DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen özelliğe sahip partiküllerin seçilebileceği, oldukça çeşitli bir sentetik adeno ilişkili viral kapsid kütüphanesi oluşturmaktır. Bu, öncelikle kontrollü DNAse I sindirimi yoluyla aav kapsid genlerinin fragmanlara ayrılması, klonlanması ve seçilmesiyle gerçekleştirilir; böylece bu genlerin iki PCR reaksiyonu aracılığıyla kimerik diziler şeklinde yeniden birleştirilmesi sağlanır. İkinci adımda, elde edilen PCR ürünü, en az 1 milyon farklı aav kapsid geni içeren bir plazmid kütüphanesi üretmek için replikasyon yeteneğine sahip bir aav yapısına geri klonlanır.

Ardından, hedef hücrelerde veya hayvanlarda seçilebilecek kimerik bir virüs kütüphanesi üretmek amacıyla, bu plazmit kütüphanesi bir adenoviral yardımcı plazmit ile birlikte 2 9 3 T hücrelerine transfekte edilir. Sonuçlar, kültür hücrelerinde veya yetişkin farelerde gelişmiş veya daha spesifik raporlayıcı gen ekspresyonuna dayalı olarak, yeni sentetik A A V vektörlerinin başarılı moleküler mühendisliğini ve evrimini göstermektedir. Bu tekniğin peptid sergileme gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, DNA ailesi karıştırmanın (shuffling), hücre bağlanmasından hücre içi taşınmaya, kılıf açılmasından çekirdekteki gen ekspresyonuna kadar AV kapsidinin birden fazla özelliğini aynı anda değiştirme ve geliştirme potansiyeline sahip olmasıdır.

Bu yöntem, belirli bir terapötik uygulama için nasıl ideal bir vektör elde edileceği veya bir viral kapsidin belirli bir özellikten sorumlu olan bölgelerinin nasıl analiz edileceği gibi, gen terapisi ve viroloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yöntemimiz, HIV için T-hücreleri veya hepatit virüsleri için hepatositler gibi viral hedef hücreleri spesifik ve güçlü bir şekilde enfekte eden AAV vektörlerinin moleküler evrimine olanak tanıdığı için, bu tekniğin etkileri viral patojen enfeksiyonları da dahil olmak üzere birçok insan hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır. Ayrıca bu yöntem, AAV biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilir ve gen terapisi için AAV vektörlerini geliştirmek amacıyla kullanılabilir.

Bu yöntem, doz kodlayan floresanlar, üç raporlayıcı, hücresel enzimler veya RNA interferansı ile ilgili proteinler gibi temel veya uygulamalı öneme sahip diğer gen ailelerine de kolaylıkla uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, yetişkin fare dilimlerine terapötik genler transfekte etmek için uygun bir vektör aramaya çalışırken; doğal olarak meydana gelen tüm AV serotiplerinin, insan popülasyonundaki yüksek yaygınlık ve buna bağlı olarak bağışıklık yanıtının yüksek olması veya kültürleşmiş hepatositlerin in vitro ortamda etkin transdüksiyonuna rağmen in vivo performanstaki yetersizlik gibi dezavantajlara sahip olduğunu fark ettiğimizde edindik. DNA tabanlı AV kapsid gen fragmantasyonu ve viral kütüphane üretim basamaklarının bazıları deneyim ve kritik aşamaların farkındalığını gerektirdiğinden öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu sayede, çeşitli adeno ilişkili viral kapsid genlerinin yeterli miktarlarda rutin olarak hazırlanması kolaylaştırılacaktır.

DNA karıştırma (shuffling) işlemi için bu genler başlangıçta ortak bir plazmit iskeletine alt klonlanır. Bunu gerçekleştirmek için, istenen cap genleri öncelikle cap F ve cap R primerleri kullanılarak, yaygın olarak bulunan AAV plazmitlerinden PCR ile çoğaltılır. Ardından cap genleri, spesifik primer bağlanma bölgelerinin yanı sıra restriksiyon bölgeleri içerecek şekilde tasarlanmış bir plazmite klonlanır. Bu örnekte, cap geni, cap çoğaltma için kullanılan primerlerde ve alıcı plazmitte mevcut olan ancak çoğu AAV'de bulunmayan PAC bir ve SC bir bölgelerine klonlanır; AAV kapsid genlerini kodlayan plazmit setleri oluşturulduğunda, seçilen cap genlerini T3 ve T7 primerlerini kullanarak PCR ile çoğaltarak cap karıştırma prosedürüne başlanır.

200 nanogram cap plazmidi, her biri iki mikromolar final konsantrasyonda olan primerler, 10 mikrolitre beş x high five tamponu ve bir mikrolitre high five polimeraz içeren 50 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu hazırlayın. Bu reaksiyon, kütüphaneye dahil edilecek cap genlerinin sayısına bağlı olarak altı karıştırma (shuffling) reaksiyonuna kadar yeterli olacak yaklaşık üç mikrogram PCR ürünü verecektir. 95 degrees Celsius'te beş dakika ile başlayın ve ardından 94 degrees Celsius'te 15 saniye, 57 degrees Celsius'te 30 saniye ve 68 degrees Celsius'te üç dakika şeklinde 40 döngü gerçekleştirin; son olarak 72 degrees Celsius'te 10 dakikalık final adımını uygulayın.

PCR ürünleri saflaştırıldıktan sonra, Kyra'ya yeniden birleştirilmek üzere cap geni fragmanları oluşturmak için kontrollü bir DNA sindirimi kullanılır. Bu prosedürün en zor yönlerinden biri, Kyra'lara yeniden birleştirme işlemi için belirli bir kullanışlı aralıkta sindirilmiş cap DNA fragmanları elde etmektir; bu amaçla, başlangıçta saflaştırılmış cap genlerinin PLE miktarlarını hazırlarız ve ardından farklı koşullar altında birden fazla paralel reaksiyon kurarız. Sindirimi eşit şekilde kurmak için, çeşitli cap PCR ürünlerini 54 µL su içerisinde toplam dört µg olacak şekilde karıştırın ve ardından reaksiyona 6 µL DS reaksiyon tamponu ile 0,5 µL DNAse I dikkatlice ekleyin; tüpü üç kez hafifçe santrifüjleyin ve hemen 25 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştirin.

Bu ilk reaksiyonu bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, ikinci bir sindirim reaksiyonu hazırlayın ancak bunu 25 °C'de bir dakika 15 saniye boyunca inkübe edin. Bu yöntemle, inkübasyon süresini 15 saniyelik artışlarla değiştirerek, bir ila iki dakika arasındaki inkübasyon sürelerine sahip birden fazla paralel reaksiyon kurun.

Her bir reaksiyonu altı µL 25 mM EDTA ekleyerek durdurun. Tüpü kısaca vorteksleyin ve 75 °C'de 10 dakika inkübe edin. Çoklu paralel reaksiyonlar, farklı inkübasyon süreleri için biri olmak üzere, DNA'lar ile digeste edilmiş beş kap örneği ile sonuçlanacaktır; kap fragmanlarını standart %1 AROS jel üzerinde saflaştırın.

İdeal olarak, bir dakika, 45 saniye veya başlangıç için iki dakikalık inkübasyon süreleriyle bu örnekte gösterildiği gibi, 100 ile 500 baz çifti arasında bir yayılma (smear) görülmelidir. DNA ailesi karıştırmada (family shuffling), kap fragmanları önce kısmi homolojilere dayalı olarak kendi kendilerini başlattıkları bir PCR aracılığıyla tam uzunlukta dizilere yeniden birleştirilir. 500 nanogram saflaştırılmış fragman, 10 mikrolitre 10 x füzyon tamponu, bir mikrolitre 10 millimolar dNTPs, 1,5 mikrolitre DMSO ve 0,5 mikrolitre füzyon ile 50 mikrolitrelik bir reaksiyon hazırlayın.

İki polimeraz 98 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edilir ve ardından 98 °C'de 10 saniye, 42 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 45 saniyeden oluşan 40 döngü uygulanır; sonrasında 72 °C'de 10 dakikalık son bir adım gerçekleştirilir. Daha sonra, korunan yan dizilere bağlanan primerler kullanılarak ikinci bir PCR ile, sonraki klonlama işlemleri için yeniden birleştirilmiş kap genleri amplifiye edilir. Örneğin, SAF ve SAR veya CUF ve CUR primerleri kullanılarak; her biri 2 µM son konsantrasyonda olan birinci PCR primerlerinden 2 µL, 0,5 µL magnezyum klorür, 10 µL 5x high-FI tamponu ve 1 µL high-FI polimeraz içeren 50 µL'lik bir reaksiyon hazırlanır.

Sonraki klonlama işlemleri için yeterince yüksek verim elde etmek amacıyla 16 ila 24 PCR yapılması önerilir. PCR ürünleri birleştirilip tam uzunluktaki kap bandı saflaştırıldıktan sonraki adım, saflaştırılmış kap gen havuzunu, replikasyon yeteneğine sahip bir AAV plazmidine klonlamak için PAC I ve ASC I ile sindirmektir. Alıcı plazmit, AAV P5 promotörünün kontrolü altındaki AAV2 rep geni ile PAC I ve ASC I bölgelerini çevreleyen AAV ters uç tekrarlarını taşır.

rep'in aşağı akışındaki restriksiyon bölgeleri, karıştırılmış cap havuzunun çerçeve içi (in-frame) klonlanmasına olanak tanır. Oklarla belirtilen LSE primer bağlanma bölgeleri, cap geni dizilemesi için kullanışlıdır; cap fragmanlarını ve uygun şekilde kesilmiş alıcı plazmit omurgasını üçte bir molar oranda birleştirin. Mikrolitre başına 15 nanogram nihai DNA konsantrasyonu ile 20 transformasyon için yeterli, toplam 40 mikrolitre hacminde bir master mix hazırlayın.

16 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, ligasyon reaksiyonunu e coli'ye transforme edin. İki µL ligasyon reaksiyonunu 30 µL elektro-kompetan e coli ile karıştırın ve önceden soğutulmuş elektroporasyon küvetlerine aktarın; buz üzerinde 1,8 kV, 200 Ω ve 25 µF değerlerinde elektropore edin. Zaman sabiti beş ms civarında olmalıdır; hemen ardından 1 mL önceden ısıtılmış SOC besiyeri ekleyip 250 mL'lik bir erlene aktarın.

Bu şekilde yapılacak 20 elektroporasyon, yaklaşık 1 × 10⁶ farklı klon çeşitliliğine sahip bir kütüphane sağlayacaktır. Havuzlanmış transformasyonlara bir hacim önceden ısıtılmış SOC ortamı ekleyin ve 37 °C'de, 180 RPM'de bir saat boyunca çalkalayın. Ardından, havuzlanmış transformasyonların 40 mL'sini, ampicillin içeren 800 mL LB ortamına ekleyin ve aynı koşullar altında 16 saat daha inkübe edin; ardından kütüphane plazmit DNA'sı ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak saflaştırılır.

Viral kütüphanenin üretimi, HEC 2 9 3 T hücrelerinin a a v kütüphanesi ile transfekte edilmesiyle başlar; bu prosedüre başlamak için, 10 adet 15 santimetrekarelik kapta HEC 2 9 3 T hücrelerini ekleyin ve 37 °C'de 48 saat boyunca büyütün. Her bir transfeksiyon için, iki ayrı tüpte aşağıdaki iki reaktif karışımını hazırlayın. İlk tüpteki miktarlar 10 plaka için verilmiştir.

7,9 mililitre sodyum klorür ve DNA'yı karıştırın ve toplam hacim 15,8 mililitre olacak şekilde su ekleyin. İkinci tüpe 3,52 mililitre polietilen amin, 7,9 mililitre sodyum klorür ve 4,38 mililitre su ekleyin. Karışımları birleştirin, vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından çözeltiyi 2 9 3 T hücrelerinin bulunduğu her bir kaba eşit şekilde dağıtın. 37 °C'de inkübe edin.

48 saat sonra, viral kütüphane hasat edilebilir. Hücreleri medyumun içine sıyırarak toplayın, tüm kaplardaki hücreleri tek bir tüpte birleştirin ve 15 dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleyin. Hücre peletini altı mililitre lizis tamponunda yeniden süspande edin ve ardından beş dondurma-çözme döngüsüne tabi tutun; beş dondurma-çözme döngüsünün ardından, 37 °C'de bir saat boyunca Ben Nase ile inkübe edin.

Ardından, hücre kalıntılarını 3.750 RPM'de 20 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Bir pastör pipeti kullanarak beş mililitre virüs süspansiyonunu bir Beckman Quicks seal santrifüj tüpüne ekleyerek bir purifikasyon gradyanı hazırlayın; ardından %15, %25 ve %40'lık iodixanol çözeltilerinden her birinden 1,5 mililitre ekleyin. Gradyanın üzerini lizis tamponu ile tamamlayın ve 4 °C'de, iki saat boyunca 50.000 g'de ultrasantrifüj yapın.

Ultrasantrifüjleme tamamlandığında, tüpü rotordan çıkarın ve tüpün dış kısmını %70 etanol ile temizleyin. Havalandırma için tüpün üst kısmına bir iğne batırın ve %40 IOL fraksiyonundan 1,2 mililitre çekmek için başka bir iğne kullanın. Boş vektörler içerdiğinden %25'lik fraksiyondan çekim yapmamaya dikkat edin.

AAV kapsidleri. Orijinal plazmid kütüphanesinden elde edilen bireysel klonlar, rekombinant AAV vektörleri üretmek için kullanılarak fonksiyonellikleri ve çeşitlilikleri açısından analiz edilir. Bir raporlayıcı gen ifade eden kültür hücreleri veya hayvanlar, ardından saflaştırılmış virüsün farklı miktarları ile enfekte edilir ve transduksiyon verimliliği belirlenir.

Burada, karıştırılmış (shuffled) cap genleri ile oluşturulmuş beş farklı rekombinant YFP ekspres eden AAV vektörleri ile enfekte edilmiş üç insan hücre hattından elde edilen floresan mikroskopi sonuçları gösterilmektedir. Transdüksiyon verimliliğini analiz etmek için alternatif bir yöntem, floresan raporlayıcı gen ekspresyonunun FACS tabanlı ölçümüdür. Bu şekil; insan böbrek, insan serviksi, murin fibroblastlar ve insan T hücresi olmak üzere dört hücre tipinin, orijinal bir kütüphaneden rastgele seçilmiş karıştırılmış cap genleri ile yapılmış 18 farklı rekombinant YFP ekspres eden AAV vektörleri ile enfekte edilmesinden elde edilen tipik bir sonucu göstermektedir.

YFP ekspresyonu, daha kolay görselleştirme sağlamak amacıyla renklerle kodlanmıştır. Görselleştirilen değerler, transduksiyonu gerçekleşmiş hücrelerin yüzdelerini temsil etmekte olup siyah %0'ı, beyaz ise her hücre tipi için ölçülen en yüksek değeri göstermektedir. Klon B2'nin kırmızı rengi, seçilmemiş kapsidlerden beklenebileceği üzere, genel etkinliği düşük bir klonu örneklendirmektedir. Viral kütüphane daha sonra, belirli bir hücre hattında veya hayvanlarda seçime yönelik olarak istenen özelliklerin çoğunu veya tamamını sergileyen tekil partiküller için taranabilir.

Kültürlenmiş hücrelerde, hücreler önce kütüphanenin çeşitli alikotları ve büyüme desteği için ENO virüsü beş ile birlikte enfekte edilir, ardından hücreler hasat edilir ve amplifiye edilmiş a a v ekstre edilerek yeni hücreleri yeniden enfekte etmek için kullanılır. Hücrelerin ko-enfeksiyonu için optimal a a v adenovirus oranlarının belirlenmesi önemlidir ve etkili arius enfeksiyonu için iyi bir ölçüt, virüs inokülasyonundan üç gün sonra hücrelerin yuvarlaklaşması ve ayrılmasıyla kanıtlanan sitopatik etkilerin oluşmasıdır; bu şekilde, sol üst panel enfekte edilmemiş hücreleri gösterirken, diğer paneller hücre başına belirtilen partikül miktarlarında adenovirus ile enfekte edilmiş hücreleri göstermektedir. a a v enfeksiyonu ve amplifikasyonu için bir başka kullanışlı okuma yöntemi, yüksek düzeyde korunmuş bir a a v kapsid epitopunu tanıyan B bir antikoru kullanılarak western blotting ile kapsid proteinlerinin tespit edilmesidir.

Soldaki blot, microlitre cinsinden çeşitli hacimlerde a a V kütüphanesi ve yardımcı ENO vir ile ko-enfekte edilmiş hücreleri göstermektedir. İlk iki şerit, zar zor tespit edilebilir a a v protein ekspresyonu sağlayan koşullar için iyi örneklerdir; bu durum yeterli ancak aşırı olmayan bir a a v enfeksiyonu ve amplifikasyonuna, dolayısıyla istenen sık genotip-fenotip bağlantısına işaret eder. Bu nedenle, taze hücrelerin yeniden enfekte edilmesi için bu süpernatanların 0.11 veya 10 microlitre'si kullanılmıştır.

Western blot sonuçları sağdaki hücrelerde gösterilmiştir. LA c'de, negatif kontrol olarak yalnızca a v ile enfeksiyon uygulanmıştır. Ayrıca, tekrarlanan enfeksiyon döngüleri sırasında kütüphane çeşitliliğinin DNA dizileme ile izlenmesi kritik önem taşımaktadır.

Bu diyagram, AAV 2, 8 ve 9 tabanlı bir kütüphaneden elde edilen AAV klonlarının protein dizilerinin seçme işlemi öncesi ve sonrası karşılaştırmalarını göstermektedir; kırmızı çizginin üzerindeki diziler ebeveyn AAV'leri göstermektedir. Mor oklar, homolog rekombinasyon olaylarını belirtir. Kırmızı ok, seçilen tüm klonlarda görülen AAV 2 ve AAV 9 arasındaki crossover'ı işaret eder. Hayvanlarda seçme işlemi için, AAV kütüphanesi hayvanlara infüze edilir, hedef hücrelerden veya dokulardan PCR ile geri kazanılır ve ardından yeni bir enfeksiyon turu için yeniden klonlanır ve paketlenir.

Burada, periferik kütüphane infüzyonundan bir hafta sonra fare karaciğerlerinden başarıyla enfekte edilmiş a a v klonlarının kurtarılmasına dair bir örnek gösterilmiştir. Birinci şerit beklenen 2,2 kilobaz bandını gösterirken, ikinci şerit şablon içermeyen kontrol grubudur; M şeridindeki DNA marker bantlarının boyutları kilobaz cinsinden belirtilmiştir. Seçim prosedüründen bağımsız olarak, zenginleştirilmiş kapsid varyantlarının nihayetinde uygun sistemlerde doğrulanması gerekir.

Kültürlenmiş hücrelerde zenginleştirilmiş bir AAV kymera'sının üstün performansına dair bir örnek burada gösterilmiştir. Daha koyu renkler, partikül sayısı başına, dolayısıyla klon başına daha yüksek enfektiviteyi belirtmektedir. AAV-DJ, geniş bir hücre hattı yelpazesinde sekiz doğal AAV vahşi tip koleksiyonundan daha yüksek performans göstermektedir.

Son olarak, fare karaciğerinde seçilen bir AAV KYMERA klonunun analizi gösterilmiştir. Hepatoma hücreleri üzerinde aynalama yöntemiyle bir AAV DN seçilmiş ve ardından burada gösterilen lüsiferaz ekspres eden rekombinant vektörleri üretmek için kullanılmıştır. Bu vektörden veya fare karaciğerindeki en güçlü doğal izolatlardan biri olan vahşi tip AAV8 tabanlı bir kontrolden eşit dozlarda periferik infüzyon yapıldıktan bir hafta sonra, grup başına üç farenin yer aldığı temsilci örnekler sunulmuştur. AAV DN klonunun karaciğerde toplam olarak biraz daha düşük ekspresyon sağladığı, ancak görüntüleme yazılımı aracılığıyla karaciğer ekspresyon seviyeleri ayarlandıktan sonra, hepatik olmayan dokularda önemli ölçüde daha az hedef dışı etki göstermesi nedeniyle bu organ için daha spesifik olduğu dikkat çekicidir.

Bu teknik, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde, AV kapsid genlerinin amplifikasyonu ile başlayıp viral kütüphanenin oluşturulması ile sona eren bir haftalık bir süreçte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, burada sunulan protokolün doğal AV serotiplerinin seçimine ilişkin deneyimlerimizden türetildiğinin ve diğer kullanıcılar kendi özel kütüphanelerini oluştururken bazı koşulların uyarlanması ve optimize edilmesi gerekebileceğinin unutulmaması önemlidir. Bu prosedürün yanı sıra, oldukça çeşitli kütüphaneler üretmek veya DNA ailesi karıştırma (DNA family shuffling) yöntemiyle oluşturulup zenginleştirilen kapsidlerin özelliklerini geliştirme girişiminde bulunmak için AGENESIS ile bölge yönelimli peptit sunumu veya PCR tabanlı rastgeleleştirme gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu teknik, viral gen aktarımı alanındaki araştırmacıların; HIV enfeksiyonu ve T hücreleri gibi geleneksel AAV tiplerinin yetersiz sonuçlar verdiği hastalıklar ve ilgili hedef hücreler için terapötik stratejiler geliştirmesinin yanı sıra, insan kök hücrelerine ve kültürdeki diğer zor enfekte olan hücrelere vektör tabanlı gen aktarımını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, gen fragmantasyonu ve yeniden birleştirme kombinasyonunu kullanarak yüksek çeşitlilikteki sentetik adeno-ilişkili viral vektör kütüphanelerinin nasıl mühendislik yöntemleriyle oluşturulacağını ve evriltileceğini, ayrıca gen aktarım vektörleri olarak kullanılmaları için bireysel kapsidleri istenen spesifik özellikler açısından zenginleştirmek amacıyla bu kütüphanelerin kültür hücrelerinde veya hayvanlarda nasıl temel olarak seçileceğini iyi derecede anlamış olmalısınız. Adenovirüslerle çalışmanın riskli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken birçok önlem alınması gerektiğini unutmayın.