Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Bu video, plazma zarındaki bir proteinin aktivitesini manipüle etmek için UV ışığının kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir. Bunu yapmak için, hücreler membrana bağlı FRB proteini ve ilgilenilen FK BP kaynaşmış proteini ile transfekte edilir. Ortama bir fotoğraf kafesli rapamisin türevi eklenir.

Daha sonra canlı hücre görüntüleme sırasında hücrenin belirli bir bölgesine UV ışığı uygulanır. Rapamisin ve biyotin arasındaki bağlayıcı, kimyasal dimerizatör ve yan ürününü serbest bırakarak bölünür, salınan dimerizatör hücrelere yayılır ve FKBP etiketli ilgili protein ile ışınlanmış bölgede plazma zarına bağlı FRB arasında dimerizasyonu indükler. UV radyasyonu olmadan, FKBP ve FRB birleşmez, dolayısıyla hiçbir etki yaratmaz.

Verilerin analizi, fizyolojik etkisine bağlı olarak FKBP kaynaşmış ilgilenilen proteinin yüksek oranda lokalize alımını ortaya koymaktadır. Bu tekniğin farmakoloji ve genetik yaklaşım gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, etki hızı, hedef özgüllüğü ve mekansal çözünürlüğün birleşimidir. Bu tekniğin etkileri, kanser hücrelerinin göçünün bir sonucu olan kanser metastatik tedavisine kadar uzanır.

Bu nedenle, anahtar migrasyon faktörlerinin aktivitesinin manipülasyonu, tedavisi ve tedavisi için ön koşul olan kesin moleküler mekanizmasını ortaya çıkarabilir. Prosedürü göstermek, bir yüksek lisans öğrencisi olan Chris Paul Meyer ve laboratuvarımdan bir teknisyen olan Bob de Rose olacak. Bu protokole, aşağıdakileri steril bir mikro santrifüj tüpünde birleştirerek başlayın: plazmid, DNA, membran bağlı FRB, FLORESAN etiketli FKBP, TIA bir ve deiyonize su, karışıma ve girdaba bir mikrolitre birkaç gen HD ekleyin.

Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, bir cam sekiz kuyu haznesi tarafının her bir oyuğuna 50 mikrolitre poli de lisin ekleyin ve yüzeyi kaplamak için bir dakika inkübe edin, daha sonra çözeltiyi aspire edin ve her bir oyuğun merkezini 50 deiyonize su ile yıkayın. Sonraki tripsin% 80 ila 85 birleşen NIH üç T üç hücrelidir.

Hücreler ayrıldıktan sonra,% 10 FBS içeren 10 mililitre DMEM ekleyin, 375 mikrolitre süspansiyonu 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Döndürmeyi takiben, ortamı dikkatlice aspire edin. % 10 FVS ve Resüs ile 750 mikrolitre DMEM ekleyin.

Birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti askıya alın. Son olarak, hücre süspansiyonunu transfeksiyon çözeltisine ekleyin ve pipet ucunu kullanarak hafifçe karıştırın, odanın her bir oyuğuna 250 mikrolitre hücre transfeksiyon süspansiyonu ekleyin. Kaydırın ve inkübe edin.

15 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece. Kafes rapamisinini sentezlemek için biotin eklentisi. Ayrı bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde steril bir füj tüpünde DMSO'da bir milimolar stok CRB çözeltisi hazırlayarak başlayın, 250 mikrolitre PBS'de bir miligram avadon çözün.

Kafes parçasını rapamisin ile eşlenik hale getirmek için. Birkaç kez ters çevirerek karıştırılmış çözünmüş AVID'ye 0,5 mikrolitre CRB stok çözeltisi ekleyin ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bağlanmamış küçük molekülleri dışlamak ve CRBA'yı saflaştırmak için eşlenik çözeltide CRB AVID'yi elde etmek için, 300 mikrolitre PBS ile bir G 25 boyutlu dışlama kolonunu dengeleyin.

Sütun dengelendikten sonra beş kez tekrarlayın. Kolonun orta yatağına 125 mikrolitre CRBA çözeltisi yükleyin. Daha sonra çözeltiyi 800 G'de iki dakika boyunca döndürün Oda sıcaklığında, hücrelerin transfeksiyonunu takiben akışı 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın.

Serum aç bırakmak için ortamı FBS olmadan DMEM'e değiştirin, hücreler 12 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, ortamı nazikçe aspire edin ve hazırlanan bir mikromolar CRBA çözeltisinden 250 mikrolitre ekleyin. Canlı hücrelerdeki protein dinamiklerini görselleştirmenin ardından, 365 nanometrede UV LED ışığı için optikleri birleştirmek için UV aydınlatmalı bir dönen disk konfokal mikroskop kullanın.

Epi floresan ışığı ile. UV ışığı tarafından uyarılan floresan boyalarla kaplanmış bir cam plaka kullanarak bir aydınlatma noktasının koordinatlarını ve boyutunu tanımlayın. Bu, ışınlanacak alanın ince ayarına izin verir.

100 x objektif ve epi floresan kullanarak hücrelerle birlikte oda slaytını sahneye yerleştirin. Hücreleri odak noktasına getirin ve bir hücre bulun. Görüntüleme için, fizyolojik etkinin arka plan seviyelerini belirledikten sonra hücreleri görüntülemeye başlayın.

Burada, membran fırfırlaması, hücrenin seçilen bir çeyreğinde UV ışığını ışınlar, kafessiz olarak çözülür, böylece orijinal rapamisin DMSO'da ve daha sonra PBS'de 400 nanomolar nihai konsantrasyona kadar ölçülür. Küresel etkileri indüklemek için görüntüleme odasına 100 mikrolitre çözelti ekleyin. RAC'nin lokalize aktivasyonunun lokal fırfır oluşumunu indükleyip indükleyemeyeceğini belirlemek için 20 dakika boyunca her 15 saniyede bir floresan görüntüleri yakalayın.

NIH üç T üç hücre, YFP etiketli RAC aktivatörü FK bp, TIA one ve ankraj edilmiş bir membran olan LDR ile transfekte edildi. Sarı daire ile gösterilen hücrenin kenarındaki FRB lokalize ışınlamayı, 1063 saniyeden başlayarak bir saniye boyunca bir cıva lambası ile küresel aydınlatma izledi. Burada görülebileceği gibi, başlangıçta neredeyse hiç membran fırfırlaması yoktu.

Bununla birlikte, lokalize aydınlatmayı takiben, küresel aydınlatma ve rapamisin ilavesinden sonra uzamsal olarak sınırlı fırfırlanma gözlendi, bu da FK bp TIA one'ın plazma membranına translokasyonuna neden oldu. Hücre, daha önce gözlemlenen yerel fırfır oluşumunun, rafın uzamsal olarak sınırlı aktivasyonundan kaynaklandığını gösteren küresel fırfır oluşumu gösterdi. Kantitatif bir analiz için, hedef hücreler dört kadrana ayrıldı ve bu grafikte görüldüğü gibi lokal ve sonraki global stimülasyon üzerine her kadranda fırfır oluşum sıklığı belirlendi.

Gözlenen hücrelerin hiçbiri CRBA ile uve bir radyasyon veya lokal uve olmadan, toplu ortamda Aden ile veya Aden'siz bir radyasyon olmadan fırfır oluşumu göstermedi. Bununla birlikte, CRBA eklendiğinde ve UV ışınlaması gerçekleştirildiğinde, fırfır oluşumu yaklaşık olarak aynı, sadece birinci kadran ışınlandığında küresel radyasyonlu tüm kadranlarda kabaca %90 oranında görüldü, fırfır oluşumu sıklığı %100 iken, iki ila dört kadranda %30 ve %30 idi. Bu sonuçlar, rapamisinin lokalize açılmasının, tek bir hücrede yüksek oranda lokalize fizyolojik etkileri indüklemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu durumda, raf aktivasyonundan kaynaklanan membran fırfırlaması. Bu videoyu izledikten sonra, küçük g TPA aktivitesinin ışıkla uzamsal zamansal kontrolünün nasıl sağlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu yöntem, plazma zarına yer değiştiren spesifik proteinlere bağlı olan herhangi bir fizyolojik sürece uygulanabilir.

Bu prosedürü denerken, her prosedür için taze çözeltiler, reaktifler ve hücreler hazırlamayı unutmamak önemlidir. UV ışığı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve UV gözlüğü gibi önlemlerin her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.