Name: Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin, küçük GTPaz aktivitesini ışıkla subselüler düzeyde ve saniyeler ölçeğinde uzay-zamansal olarak nasıl kontrol edeceğinizi. Bu yöntem, canlı hücrelerde plazma membranında protein aktivitesini hassas şekilde manipüle etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH araştırma fonu (DK090868 ve TI GM092930) tarafından desteklenmiştir. Kafesli bir rapamisin analog bir patent var.

1. Plazmid DNA transfeksiyon <ol><li> 37.5 ul dH 2 O kadar floresan proteini tagged: plazmid DNA&#39;lar, 0.5 mikrogram membran-gergin FRB (bundan sonra LDR olarak anılacaktır) ve 0.5 mg FKBP-Tiam1 (Rac aktivatör T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1) ekle 1 ul FuGENE HD ekleyin. </li><li> 20 dakika için oda sıcaklığında vorteks ile inkübe. Bu arada, adım 1,3-1,8 geçin. </li><li> 50 ul poli-D-Lizin içeren bir 8-de haznesinin her oyuğa yıkanır. </li><li> DH 2 O her iyi merkezi yıkayın </li><li> % 80-85 konfluent NIH-3T3 hücreleri Trypsinize ve 10 ml kültür ortamı (% 10 FBS DMEM) ye tamamlanır. </li><li> Süspansiyon 375 ul çıkarın ve 3 dakika 1750 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Pelet rahatsız dikkat ederek, medya aspire. </li><li> DMEM w /% 10 FBS ve Pastör pipetiyle 750 ul ekleyin. </li><li> DH 2 O / DNA / FuGENE HD çözümü için hücre süspansiyonu ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 250 ekleHer bir kuyuya hücre / DNA süspansiyonu ul (3 kuyu kadar dolduracaktır). </li><li> 37 Transfekte hücreler inkübe ° C ve 15-18 saat boyunca% 5 CO2. </li></ol> 2. KİB-Bir Çözüm hazırlanması <ol><li> Sentezlemek kafesli rapamisin-biotin adduct (KİB). Ayrıntılar için &quot;KİB Sentetik düzeni&quot; bakınız. Kısaca, kafes ve biyotin yarımlar ayrı olarak hazırlanır. Kafes yarımı sonra rapamisinin (LC laboratuar) ile konjuge olup, ürün daha sonra CRB verecek şekilde tıklama reaksiyonu içinde bir 7 vasıtası ile biyotin yarımına bağlanmıştır. </li><li> DMSO içinde CRB bir 1 uM stok çözeltisi hazırlayın. </li><li> 0,5 ml Eppendorf tüp PBS 250 ul olarak 1mg avidin eritin. </li><li> Çözünmüş avidin için CRB stok solüsyonundan 1 ul ekleyin. Ters tarafından bir kaç kez karıştırın. </li><li> CRB-avidin konjugatı (CRB-A verecek şekilde 15 dakika oda sıcaklığında inkübe) Çözümü. </li><li> Ilişkisiz küçük moleküller uzaklaştırın ve saflaştırmak KİB-A boyutu-dışlama sütunu kullanarak. </li></ol> 3. Mikroskopi ve Subselüler Düzeyinde Işık Aydınlatma <ol><li> Serum 12 saat boyunca FBS olmadan DMEM içinde transfekte edilmiş hücrelerin açlık. </li><li> Yavaşça hücrelerini medya çekilerek hazırlanmış 400 nM KİB-bir çözüm (adım 2.6 dan itibaren) 250 ul ekleyin. </li><li> Işık tedavisi öncesi ve sonrası Subselüler çözünürlükte canlı hücreler protein dinamikleri görselleştirmek için, iplik diski mikroskobu (Şekil 2a) kullanıldı. UV aydınlatma epi-floresan ışığı (Şekil 2b) ile UV LED ışık (365 nm) için optik bağlantı sağlandı. </li><li> Metamorph yazılımı Transfekte edilmiş hücrelerin floresans görüntüler, her 15 saniye yakalamak için kullanıldı. </li><li> UV ışığı ile heyecanlandım floresan boya ile kaplanmış bir cam levha kullanılarak bir aydınlatma noktanın koordinatları ve boyutu tanımlayın. Boyutu olabilirfarklı büyütmeler objektif lens uygulayarak ve farklı çekirdek boyutu ile optik fiberler seçilerek çeşitlendirilebilir. </li><li> Hücre periferinde membran ruffling, saçmak UV ışık arka seviyelerini belirledikten sonra. Aşağıdaki iki adım lokalize etkileri önceki karşılaştırmak vardır. </li><li> Küresel bir cıvalı lamba tarafından sağlanan 365 nm ışık hücreleri ışın tedavisi. </li><li> , Uncaged DMSO içinde ve sonra PBS (400 nM final) içinde eritilir ve böylece orijinal rapamisin ve küresel etkilere sebep olmak için görüntüleme odasına solüsyonu ilave edin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Temsili sonuçlar bir örneği, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bir hücresel kenarında küçük bir bölgede UV ışık ışınlama hızla lokalize oluşumu uyarılan ışınlanmış alanında ve yakın sadece katlar. Bu WHI iki, biz o zaman küresel UV ile ışınlanmış hücreleri, aslında yerel etkinlik, ya da toplu medya rapamisin eklendiğini onaylamak içinch membran boyunca küresel fırfır oluşumuna bağlı. Bir kantitatif analiz için, dört parçaya bölünür hedef hücrelere bölünmüş ve fırfır yerel üzerine her çeyrekte oluşumu gibi denetimleri (Şekil 4) dahil olmak üzere, çeşitli koşullar altında küresel uyarılmasını takiben sıklığı sayılır. Sadece bu UV ışınlama kombinasyonu, KİB-A, ve yerel ruffling indükler uygun FKBP-FRB yapıları olduğunu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> Şekil 1. Kafesli rapamisin-avidin konjuge (KİB-A) ve UV ışık kullanılarak mekansal sınırlı protein Dimerleşme şematik. UV ışını kimyasal dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hidroksietil) rapamisin) ve yan-ürünün yayın ile sonuçlanan, rapamisin ve biotin ile linker parçalayarak. Serbest dimerizer sonra hücrelerin içine yayılır ve FKBP-POI (ilgi protein) ve plazma memb arasındaki dimerizasyon indüklerRane sadece ışınlanmış bölgesi (mavi daire) yakınında FRB demirledi. UV ışını olmadan, FKBP ve FRB dolayısıyla hiçbir etkisi üreten, (kırmızı çarpı) doçent yok. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> Şekil 2. Özelleştirilmiş konfokal floresan mikroskop resmi. Konfokal mikroskop (a) önden görünüşü (Axiovert 200, Zeiss ters). EPI, floresans ve UV aydınlatma için bir kaplin ünitesi (b), Yakın çekim, üstten görünüşü. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> Şekil lokalize UV ışını ile indüklenen bir transfekte NIH3T3 hücrede 3. Mekansal sınırlı fırfır oluşumu. YFP etiketli FKBP-Tiam1 (Rac aktivatörü) ve LDR (FRB membran-demirlemiş) ile transfekte bir NIH3T3 fibroblast hücre Konfokal floresan görüntüleri L ile kenarına yakın bir sınırlı alanda ışınlama yapıldı15 sn toplu medyada KİB-A konjugat varlığında 210 sn &#39;den için 365 nm&#39;de ED ışık. Bu tedavi 1560 sn rapamisin son 400 nM 1063 sn ve küresel Ayrıca az 1 saniye civa lambası ile global aydınlatma izledi. Hücre başında (a) neredeyse hiç ruffling faaliyet gösterdi ancak gösterdi uzaysal lokalize aydınlatma sonra ruffling sınırlı (sarı daire) (b). Hücre yerel fırfır oluşumu Rac olarak uzaysal sınırlı aktivasyonu sonucu olduğunu gösteren, global aydınlatma ve rapamisin (cd) ilavesinden sonra küresel fırfır oluşumu gösterdi. Ölçek çubuğu: 10 mikron. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> Şekil 4. Transfekte NIH3T3 hücrelerinin kadranda fırfır oluşumu sıklığı. CRB-A ve aşağıdaki genel UV ışını 13 hücreleri üzerinde yapıldı. CRB-A ile lokal UV ışını </s&gt; Ayrıca (UV radyasyon) Lüks, avidin olan veya olmayan yerel UV ışınlaması sırasıyla 13, 5 ve 6 hücreleri üzerinde uygulanmıştır. Gözlenen hücrelerin hiçbiri UV radyasyon, veya veya toplu ortamda avidin olmadan yerel UV ışınlaması olmadan KİB-A ile fırfır oluşumu gösterdi. Düşük arka fırfır oluşumu ile hücrelerde verileri toplanmıştır ancak bu rapamisinin (nihai 400 nM) ilavesi sonucu genel oluşması fırfır teyit tarafından her bir deney sonra kontrol rapamisin indüklenen fırfır oluşumu, bir kapasiteye sahip olan. Bu sonuçlar, CRB-A ve yerel UV ışını hücrelerinde yerel fırfır oluşumu için gerekli olduğunu gösterdi. (Copyright @ ACS2011) 6 Kısaltmalar: FKBP: FK506-bağlayıcı protein FRB: FKBP-rapamisin-bağlayıcı protein Tiam1: T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1 (Rac GEF) LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: Lyn kinaz N-terminal 11 amino asitleri) HE-Rapa: C40-O - (2-hidroksietil) rapamisin KİB: biotin grubu ile kafesli rapamisin KİB-A: avidin için CRB konjuge

<ol><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li>
<li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li>
<li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29%3A+Implications+for+signaling+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li>
<li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li>
<li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific%2C+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li>
<li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am+.Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li>
<li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+protein+assembly%3A+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li>
<li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns%284%2C5%29P2+gate+KCNQ+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li>
<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde doğru bir hücre içi yerde Rho GTPaz aktivitesi işlemek üzere FKBP-FRB heterodimerization sistemine sahip bir yeni bileşik kafeste birlikte çalıştığı bir yöntem tarif. Bu yaklaşımın üç sınırlamalar vardır. Metodu plazma membranında dimerizer difüzyonu önlenmesi veya izin bağlı olduğu Birincisi, hedef hücresel plazma membranında konuma yada çevresi olması gerekmektedir. KİB kimyasal yapısı daha ileri optimizasyon bileşik ışık ışınlama kadar dimerizasyon ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Rapamisin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> Sigma </td><td> A9275-10mg </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Boyut-dışlama sütun </td><td> GE Healthcare </td><td> Spin Tuzak G-25 </td></tr><tr><td> Cam alt 8-iyi kamara </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Ters Floresan mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV ışık kaynağı LED </td><td> Rapp Opto Elektronik </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Konfokal dönen disk </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x Objektif lens </td><td> Zeiss </td><td> Planı Apochromat </td></tr></tbody></table> KİB Sentetik şeması (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Şema 1" /></a> Sentetik koşullar: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) 3 f.HNO, AcOH (c), TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gliserol, kedi. PTSA, Toluen (f) NaBH3CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, Piridin (h) metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, Piridin, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, askorbat, 2-propanol, 2 H, O, CH2 Cl2.

yaşayan hücreler içinde subselüler düzeyinde ve seconds zaman ölçeği üzerinde küçük gtpaz faaliyet uzay-zamansal manipülasyon

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Büyük zamanmekansal hassasiyetle küçük guanozin triphosphatases (GTPases) ve Rho ailesinin Dinamik yönetmelik çeşitli hücresel fonksiyonları ve olaylar 1, 2 için gereklidir. Onların spatiotemporally dinamik yapısı gerçek zamanlı 3 de, faaliyet ve yerelleşme görselleştirme tarafından ortaya konmuştur. Moleküler düzeyde çeşitli hücresel fonksiyonların rolleri daha derin bir anlayış kazanmak için, bir sonraki adım, kesin Subselüler konum ve zamanlama ile protein faaliyetlerinin pertürbasyon olmalıdır. (1) rapamisin bağlı FKBP-FRB heterodimerization ve rapamisin (2) Fotoğraf-kafes yöntemi: Bu hedefe ulaşmak için, ışık kaynaklı, iki tekniği birleştirerek küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon için bir yöntem geliştirdik. Rapamisin aracılı FKBP-FRB heterodimerization kullanımı ile, hızla küçük GTPases includi aktivasyonu veya inaktivasyonu indüklenebilir için bir yöntem geliştirding Rac 4, rapamisin FRB tutturulduğu plazma zarına, FKBP-erimiş GTPases, ya da bunların aktivatörlerinin translokasyonu indüklemektedir hangi Cdc42 4, RhoA 4 ve 5 Ras,. Bu heterodimerization sistemi ile bağlantı için, biz de rapamisin analoglarının bir foto-kafes sistemi geliştirdik. A foto-kafeste bileşiğin aktivitesi olan bir kafes grubu olarak bilinen bir photocleavable koruyucu grup ile bastırılmış, küçük bir moleküldür. Tamamen heterodimerization faaliyetleri bastırmak için, hücrelerin 6 içinde kimyasal bir dimerizer olarak neredeyse hiçbir plan aktivitesi yol, elde edilen büyük ve karmaşık bir plazma zarı geçemez öyle bir makromolekül tethered bir kafese rapamisin tasarlanmıştır. Şekil 1 bizim bir düzeni göstermektedir sistem. Bu iki sistemin kombinasyonu ile, yerel saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde plazma membranı bir Rac aktivatörü işe ve Subselüler lev ışık kaynaklı Rac aktivasyon eldeEl 6.

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Rho küçük guanozin trifosfataz (GTPaz) ailesinin yüksek uzaysal ve zamansal hassasiyetle dinamik regülasyonu, çeşitli hücresel ... için temel öneme sahiptir.

Bu video, plazma membranındaki bir proteinin aktivitesini manipüle etmek için UV ışığının kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir. Bunu gerçekleştirmek için, hücrelere membran çapalı FRB proteini ile ilgilenilen FK BP füzyon proteini birlikte transfekte edilir. Ortama foto-kafesli bir rapamisin türevi eklenir.Ardından canlı hücre görüntülemesi sırasında, hücrenin belirli bir bölgesine UV ışığı uygulanır. Rapamisin ve biyotin arasındaki bağ koparılarak kimyasal dimerizatör ve yan ürünü serbest bırakılır; serbest kalan dimerizatör hücrelere difüze olur ve ışınlanan bölgede FKBP ile işaretlenmiş hedef protein ile plazma membranına ankore edilmiş FRB arasında dimerleşmeyi indükler. UV radyasyonu olmadan FKBP ve FRB birleşmez, dolayısıyla herhangi bir etki oluşmaz.Verilerin analizi, ilgilenilen FKBP füzyon proteininin fizyolojik etkisine bağlı olarak oldukça lokalize bir şekilde toplandığını ortaya koymaktadır. Bu tekniğin farmakoloji ve genetik yaklaşımlar gibi mevcut yöntemlere göre avantajı; etki hızı, hedef özgüllüğü ve uzaysal çözünürlüğün birleşimidir. Bu tekniğin çıkarımları, kanser hücrelerinin göçü sonucunda ortaya çıkan kanser metastazı tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu nedenle

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makalede, mikroenjeksiyon tekniği kullanarak polarize epitel hücreleri küçük GTPases aşırı ekspresyonu ve analiz yer alan usul.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Burada tarif biz prenilasyon ve guanozin-5'-trifosfat (GTP) araştırmak için bir protokol-Rho GTPazlar yükleme. Bu protokol iki detaylı yöntemi oluşur, yani membran ayırma ve GTPazlar bağlı immunosorbent assay. Protokolü prenilasyon ve GTP ölçmek için kullanılabilir diğer küçük GTPases'den başka bir yükleme.

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Temel ve uygulamalı araştırmalarda yaygın olarak kullanılan tipik mikrotübül inhibitörleri, hücreler üzerinde geniş kapsamlı etkilere sahiptir. Son zamanlarda, fotostatinler, mikrotübüllerin anlık, geri dönüşümlü, mekansal olarak hassas manipülasyonunu yapabilen bir fotodeğiştirilebilir mikrotübül inhibitörleri sınıfı olarak ortaya çıkmıştır. Bu adım adım protokol, fotostatinlerin 3D canlı preimplantasyon fare embriyosunda uygulanmasını detaylandırır.

Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Dinamin süper aile proteinlerinin işlevleri, GTP hidrolizi ile birleşen konformasyonel değişikliklere bağlıdır. Farklı nükleotid yükleme durumlarında dinnamin benzeri GTPaz atlastininin konformasyonel dinamiklerini izlemek için tek moleküllü FRET (smFRET) tekniği kullanılarak bir sistem tanımlanmıştır.

Dinamin Benzeri GTPaz Atlastininin Konformasyonel Dinamiklerini Gözlemlemek için Tek Moleküllü FRET Görüntüleme

Öğrenin, küçük GTPaz aktivitesini ışıkla subselüler düzeyde ve saniyeler ölçeğinde uzay-zamansal olarak nasıl kontrol edeceğinizi. Bu yöntem, canlı hücrelerde plazma membranında protein aktivitesini hassas şekilde manipüle etmeyi sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Daha fazla video keşfet