İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Bu deneyin genel amacı, pseudomona siro PV domatesinin domates bitkilerindeki redoks düzenlemeli proteinler üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. İlk olarak, patojen enfeksiyonunu ve protein yanıtını tetiklemek için domates bitkileri pseudomona siro PV domatesi ile inoküle edilir. Reaktif oksijen türlerindeki değişiklikleri gözlemlemek için DIAM benzine ile boyama işlemine geçilir.

Ardından, proteinlerde redoks tarafından düzenlenen sisteinleri incelemek için sist TMT etiketlemesi gerçekleştirin. Elde edilen sonuçlar, işlem görmüş ve kontrol örnekleri arasındaki değişimleri ölçebilir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi biyoloji bölümü ve proteomik tesisi'nden Chen.

CTMT etiketlememizin, ASCA olarak da bilinen izotop kaplı fin etiketi gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, geniş ölçekte redoks duyarlı proteinleri analiz ederken aynı anda birden fazla örneği analiz edebilme (multiplexing) yeteneğidir. Bu çalışma, patojen enfeksiyonuna yanıt olarak domatesin redoks düzenlemeli proteinleri hakkında bilgiler sağlayacak olsa da, deney; joof, fareler, diğer bitkiler ve stresli koşulların kontrolü gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, yalnızca iki etiketin mevcut olması nedeniyle ICAD deneyleri arasında belirgin varyasyonlar gözlemledikten sonra geliştirdik.

Etiketleme ve zenginleştirme adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin VIR gösterimi kritiktir. Verimli etiketleme sağlamak için etiketlenmiş örnekler arasındaki deneysel varyasyonlar minimize edilmeli ve çıkarılan bölgeler azaltılmalıdır. Hadi başlayalım. İnokulum kültürü için dört inç çapındaki saksılarda benzer büyüklükte iki transplant domates fidesi yetiştirin.

Bir KBM plakası üzerinde pseudomona singe kolonisi. Bakterileri 20 mililitre suyun içine sıyırın ve mililitre başına yaklaşık 10⁶ koloni oluşturan birim konsantrasyonunda bir bakteri inokülumu hazırlayın. Bir litre inokülasyon tamponu içinde, dört haftalık bitkileri bakteri inokülasyon çözeltisine 30 saniye boyunca daldırın.

Ardından hemen şeffaf plastik torbalarla örtün. Tercih edilen inokülasyon süresinin ardından, tam genişlemiş yaprağı hasat edin, epidermal yüzeyi yukarı gelecek şekilde 1 mg/mL DAB boyasına yerleştirin ve 15 dakika boyunca vakumlu infiltrasyona tabi tutun. Sonrasında yaprakları oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca inkübe edin.

Şimdi, boyanmış yaprakları 10 dakika boyunca %95 etanolde kaynatın ve %75 etanol kullanarak saklayın; havan yardımıyla öğütün. Hasat edilen yaprakları sıvı nitrojen içinde ince bir toz haline getirin. Ardından, ekteki metinde açıklandığı şekilde fenol ekstraksiyonlarını gerçekleştirin.

Ardından, fenol ile ekstrakt edilen proteinleri, %100 metanol içinde beş hacim soğuk 0.1 molar amonyum asetat ile çöktürün. Proteinleri santrifüj ile toplayın ve pelet yıkamalarını gerçekleştirin. Daha sonra numuneleri 1,5 mililitre soğuk, %70 etanol içinde yeniden süspande edin ve iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüjden sonra, etanol süpernatantını atın ve peleti bir speed vac cihazında kısa süre kurutun. Pelet oluşturmak için santrifüj yaptıktan sonra örnekleri denatüre edici bir protein ekstraksiyon tamponunda çözün, süpernatantı toplayın ve protein konsantrasyonunu üretici kılavuzuna göre ölçün. Altı kütle etiketi için, serbest tiyol gruplarını bloke etmek amacıyla her bir protein örneğinin 100 mikrogramı ile eşit hacimde taze hazırlanmış 200 milimolar IO asetamid alkilasyon tamponu kullanarak işleme başlayın ve 37 derece Celsius'ta bir saat inkübe edin. Ardından proteinleri çöktürmek için bir mililitre soğuk %80 aseton ekleyin ve gece boyunca eksi 20 derece Celsius'ta bekletin.

Proteini santrifüj ile çöktürün ve %80 asetone ile üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin. Numuneleri buz üzerinde hava ile kuruttuktan sonra, pelletini 50 µL lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, disülfit bağlarını indirgemek için 0,5 µL 100 mM TCEP ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Reaktif tüplerine 20 µL asetonitril ekleyerek etiketleri çözünür hale getirin. Vorteksleyiniz ve çöktürünüz. Fazla TCEP'i uzaklaştırmak için, bir MicroCon 3 KD kolonuna 50 µL örnek yükleyin. 50 µL lizis tamponu ekleyin ve 10.000 ×g'de, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Numuneyi toplamak için kolonu çıkarın, temiz bir tüpe ters çevirin ve santrifüjleyin. Gerektiğinde numunenin pH değerini kontrol edin. Bir molar hidroklorik asit ile pH değerini yedi ve sekiz arasında ayarlayın.

Kist TMT reaktifinden beş mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin, örnekleri birleştirin ve eşit hacimde laly örnek tamponu ekleyip beş dakika kaynatın ve önceden dökülmüş %12'lik poliakrilamid jelde ayırın; jeli filtrelenmiş su ile üç kez duruladıktan sonra bir saat boyunca kumasi blue ile boyayın ve protein bant konsantrasyonlarına göre su içinde gece boyunca bekletin. Jel şeridini 12 fraksiyona bölün. Her fraksiyonu bir milimetrelik parçalar halinde kesin ve 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin.

Jel parçalarını %50 asetonitril içeren 0,1 molar amonyum bikarbonat ile tamamen yıkayın. Ardından parçaları 15 dakika boyunca %100 asetonitril ile kaplayın. Sıvıyı uzaklaştırın ve parçaları speed vac kullanarak kurutun.

Ardından, eşit hacimde tripsin çözeltisi ekleyin ve rehidrasyon için buz üzerinde bekletin. Daha sonra, tripsin sindirimi için 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, inkübe edilen örneklerden sıvı protein ekstraktını uzaklaştırın.

Reaksiyonu durdurun ve jel parçalarını %5 formic acid, %50 aceto nitrile ile kapatarak kalan protein sindirimlerini uzaklaştırın. Ardından jel parçalarını oda sıcaklığında 20 dakika boyunca çalkalayın. İki ekstraksiyon daha yaptıktan sonra süpernatantı ekstre edilmiş protein numune tüplerine aktarın.

Numuneleri 0.5 mililitrelik tüplerde hızla vakumlayarak kurutun. İlgili protein bandının yoğunluğuyla orantılı bir konsantrasyonda, TBS içinde %50'lik anti TMT reçine süspansiyonu hazırlayın. Reçineyi bir kolon hacmi 1x TBS ile üç kez yıkayın, ardından her bir numuneye 200 mikrolitre TBS ekleyin.

Ardından anti-TMT reçinesine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca ajite edin, ardından 4 °C'de gece boyunca sallayarak inkübe edin. Her örneği bir kolona yükleyin. Her biri 200 µL olan kolon yıkama işlemlerini gerçekleştirin.

Ardından her bir örneği, 200 µL %50 elüsyon tamponu ile üç kez elüe edin ve vakum altında kurutun. Örnekleri, 0,1% formik asit içeren %3 asetonitril'in 12 µL'si içerisinde süspande edin ve beş µL'sini doğrudan bir HPLC kolonuna enjekte edin. Peptitleri, ekteki metinde ayrıntıları verildiği üzere, artan asetonitril gradyanı kullanarak elüe edin.

İki çarpı üç iş akışında peptidleri tespit etmek için kütle spektrometrisi kullanın. Tek aşamalı ms ile başlayın. Ardından, yüksek enerjili C tuzaklı ayrışma fragmantasyonunun ardından üç adet Ms.Ms spektrumu edinin.

Protein tanımlama için çarpışma ile indüklenmiş çözünme yöntemiyle Ms.MS. Kütle spektrometrisi verilerini dallanmış bir iş akışı kullanarak analiz edin. Oranı belirlemek için bir raporlayıcı demir nicelik belirleyici uygulayın.

Ayrıca, MSM MS spektrumunu spektrum seçici, spektrum normalleştirici ve spektrum gruplayıcı düğümleri aracılığıyla işleyerek verileri SeaQuest arama motoruna karşı sorgulayın. Bu görüntü, yapraklar DAB ile boyandıktan sonra sol tarafta kontrol grubu bir domates bitkisi yaprağını ve sağ tarafta Pseudomonas inoküle edilmiş bir yaprağı göstermektedir. DES boyama işlemi, histokimyasal boyamanın yaprak dokusundaki reaktif oksijen türleri belirtilerini göstermesine olanak tanır.

Beklendiği üzere kontrol grubu herhangi bir belirgin boyanma göstermezken, pseudomonas ile işlem görmüş yapraklar hidrojen peroksit üretimi için pozitif boyanma göstermektedir. Bu örnek, her bir örnek için diferansiyel redoks düzenlemeli bir proteinin pik alanına dair proteom keşif veri çıktısının mutlak kantifikasyona olanak tanıdığını göstermektedir. Kontrol ve inoküle edilmiş örnekler arasındaki pik alanı, göreceli miktarları belirtir.

Burada, bir kontrol ve inoküle edilmiş örnek arasında bir proteinin redoks düzenlemesi benzerdir. Benzer yoğunluktaki pikler, işlemdeki bir değişiklikle düzenlenmeyen disülfit bağlarının varlığını göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik bir hafta içinde düzgün bir şekilde uygulanabilir.

Numunelerin soğuk tutulması ve etiketlerin düzenli tutulması gerektiğini unutmayın. Ayrıca, bu prosedürü takip ederek çeker ocakta çalışmak ve uygun eldivenler kullanmak gibi fenol kullanımında önlemler alın.

Bu videoyu izledikten sonra, DIB standing CTMD etkinleştirme ve redox 16 kalifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.