Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Bu deneyin amacı, herpes simplex virüsü latansı ve reaktivasyonunu incelemek için bir primer nöron hücre kültürü sisteminin nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle RA embriyolarından superior servikal gangliyon nöronlarının izole edilmesi ve nöronal olmayan hücrelerin elenmesinin ardından disosiye gangliyonlardan izole edilen nöronların kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Litik replikasyon inhibitörü varlığında nöronları enfekte etmek için bir EGFP virüsü kullanılarak latent bir HSV enfeksiyonu oluşturulur.

Bir sonraki adım, latent enfekte kültürlerin reaktivasyonunu indüklemektir. Son olarak, reaktivasyon verimliliği, EGFP ekspresyonu zaman içinde izlenerek değerlendirilir. Nihayetinde, kimyasal inhibitörler, RNA interferansı ve gen iletimi kullanımı yoluyla farklı nöronal sinyal yollarının herpes simplex virüsü latansı ve reaktivasyonunu nasıl düzenlediğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, konak nöronundaki herpes simplex virüsü latansını düzenleyen etkileşimlerin moleküler düzeyde ayrıntılı olarak incelenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, herpes simplex virüsü latansı alanındaki, latent genomu baskılayan sinyallerin neler olduğu ve reaktivasyonun moleküler düzeyde nasıl tetiklendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Nöronlarda, bu yöntem HSV-1 latansı hakkında içgörü sağlayabilir.

Bu yöntem ayrıca diğer nörotrofik alfa herpes virüslerine de uygulanabilir. Prosedürü gösterecek olanlar, laboratuvarlarımızdaki lisansüstü öğrenciler Marigo, Kochi ve Julian Kim'dir. Bu protokol için üst servikal ganglionlar veya SCG nöronları, gebe bir dişi sıçanın uterusundan alınan E 21 sıçan yavrularından izole edilir. Bir diseksiyon kabininde çalışarak, makası omuzların hemen üzerindeki boyun tabanına yönlendirip başı gövdeden ayırarak her bir yavruyu sakrifiye edin. Ganglionları açığa çıkarmak için, başı boyun kısmı yukarı bakacak şekilde üç noktadan 23 gauge iğnelerle sabitleyin.

İlk olarak spinal kordu sabitleyin. İkinci olarak, anterior deriyi burun üzerinden çekip sabitleyin ve üçüncü olarak özofagus ile trakeayı boynun arka kısmından uzaklaştırarak sabitleyin. Karotis arter bifurkasyonunu bularak SCG'yi tespit edin.

Karotis arteri çift bir yapıdır. Boynun her iki tarafında birer bifurkasyon bulunur, dolayısıyla kişi başına iki SCG mevcuttur. SCG, dalın hemen altında yer alır.

Bifurkasyonun iki ucundan çekerek ayırarak SCG'yi arterlerden ayırın. SCG, bifurkasyonu çevreleyen opak sarımsı adipoz dokuya kıyasla yarı saydam ve renksizdir. Ganglionları 12 milliliters L 15 içine yerleştirin.

Buz üzerinde, 15 mililitrelik konik tüp içerisinde glikoz ile desteklenmiş besiyeri. Tüm SCG'ler embriyolardan toplandıktan ve nazikçe çekildikten sonra, gangliyonları bir dakika boyunca 600 RPM'de santrifüjleyin ve fazla besiyerini uzaklaştırın.

Gangilyaları, tripsin ve kolajenaz içeren bir mililitre L 15 besiyerinde süspande edin. 37 °C'de 24 dakika boyunca inkübe edin.

Her sekiz dakikada bir karıştırın. Ardından, tripsini etkisiz hale getirmek için 10 mililitre deniz ortamı ekleyin ve bir dakika boyunca santrifüj yapın. 600 RPM hızında, tripsin kollajenaz ortamını mümkün olduğunca uzaklaştırın ve gangliyaları 10 mililitre C ortamı ile yıkayıp 600 RPM'de bir dakika boyunca santrifüj yapın.

Bu yıkama işlemini bir kez tekrarlayın. Yıkama medyumunu uzaklaştırın ve gangliyaları, 5 mL'lik bir şırıngaya takılı 21 gauge iğne ile maksimum 15 yukarı-aşağı döngüsü uygulayarak ayrıştırmak (tritrate) için 1 mL C medyumu içinde yeniden süspanse edin. Topakların çoğunluğu ayrışana kadar 23 gauge iğne kullanarak tritrasyonu tamamlayın.

Ayrıştırılmış nöronları 70 mikronluk bir naylon filtreden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe süzüp kalan tüm hücre kümelerini temizleyin. Canlı hücre sayısını belirlemek için, filtrelenmiş hücre süspansiyonundan 10 mikrolitrelik bir alikot alıp tripan mavisi ile karıştırın. Boyayı aktif olarak dışlayan hücrelerin sayısını bir hemositometre kullanarak sayın.

Ardından, kolajen ve laminin ile önceden kaplanmış bir 96 kuyucuklu doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna, C medyumunda 50 nanograms per milliliter sinir büyüme faktörü içeren 100 microliters C medyumu içinde toplam 5 000 ila 6 000 canlı hücre dağıtın. 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, yani in vitro birinci günde (DIV 1), nöronların uygun şekilde tutunup tutunmadığını ve bazı aksonal projeksiyonların büyümesini kontrol edin.

Kuyucuklardaki C medyasını, NGF Acho ve beş fluoro iki doxy uridine içeren 50 µL nörobazal medya veya NBM ile değiştirin. Hücrelerin kurumamasını sağlamak için medyaları her seferinde bir sıra olacak şekilde değiştirin. Kültürleri 37 °C'de beş gün boyunca inkübe edin.

Nöron dışı hücrelerin ölümünü ve nöronların büyümesini doğrulamak için kültürü günlük olarak izleyin. Prosedürün bu bölümüne in vitro altıncı günde başlamak için, nöron dışı destek hücrelerin çoğunluğunun elendiğinden emin olun. Nöronların gereksiz fiziksel manipülasyonunu her zaman minimuma indirmek son derece önemlidir.

Besiyerinin uzaklaştırılması ve yenilenmesi çok nazik ve yavaşça yapılmalıdır; aksi takdirde oluşacak mekanik stres nöron canlılığını etkileyebilir. Her kuyucuktaki mevcut besiyerine, 100 micromolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde asiklovir veya bir CV ekleyin. Mekanik kuvvetin ertesi gün hücreleri olumsuz etkilememesi için CV'yi yavaşça ve nazikçe ekleyin.

DIV 7'de, SCG kültürlerini, viral litik protein US 11'e füzyonlanmış bir EGF raporlayıcısı eksprese eden rekombinant bir HSV 1 ile, bir ila iki arasında bir enfeksiyon multiplisitesiyle enfekte edin. Seyreltilmiş virüsü doğrudan kuyucuktaki mevcut medyuma ekleyin. Bir yalancı enfekte kontrol ve bir litik enfeksiyon grubu ekleyin.

CV içermeyen medyadaki pozitif kontrol. Enfeksiyonun 37 °C'de iki ila üç saat boyunca ilerlemesine izin verin. Ardından, enfeksiyon medyasını NGF ve CV içeren taze NBM ile değiştirin. Enfeksiyon medyasını değiştirirken son derece nazik olmak kritik önem taşır. Plakayı kendinize doğru eğin ve medyayı kuyucuğun altından yavaşça uzaklaştırın.

Ardından, pipet ucunu kuyucuğun tabanı yerine duvarına yöneltin ve medyumun hücrelerin üzerine nazikçe süzülmesini sağlayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için medyumları her seferinde tek bir sıra şeklinde değiştirin. Kültürleri, HSV 1 latansını destekleme kapasitelerini bozmamak için mümkün olduğunca nazik davranarak inkübatöre geri yerleştirin.

Virüsün latans aşamasına geçmesi için kültürleri altı gün boyunca 37 °C'de tutun. Bu süre zarfında, litik replikasyonun bir göstergesi olarak us 11 EGFP ekspresyonunu izlemek için floresan mikroskop kullanın.

Beklendiği üzere, yalancı enfekte kontrolde GFP ekspresyonu görülmemelidir. S 11 EGFP yalnızca enfeksiyonda tespit edilmelidir. CV uygulaması yapılmayan pozitif kontrol kuyucukları, başarılı bir birincil enfeksiyonun ve üretken litik replikasyonun gerçekleştiğini gösterir.

DIV 14'teki reaktivasyonu değerlendirmek için, CV içeren medyayı daha önce olduğu gibi CV içermeyen taze medya ile dikkatlice değiştirin. Pipet ucunu kuyucuğun tabanına değil, kuyucuğun duvarına yönlendirin ve uygunsa medyanın hücrelerin üzerine nazikçe süzülmesini sağlayın. 20 micromolar konsantrasyonda LY 2 9 0 0 4 gibi farmakolojik veya biyolojik değişkenleri ekleyin.

CV ile işlem görmüş latent enfekte kültürlerde GFP ekspresyonu tespit edilmemelidir. Hücreleri beş ila altı günlük bir süre boyunca 37 °C'ye geri döndürün. Reaktivasyon geçiren nöronları tespit etmek için canlı kültürleri floresan mikroskop kullanarak izleyin.

Reaktivasyon frekansı, EGFP pozitif nöronlar içeren kuyucukların sayısı sayılarak ve bunun toplam örnek kuyucuk sayısına oranı olarak ifade edilerek hesaplanır. Bu şekil, bilinen bir reaktivasyon indükleyicisi olan trigger statin'in enfekte edilmiş geç dönem SCG kültürlerine uygulandığı bir örneği göstermektedir. Reaktivasyon, ilaç uygulamasının ardından beş günlük bir süre boyunca her gün floresan mikroskobu kullanılarak izlenmiş ve puanlanmıştır.

TSA ile reaktivasyon iki gün içinde maksimumun %50'sine ulaşırken, beş gün içinde reaktivasyon %60'a ulaşır; DMSO ile temsil edilen bazal veya spontan reaktivasyon ise bu deneyde yaklaşık %10'dur ve bu in vitro sistem kullanıldığında tipik olarak %5 ile %20 arasında değişmektedir. Enfekte SCG kültürleri daha sonra LY 2 9 0 0 4 ile de işlenmiştir.

LY ile indüklenen reaktivasyon kültürleri; viral DNA sentez inhibitörü fosfo, no asetik asit ve burada gösterildiği gibi her iki bileşiğin birlikte kullanıldığı kültürlerle karşılaştırıldı. US 11 EGFP ekspresyonu, LY 2 9 4 0 0 2 ile reaktive olan kültürlerde PAA tarafından engellenmektedir; bu durum, US 11 EGFP ekspresyonunun viral DNA replikasyonuna bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, steril tekniğe çok dikkat edilmesi ve stres veya mekanik hareketlerin neden olabileceği artmış spontan reaktivasyonu önlemek için CG kültürünün mümkün olduğunca nazikçele taşınması önemlidir. Kültür nöronlarda HSV 1 latent enfeksiyonlarını oluşturmak için bu prosedür takip edildikten sonra, HSV 1 latansını ve reaktivasyonunu düzenleyen nöronal fonksiyonları karakterize etmek amacıyla shRNA knockdown ve yabancı tip ile mutant gen kaybının ektopik ekspresyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

HSV-1'in, PSL 2 güvenlik önlemleri gerektiren bir insan patojeni olduğunu unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce PSL 2 koşullarında çalışma konusunda deneyimli olmalısınız. Bu videoyu izledikten sonra, latent HSV-1 enfeksiyonlarını kurmak için SCG kültürlerinin nasıl oluşturulacağı ve nöronlarda reaktivasyonun nasıl etkili bir şekilde indükleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.