdaki adım bir kez daha tekrarlayın ve yeni Oakridge tüpüne özü aktarmak. </li><li> % 100 metanol (-20 ° C de muhafaza) içinde 0.1 M amonyum asetat 5 hacim ekleyerek fenol ekstre proteinleri çöktürmek. Gece boyunca -20 ° C&#39;de Vortex ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 20 dakika için 20,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek proteini pelet Collect. </li><li> % 80 soğuk aseton ile, metanol ve 2 kez soğuk 0.1M amonyum asetat ile pelet 2 kez yıka. Pelet için 1.5 ml soğuk% 70 etanol ekleyin ve askıya. 20 dakika süre ile, bir 2 mL mikrosantrifüj tüpü (ABD Scientific) ve 14,000 rpm&#39;de santrifüj, 4 ° C transfer. Etanol çıkarın. </li><li> Bir SpeedVac konsantratör yılında pelet kısaca kurulayın ve bir protein extr boşanmakişlem tampon, örneğin ReadyPrep Protein Ekstraksiyon Kit Reaktif 3 (8 M üre,% 4 CHAPS, 40 mM Tris-bazlı, 2 M Thiourea) (Bio-Rad). Bir pelet oluşturmak üzere 30 dakika süreyle 14.000 rpm ve 20 ° C&#39;de santrifüje. Süpernatant toplayın. </li><li> Üreticinin kılavuzu (Geno Teknolojisi) göre CB-X protein metodu kullanılarak protein konsantrasyonu ölçün. </li></ol> 4. CysTMTs ile Numune Hazırlama ve Peptid Etiketleme <ol><li> 2-5 mg / ml arasında derişimde protein numunesinin hazırlanması. Burada, her kitle etiketi için 20 ul-50 uL örneklerinin protein 100 mg kullanın. Bu deneme için tüm 6 etiketler kullanılmıştır. </li><li> Serbest tiyol grubu engellemek için protein örnek alkilasyon tampon eşit hacimde (100 mM Tris-HCI, pH7.5, 200 mM iyodoasetamid) eklenir. Tampon taze olarak hazırlanması gerekir. Alkilasyon 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de gerçekleştirilir. </li><li> Gece boyunca -20 ° C&#39;da soğuk% 80 aseton 1 ml ilave edilerek proteini çöktürmek. 14.000 santrifüj Pelet proteinrpm, 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle. Her vorteks% 80 aseton ile pelet 3 kez yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde kuru iken yayınlamaya izin verir. </li><li> 50 uL lizis tamponu (6 M üre, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA) içinde pelletini. 100 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) 0,5 uL daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca kuluçkaya disülfid bağları azaltmak için eklenir. </li><li> Etiketleri çözünürleştirmek için reaktif tüplerinin asetonitril 20 uL ekleyerek etiketler hazırlayın. Vortex ve dibine kadar dönerler. </li><li> Bir Microcon 3KD santrifüj filtre cihazı (Millipore) kullanılarak ekstra TCEP yıkayın. Microcon 3KD sütuna 50 uL örnek ekleyin ve sütun 50 uL lizis tamponu. 10,000 xg, 4 ° C&#39;de 15 dakika süre ile santrifüje Üç kez toplam için bu adımı yineleyin. Sütun çıkarın ve temiz bir tüpe ters çevirin. 1.000 xg ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin </li><li> PH kontrol edin. Gerekirse, 1 M HCl ile 7,0-8,0 pH üzere ayarlanır. </li><li> CysTM 5 uL eklemeHer numune (cysTMT reaktif kiti 500 mikrogram protein için 20 uL etiketleri sağlar. Bu yöntemi biz etiketi beşte birini kullanabilirsiniz bu nedenle, 100 mg protein kullanır.) T reaktifi. Oda sıcaklığında 2 saat için ilerlemeye reaksiyon izin verir. </li><li> Numuneler, bir 1:1 oranında Laemmli numune tamponu (Bio-Rad) ile kombine edilmiştir. </li></ol> 5.. Sigara tepki Tag Örnek Fraksiyonu Uzaklaştırılması <ol><li> Numuneler 5 dakika kaynatıldı ve bir ön-dökme 12% poliakrilamid jel (Bio-Rad) üzerine ayrıldı. Jel süzüldü H2O ile 5 dakikalık aralıklarla üç kez yıkanır ve 1 saat için Coomassie Mavisi (Bio-Rad) ile boyanmıştır. Jel H 2 O ile birlikte bir gece de lekeli oldu </li><li> Oniki kesirler her jel şeridi toplanmıştır. Kesirler, protein grubu konsantrasyonları tayin edildi. Fraksiyonlar 1mm parçalar halinde kıyılmış ve 1.5 mL tüp içine toplanmıştır. </li><li> Jel adet 2 H,% 50 asetonitril ve 0.1 M amonyum bikarbonat ile de-lekeli idi </alt&gt; O. Mavi renk jel parçaları (~ 3-4 kez, 15 dakika her zaman) kaldırılıncaya kadar bu adımı tekrar edilmelidir. </li><li> De-lekeli jel adet 15 süpernatan kaldırılır dak, ve bir SpeedVac kullanılarak kurutulur parçaları için,% 100 asetonitril (jel parçaları kapsar) kullanılarak kurutulmuştur. </li><li> 25 mM amonyum bikarbonat aynı hacimde (as toplanmış etiketli örnek) oran: 1:10 tripsin (Promega) (protein tripsin) eritin. Örneğin, 500 ul&#39;lik bir hacimde 600 ug protein Örnek 25 mM amonyum bikarbonat, 500 uL içinde çözülmüş 60 mg tripsin ihtiyacı vardır. </li><li> Jel parçalara tripsin çözüm ekleyin ve rehidratasyonu için buz üzerinde ayarlayın. Adet kapalı değilse 50 mM amonyum bikarbonat tampon ekleyin. Rehidrasyon sonra, 12-16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> İnkübe örneklerden sıvı protein ekstresi çıkarın. </li><li> Reaksiyon durdur ve% 5 formik asit,% 50 asetonitril ile jel parçaları kaplayarak kalan herhangi bir protein özeti kaldırmak .. Oda te de 20 dakika boyunca sallayın jel parçamperature. 5.7 ayıklanan protein örnek tüpleri süpernatant aktarın. Iki kez çıkarma işlemi tekrarlayın. SpeedVac kullanarak ayıklanan peptidler kurulayın. </li></ol> 6. CysTMT Etiketli-peptidlerin Numune Zenginleştirme <ol><li> Bir 50% bulamaç için 0.5 mL tüplere anti-TMT reçine bir gradyan ekleyin. (Gradient fraksiyonlama jel bant konsantrasyonu belirlendi. Bir fraksiyon toplama karanlık bir grup oluşur, daha fazla reçine gereklidir. Az protein olduğu gibi zayıf bantları Kesirleri az reçine gerektirir.) </li><li> Reçine daha sonra 1 x biri sütun hacmi ile üç kez yıkanır Tris tamponlu tuz (TBS) (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2) (Termo Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Her numune için 200 ul 1xTBS ekleyin. Numuneler daha sonra, anti-TMT reçinesi (Termo Scientific Pierce Protein Research Products) ilave edildi ve 4 ° C de bir gece boyunca sallanan ardından 2 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanır </li><li> Sütun (için örnek ekleRMO Bilimsel Pierce Protein Araştırma Ürünleri). </li><li> 1x 200 ul TBS ile her sütunun üç kez yıkayın. Bu, daha sonra% 0.05 CHAPS (1x TBS içinde çözülmüş) ile üç kez yıkama ile takip eder. </li><li> Sütun sonra TBS 1x 4 M üre ile üç kez yıkanır. H2O iki yüz mikrolitre sonra sütun üç kez yıkamak için kullanılır. </li><li> Her bir numune, 200 uL% 50 elüsyon tamponuyla (% 50 asetonitril,% 0,4 TFA) ile üç kez yıkandı edilir. </li><li> Numuneler daha sonra, bir yoğunlaştırıcı vakum içinde kurutulur. </li></ol> 7. Kütle Spektrometresi Analizi <ol><li> % 0.1 formik asit ile% 3 asetonitril 12 uL içinde tekrar süspansiyon örnekleri ve bir Eksigent NanoLC-1B, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, kolon (AB Sciex, USA) üzerine direkt olarak enjekte 5 ul. </li><li> Peptitler bir Proteopep II C18 kolonu 75 mikron kimliği ayrılacak bir 4-60% eğim (A kullanarak x 20 cm (Yeni Amaç, ABD):% 3 asetonitril,% 0.1 formik asit, B:% 97 asetonitril,% 0.1 formik asit)3 azından uL / ​​60 dakika zarfında dak. </li><li> Bir Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL kütle spektrometresi tek aşamalı MS oluşan x 3 deney 3 MS tarafından takip yüksek enerji C-trap dissosiyasyon (HCD) parçalanması ile MS / MS spektrumları 3 edinimi ardından bir üst 2 ile peptitler algılamak için kullanılan Protein tespiti için çarpışma kaynaklı dissosiyasyon (CID) ile / MS. Bu modda parametreleri: İzolasyon genişliği: 3,0 m / z; Çarpışma enerji:% 50 (iki aşamalı olarak% 10). Sadece iki kat-ı üç kat ücret ve peptidler parçalanması için seçildi. Dinamik dışlama parametreler belirlendi: = 1 saymak tekrarlayın; Tekrar Süre = 60; Bırakma listesi size = 500; Dışlama süresi = 28. Aşağıdaki gibi hedef değer vardır: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. İyon transferi kez MS / MS (HCD) için FTMS ve 300 için 500 ile belirlenmiştir. İki microscans HCD spektrumları için gerekli edildi. </li></ol> 8. Veritabanı Arama ve Miktar <ol><li> Kazanılmış CID ve HCD veriler vardıoranını ölçmek için bir Reporter Ion Quantizer (fragman iyonların 20 ppm kütle toleransı) uygulanan bir dallı iş akışı aracılığıyla Thermo Scientific Proteom Discoverer yazılımı 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri) kullanarak nalyzed. Ayrı bir bölüm Spectrum Seçici, Spektrum Normalizer ve Spektrum Orfoz düğümleri arasında MS 2. spektrumları işlenmiş. </li><li> Veriler daha sonra SEQUEST arama motoru karşı arandı. A 20 ppm kitle hoşgörü kullanılmıştır. Statik değişiklikler cysTMT reaktifi olarak (304,18 Da) ve dinamik değişiklikler fosforilasyon ve metionin oksidasyon (15.99 Da) dahil edildi. Solanum lycopersicum için özel bir veritabanı RNA veri (Harvard Üniversitesi&#39;nde yaklaşık 350.000 girdileri ile) 13 her iki durumda da kullanılan kullanarak bestelendi. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Bir kontrol domates bitkisi yaprak ve Pseudomonas inoküle yaprak temsilcisi görüntüŞekil 1&#39;de gösterilmiştir. Uygulanan kontrol ve Pseudomonas tedavi yaprakları arasında bir farklılık gözlenmiştir. Yapraklar çıkarılır ve de-boyama işlemi yaprak dokusunda ROS belirtileri (Şekil 2) göstermek için histokimyasal sağlar. DAB, kullanılarak boyandı sonra Şekil 2A boyanma bir kontrol yaprak temsilcisidir. Şekil 2B temsilcisi H 2 O 2 üretimi için Pseudomonas ve boyanma ile tedavi edilen bir yaprak. Bir redoks farklı şekilde düzenlenmiş protein Proteome Discover verilerin çıkış için bir örnek Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu protein bilinen bir redoks düzenlenmiş protein ferrodoksin-1 14 ve Pseudomonas syringae pv domates 15 karşı savunmada rol oynadığı gösterilmiştir. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk ferredox önemli değişiklikler gösterdi Göreceli ölçüm, elde etmek için kullanılırin-1 redoks regülasyonu (p &lt;0.05). Yüksek yoğunluklu zirveleri bu proteinin patojen tedaviye yanıt olarak okside olduğunu göstermiştir. Şekil 4, bir kontrol ve aşılanmış örnek arasındaki bir proteinin benzer redoks düzenlemesi olan bir proteini Proteome Discover veri çıkışı bir örnektir. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir. Yöntem bilim adamları redoks duyarlı sistein ve disülfitler 10 algılamak nasıl devrim olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Şekil 1. Inoküle domates temsili bir görüntü kontrol çözeltisi (A) ve Pseudomonas (B) ile ayrılır. &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Şekil 2. Aşılanmış domates DAB boyama temsilcisi görüntü kontrolü çözümü (A) ve Pseudomonas (B) bırakır. Yapraklar 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin kullanılarak boyanmıştır. Klorofil% 95 etanol içinde kaynatılarak yapraklar çıkarıldı. Koyu boyama H 2 O 2 varlığını gösterir. Sadece bakteri kültürü koyu boyanma gösterdi inokule bırakır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Şekil 3. Ferrodoksin-1 Proteome Discover veri çıkışı, farklı şekilde düzenlenmiş redoks proteini 14 bir örneği. Her bir tepe Yukarıda tepe yoğunluğu mutlak nicelendirilmek üzere kullanılır. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk kullanılırGöreceli ölçüm gerçekleştirmek için. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir kontrol ve inoküle örnek arasındaki benzer tepe yoğunluğu olan bir proteinin Proteom Discover veri çıkışı bir örnek. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir.

<ol><li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li>
<li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li>
<li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells%3A+role+in+defense+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li>
<li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li>
<li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+redux%3A+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li>
<li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li>
<li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+metabolism%2C+oxidative+stress%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li>
<li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS%2FMS+using+6-+plex+isobaric+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li>
<li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li>
<li>A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation. Rosenblatt, M. The 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry, , Thermo Fisher Scientific. TP169(2010).</li>
<li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants%3A+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li>
<li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-Coded+affinity+tag+%28ICAT%29+approach+to+redox+proteomics%3A+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li>
<li>DFCI - Tomato Gene Index. , Harvard University: Computational Biology and Functional Genomics Laboratory. Boston, MA. Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=tomato">http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=tomato</a> (2010).</li>
<li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li>
<li>Huang, H. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li>
<li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li>
<li>Cysteine-Reactive Tandem Mass Tag®(cysTMT®) Reagents. , Thermo Scientific Pierce Biotechnolgy. Rockford, IL. Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.piercenet.com/instructions/2162220.pdf">http://www.piercenet.com/instructions/2162220.pdf</a> (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol DAB boyama yapılması hakkında bilgilerin yanı sıra cysTMT etiketli redoks sistein miktar sağlar. Bu prosedürler ROS üretiminin yanı sıra Solanum lycopersicum Pseudomonas syringae ile inokule edilir protein yönetmelik üzerindeki etkisini incelerken yararlıdır. Bu protokol sunulan yöntemler yaprak dokusu hasarı en az neden olan bir şekilde bütün yaprak örneklerinde ROS incelemek için bir yol sağlar. Etiketleme prosedürü bir sistein etiketleme yöntemi kullanarak potansiyel redoks düzenlenir proteinler incelemek için bir yol sağlar. Stres yanıtı erken bir aşamada incelerken bu faydalıdır. Böyle izotop kodlanmış afinite etiket (ICAT) ve cysTMT gibi yöntemlerle biyolojik örneklerde redoks potansiyeli regüle proteinleri inceleyerek kullanılabilir. ICAT etiketleme ve iki örnek 12 karşılaştırılmasına olanak sağlar. Her iki yöntem de serbest sisteinlerin ve etiketlemek quantific protein için kullanılabilirleration 10,12. Bununla birlikte, cysTMT yöntem, bir deney varyasyonu azalma yanı sıra 10 multiplekslemesi sağlar. Kullanılabilir etiketlerin sayısı araştırmacıların deney tasarımı çoğaltır veya birden fazla numune eklemenize olanak verir. Daha örnekleri sahip tespit proteinleri ile daha fazla sayıda potansiyel sağlar. CysTMT tekniğin büyük bir dezavantajı çünkü cysTMT etiketli-peptidler (6,5-6,6) için selektif zenginleştirme basamakları proteinin tanımlanması genel kalitesini düşürüyor olmasıdır. Protein tanımlanması için peptidlerin numarası protein dizisi içinde sistein kalıntıların sayıda büyük ölçüde değişir. Bu sorun, kütle spektrometresi proteinin tanımlanması için zenginleştirme önce triptik örnek parçası göndererek aşılabilir. Deney tasarımı gibi cysTMT yöntemi kullanan bir etiketleme mekanizmasının yapısı nedeniyle, belli bir adım kritik önem taşır. Protein preci gerçekleştirirkenpitation ve pelet yıkamalar (3.9) protein yıkımı azaltmak için buz üzerinde soğutulmuş örnekleri tutmak için önemlidir. Örnekleri ters etiketlenmesi tabi olabilir, çünkü cysTMT etiketleme sırasında, indirgeyici tepkin madde (4,6) çıkarılması önemlidir. Reaktif azaltılması örnek kalırsa ters etiketleme mümkündür. Örnekleri işaretlendikten sonra azaltılmış ise, cysTMT etiketi kaldırılabilir. Etiket örnekleri eklenir sonra, pH seviyesini optimum etiketleme verim için (4.7) kontrol edilmelidir. Buna ek olarak, veri analizi araştırmacı protokolü kullanılarak içinde nihai hedefi gerekenden bağlıdır. Ayrıca her yazılım farklı algoritmalar var olarak kullanılan yazılım bağlıdır. Bu deney, domates reaktif türün oksidatif üretimi için geliştirilmiş bir elisitör olarak patojen kullanan, ancak, başka bir redoks düzenlenmiş yanıtları buna göre ölçülebilir. Bu deney tasarımı diğer bitki ve hayvan sistemlerinde uygulanabilir. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI Şirketler </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep Sıralı Ekstraksiyon kiti Reaktif 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X protein tayini </td><td> Geno Teknoloji </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reaktifler </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli Örnek Tampon </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Biyo-Güvenli Comassie (G-250 leke) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD sütun </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> İmmobilize Anti-TMT reçine </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Santrifüj sütun </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 kolon </td><td> Yeni Hedef </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteom Discoverer 1.2 yazılımı </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge Santrifüj Tüpü </td><td> Thermo Scientific Nalgene Şirketi </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge tüp (2 ml) </td><td> ABD Bilimsel </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> % 12 Mini-Protean TGX Prefabrik Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Form Başı Formu&gt; Bio-Güvenli Coomassie StainBottom </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT zenginleştirme kiti </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

İzotop etiketleme kütle spektrometresi kullanarak tiyol redoks proteom profil

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Domates suşu DC3000 Arabidopsis thaliana, genetik olarak çözülebilir bir ev sahibi bitki üzerindeki 1,2 Solanum lycopersicum değil, aynı zamanda Brassica türleri üzerinde bakteriyel leke hastalığa neden olmaktadır, yanı sıra, sadece. DC3000 ile aşılanmış kotiledonlarında reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikimi 3 domates bakteriyel benek hastalığı sırasında modüle nekrotik hücre ölümü ROS bir rolü olduğunu gösterir. Hidrojen peroksit, ROS bir bileşeni, Pseudomonas 3 olan domates bitkilerinde inokulasyonunun sonra elde edilir. Hidrojen peroksit, bir histokimyasal 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin (DAB) 4 kullanılarak tespit edilebilir. DAB boyama yaprak lekesi 4 kahverengi bir üretmek için hidrojen peroksit ile reaksiyona girer. ROS 5 bazı proteinlerin redoks durumunu değiştirebilirsiniz hücresel redoks çevre, bir düzenleyici rolü vardır. Sistein duyarlı önemli bir amino asitredoks değişir. Hafif oksidasyon altında, sistein sülfhidril grupları ile tersine çevrilebilir oksidasyon fizyolojik süreçlerin 6,7 çeşitli regüle redoks sensörler ve sinyal dönüştürücüler olarak hizmet eder. Tandem kütle etiketi (TMT) reaktifler eşzamanlı tanımlanmasını mümkün kılacak ve tandem kütle spektrometresi 8,9 kullanarak farklı örneklerdeki proteinlerin kantitatif çoğaltılmış. Sistein-reaktif TMT (cysTMT) reaktifler seçici etiketleme ve relatif sistein içeren altı biyolojik örnekler kadar, peptidleri sağlar. Her izobarik cysTMT etiketi aynı nominal üst kütleye sahiptir ve bir sülfhidril-reaktif grup, a-MS nötr ayırıcı kolu ve MS / MS reporter 10 oluşmaktadır. Etiketleme sonra, örnekler proteaz sindirime tabi tutuldu. Sistein-etiketli anti-peptidler TMT antikoru içeren bir reçine ile zenginleştirilmiş edildi. MS / MS analizi sırasında, muhabir iyonları bir dizi (yani, 126-131 Da) relatif hakkında bilgi veren, düşük kütleli bölgede ortaya çıkmaktadır.Iş akışı, örnek karmaşıklığı azaltarak dinamik aralık geliştirme ve sistein değişiklikleri incelemek için etkilidir. Burada Pst DC3000 tedavi domates redoks proteomik analizi sunmak (Rio Grande) cysTMT teknolojisini kullanarak bırakır. Bu yüksek verim yöntemi diğer redoks-düzenleyici fizyolojik süreçleri inceleyerek uygulanacak potansiyeline sahiptir.

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi göstermek<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Domates yaprakları tedavi.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 suşu, sadece Solanum lycopersicum'da bakteriyel benek hastalığına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda Brassica türlerinde ve ... üzerinde de hastalığa yol açar.

Bu deneyin genel amacı, pseudomona siro PV tomato'nun domates bitkilerindeki redoks düzenlemeli proteinler üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. Öncelikle, patojen enfeksiyonunu ve protein yanıtını tetiklemek için domates bitkileri pseudomona siro PV PV tomato ile inoküle edin. Reaktif oksijen türlerindeki değişimleri gözlemlemek için DIAM benzin ile boyama işlemine geçin.Ardından, proteinlerdeki redoks regüleli sisteinleri incelemek için sist TMT etiketlemesi gerçekleştirin. Elde edilen sonuçlar, işlem görmüş ve kontrol örnekleri arasındaki değişimleri ölçebilir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi Biyoloji Bölümü ve Proteomik Tesisi'nden Chen.CTMT etiketleme yöntemimizin, ASCA olarak da bilinen izotop kaplı fin etiket gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, geniş ölçekte redoks duyarlı proteinleri analiz ederken aynı anda birden fazla örneğin analiz edilebilme (multipleksleme) yeteneğidir. Bu çalışma, patojen enfeksiyonuna yanıt olarak domatesin redoks düzenlemeli proteinleri hakkında içgörü sağlayacak olsa da; deney, meyve sinekleri, fareler ve diğer bitkiler gibi diğer sistemlere ve stres koşullarının kontrolüne de uygulanabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak, yalnızca iki etiketin mevcut olması nedeniyle ICAD deneyleri arasında belirgin varyasyonlar gözlemledikten sonra ortaya çıkmıştır.Etiketleme ve zenginleştirme basamaklarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin VIR gösterimi kritik öneme sahiptir. Etiketli numuneler arasındaki deneysel varyasyonlar minimize edilmeli ve etkili etiketleme sağlamak için çıkarılan bölgeler azaltılmalıdır. Hadi başlayalım. İnokülüm kültürü için dört inç çapındaki saksılarda benzer boyutta iki adet transplant edilmiş domates fidesi yetiştirin.KBM plakası üzerinde Pseudomonas syringae çimlenmesi. Bakterileri 20 mililitre suya sıyırın ve mililitrede yaklaşık 10⁶ koloni oluşturan birim değerinde bir bakteri inokülumu hazırlayın. Bir litre inokülasyon tamponu içerisinde, dört haftalık bitkileri 30 saniye boyunca bakteriyel inokülasyon çözeltisine daldırın.Ardından hemen şeffaf plastik torbalarla kapatın. Tercih edilen inokülasyon süresinden sonra, tamamen genişlemiş yaprağı hasat edin ve epiderm tabakası yukarı gelecek şekilde 1 mg/mL DAB boyasına yerleştirip 15 dakika boyunca vakum infiltrasyonuna tabi tutun. Daha sonra yaprakları oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca inkübe edin.Şimdi, boyanmış yaprakları 10 dakika boyunca %95 etanolde kaynatın ve bir havan yardımıyla öğüterek %75 etanolda saklayın. Hasat edilen yaprakları sıvı azot içerisinde ince bir toz haline getirin. Ardından, beraberindeki metinde açıklandığı şekilde fenol ekstraksiyonlarını gerçekleştirin.Ardından, fenol ile ekstrakte edilen proteinleri, %100 metanol içinde beş hacim soğuk 0,1 molar amonyum asetat ile çöktürün. Proteinleri santrifüjle toplayın ve pelet yıkamalarını gerçekleştirin. Daha sonra örnekleri 1,5 mililitre soğuk, %70 etanol içinde yeniden süspande edin ve iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Santrifüjden sonra, etanol süpernatantını dökün ve pelletini bir speed vac cihazında kısa süreliğine kurutun. Santrifüjle bir pellet oluşturduktan sonra örnekleri denatüre eden bir protein ekstraksiyon tamponunda çözün, süpernatantı toplayın ve üretici kılavuzuna göre protein konsantrasyonunu ölçün. Altı kütle etiketi (mass tag) için, serbest tiyol gruplarını bloke etmek amacıyla, eşit hacimdeki taze hazırlanmış 200 millimolar IO asetamid alkilasyon tamponu ile birlikte her bir protein örneğinden 100 micrograms ile başlayın ve 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, proteinleri çöktürmek için bir milliliter soğuk %80 aseton ekleyin ve gece boyunca minus 20 degrees Celsius'de bekletin.Proteini santrifüjle çöktürün ve %80 asetona ile üç kez yıkayın. Numuneleri buz üzerinde hava ile kuruttuktan sonra, çökeleği 50 microliter liziz tamponunda tekrar süspande edin. Ardından, disülfür bağlarını azaltmak için 0.5 microliter 100 millimolar TCEP ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Reaktif tüplerine 20 µL asetonitril ekleyerek etiketleri çözünür hale getirin. Vorteksleyin ve çöktürmek için santrifüjleyin. Fazla TCEP'yi uzaklaştırmak için, bir MicroCon 3 KD kolonuna 50 µL örnek yükleyin. 50 µL lizis tamponu ekleyin ve 4 °C'de, 10.000 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Numuneyi toplamak için kolonu çıkarıp temiz bir tüpün içine ters çevirin ve santrifüjleyin. Gerekiyorsa numunenin pH değerini kontrol edin. Bir molar hidroklorik asit ile pH değerini yedi ile sekiz arasına ayarlayın.Kist TMT reaktifinden beş mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin, örnekleri birleştirin ve eşit hacimde laly örnek tamponu ekleyip beş dakika kaynatın ve önceden dökülmüş %12'lik poliakrilamid jelde ayırın; jeli filtrelenmiş suyla üç kez duruladıktan sonra bir saat boyunca Coomassie blue ile boyayın ve protein bant konsantrasyonlarına göre suda gece boyunca duyarsızlaştırın. Her jel şeridini 12 fraksiyona ayırın. Her fraksiyonu bir milimetrelik parçalara bölün ve 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin.Jel parçalarını %50 asetonitril içeren 0,1 molar amonyum bikarbonat içerisinde tamamen bekletin. Ardından parçaları 15 dakika boyunca %100 asetonitril ile kaplayın. Sıvıyı uzaklaştırın ve parçaları speed vac kullanarak kurutun.Ardından, eşit hacimde tripsin çözeltisi ekleyin ve rehidratasyon için buza yerleştirin. Daha sonra, tripsin sindirimi için 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, inkübe edilen örneklerden sıvı protein ekstraktını uzaklaştırın.Jel parçalarını %5 formik asit ve %50 asetonitril ile kaplayarak reaksiyonu durdurun ve kalan protein sindirimini uzaklaştırın. Ardından jel parçalarını oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sallayın. İki ekstraksiyon daha yaptıktan sonra süpernatanı ekstrakte edilen protein örnek tüplerine aktarın.Numuneleri 0,5 mililitrelik tüpler içinde vakumlu santrifüjle (speed vac) kurutun. İlgili protein bandının yoğunluğuyla orantılı bir konsantrasyonda, TBS içinde %50'lik anti-TMT reçine süspansiyonu hazırlayın. Reçineyi, bir kolon hacmi kadar bir kat TBS ile üç kez yıkayın, ardından her bir numuneye 200 mikrolitre TBS ekleyin.Ardından anti-TMT reçinesine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca ajite edin, ardından dört santigrat derece sıcaklıkta gece boyunca sallayarak inkübe edin. Her bir örneği bir kolona yükleyin. Her biri 200 µL olan kolon yıkamalarını gerçekleştirin.Ardından, her örneği üç kez 200 µL %50 elüsyon tamponu ile elüe edin ve vakum altında kurutun. Örnekleri 0,1% formik asit içeren 12 µL %3 asetonitril içinde süspanse edin ve beş µL'sini doğrudan bir HPLC kolonuna enjekte edin. Peptitleri, ekteki metinde ayrıntıları verilen artan asetonitril gradyanı kullanarak elüe edin.İki çarpı üç iş akışında peptidleri tespit etmek için kütle spektrometrisi kullanın. Tek aşamalı ms ile başlayın. Ardından, üç adet yüksek enerjili C-tuzağı ayrışma fragmantasyonu ile takip edilen üç Ms.Ms spektrumu edinin.Protein tanımlama için çarpışma ile indüklenmiş ayrışmalı Ms.MS. Kütle spektrometri verilerini dallanmış bir iş akışı kullanarak analiz edin. Oranı nicelleştirmek için bir raporlayıcı demir nicelleştirici uygulayın.Ayrıca, MSM MS spektrumunu spektrum seçici, spektrum normalleştirici ve spektrum gruplayıcı düğümler aracılığıyla işleyin ve verileri seaquest arama motoruna karşı sorgulayın. Bu görüntü, yapraklar DAB kullanılarak boyandıktan sonra sol tarafta kontrol grubu bir domates bitkisi yaprağına ve sağ tarafta pseudomonas inoküle edilmiş bir yaprağa örnekler göstermektedir. DES boyama işlemi, histokimyasal boyamanın yaprak dokusundaki reaktif oksijen türleri belirtilerini göstermesine olanak tanır.Beklendiği üzere, kontrol grubu herhangi bir belirgin boyanma göstermezken, Pseudomonas ile işlem görmüş yapraklar hidrojen peroksit üretimi için pozitif boyanma göstermektedir. Bu örnek, proteom keşif veri çıktısını göstermektedir; her numune için diferansiyel redoks regülasyonuna uğramış bir proteinin pik alanı, mutlak kantifikasyona olanak tanır. Kontrol ve inoküle edilmiş numuneler arasındaki pik alanı, bağıl miktarları belirtir.Burada, bir kontrol ve inoküle edilmiş örnek arasındaki bir proteinin redoks düzenlemesi benzerdir. Benzer yoğunluktaki pikler, işlem değişikliği ile düzenlenmeyen disülfit bağlarının varlığına işaret eder. Bu teknik bir kez kavrandığında, bir hafta içinde uygun şekilde uygulanabilir.Numunelerin soğuk tutulmasını ve etiketlerin düzenli olmasını unutmayın. Ayrıca, bu prosedürü takip ederek çeker ocakta çalışmak ve uygun eldivenler kullanmak gibi fenol kullanımı sırasında önlemler alın.Bu videoyu izledikten sonra, DIB standing CTMD etkinleştirme ve redox 16 kalifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

profiling-thiol-redox-proteome-using-isotope-tagging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Aşağıdaki adımların her biri için ayrıntılı bilgi içeren optimize edilmiş bir tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme protokolü salıyoruz: protein ekstraksiyonu, nicelikselleştirme, yağış, sindirim, etiketleme, proteomik bir tesise teslim ve veri analizleri.

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Öğrenin, CysTMT etiketleme ve kütle spektrometresi kullanarak domateste Pseudomonas syringae'nin redoks düzenlenmiş proteinler üzerindeki etkilerini nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem, bitki stres yanıtlarını anlamak için sağlam bir proteomik yaklaşım sunar.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Daha fazla video keşfet