Kültüre ve Duvar Gemi Biyoreaktör Döner Uygulamaları 3D Epitel Hücre Modelleri Türetilmiş

Bu geleneksel olmayan protokol, insan epitelyal hücrelerini, insan in vivo dokusunu taklit eden organotipik 3D modeller şeklinde kültüre etmek için kolay ve sağlam bir sistem sunmaktadır. İlk olarak, epitelyal hücreler bir doku kültürü flasında konflüent bir monokatman oluşturacak şekilde kültüre edilip hasat edilir ve ardından STLV biyoreaktöründeki mikro taşıyıcı boncuklarla birleştirilir; düşük sıvı kayma kuvvetine sahip sabit bir serbest düşüş ortamı yaratmak için platform üzerindeki STLV döndürülür; bu durum hücrelerin boncuklara tutunup büyümesine ve 96 saat sonra ve ardından yaklaşık olarak her gün hücresel agregatlar oluşturmasına olanak tanır.

Agregatlar oluştuktan sonra, hücresel metabolizmayı karşılamak için SDLV'deki besiyerini yenileyin; gelişimsel ilerlemeyi izlemek için, agregat oluşumu ve hücresel farklılaşma tamamlandığında haftalık olarak ışık mikroskobu ile görüntüleme örnekleri alın. Agregatları, sonraki deneysel analizler ve assayler için ekim yapın. Nihayetinde, bu sistem çok sayıda bilimsel araştırma için in vivo benzeri organotipik model sistemler oluşturabilir.

Bu tekniğin konvansiyonel hücre kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, epitelyal hücrelerin doku benzeri agregatlar şeklinde farklılaşması ve polarize olmasıdır; böylece morfolojik ve fonksiyonel olarak gerçek insan dokusuna benzer davranışlar sergilerler. Bu 3D model sistemi, epitelyal hücre biyolojisi, konak-patojen etkileşimleri ve sisteme dahil edilebilecek hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler hakkında daha derinlemesine bilgi sağlar. Dr. Andrea Radkey.

Laboratuvarımdaki bir doktora sonrası araştırmacı, yavaş dönen yan damar biyoreaktörünü detoksifiye etmek için uygulanacak bu prosedürü şimdi gösterecektir. Açık portları luer kapaklarla kapatın. STLV'yi %95 etanol ile doldurun ve 24 saat boyunca dengeye gelmesini bekleyin.

Etanolü boşaltın, ardından steril distile su ile doldurun ve satıcı tarafından sağlanan araçları kullanarak 24 saat boyunca inkübe edin; tüm vidaları gevşetin ve STLV'den merkez tapasını çıkarın. Bunları bir sterilizasyon poşetine yerleştirin ve 110 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın. STLV'yi tekrar birleştirin ve steriliteyi sağlamak için detoksifikasyon işlemini tekrarlayın.

Ardından, STLV vidalarını sıkın. Önceden sterilize edilmiş tek yönlü stopkokları her bir porta takın. Şimdi, 10 mililitrelik ve beş mililitrelik lure lock şırıngaların pistonlarını çıkarın ve pistonları ambalajlarında muhafaza edin.

Sterilliği korumak için şırıngaları durdurma musluğuna vidalayın. STLV tamamen dolana ve beş mililitrelik şırınga dolmaya başlayana kadar 10 mililitrelik şırıngaya DPBS ekleyin. Ardından, steril pistonları her bir şırıngaya yerleştirin ve şırınga pistonlarını sırayla iterek biyoreaktördeki tüm kalıntı kabarcıkları giderin.

Muslukları kapatın ve STLV'yi döner dikey platforma yerleştirin. 50 mililitrelik konik tüpte sızıntıları izlemek için en az 24 saat boyunca döndürün. 250 miligram cyto dex mikrokürecüğe 15 mililitre DPBS ekleyin ve soğuduktan sonra otoklavlayın.

Epitel hücreler için kullanılan kültür medyası ile DPBS yıkamasını üç kez tekrarlayarak uzaklaştırın. Boncukları yeniden süspande etmek için tüpü çalkalayın. Ardından boncukları 15 milliliters kültür medyasında yeniden süspande edin.

İlk olarak, doku kültürü flasklarında monolayer şeklinde 1x10⁷ epitel hücreyi kültürleyin. Hücreleri hasat edin; hücre sayısını belirleyin ve tripan mavisi dışlama boyaması ile hücre canlılığını tespit edin. Hücreleri hazırlanmış boncuklara ekleyin.

Tüm hücrelerin aktarıldığından emin olmak için konik tüpü durulayın. Ardından, DPBS'yi ve şırıngaları STLV'den çıkarın. Ayrıca, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak merkez porttaki tıpayı çıkarın.

Epitel hücre boncuk süspansiyonunu STLV'ye yükleyin. Tüm hücre ve boncukların aktarılması için konik tüpü bir kez durulayın. Ardından merkez port tıpasını geri takın.

Ardından, beş mililitrelik ve 10 mililitrelik bir şırınganın pistonlarını çıkarın ve pistonları ambalajlarına geri yerleştirin. Sterilitenin korunması için şırınga giriş portlarını açık musluklarla kapatın. STLV'yi besiyeri ile doldurun.

Pistonları değiştirin ve musluğu kapatın. Şimdi yeni ekilmiş STLV kültürünü 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca rotasyon olmadan dengeleyin. STLV'yi inkübatörden çıkardıktan sonra musluğu açın.

Pistonlar yardımıyla tüm hava kabarcıklarını giderin ve musluğu kapatın. Ardından, STLV'yi inkübatör içerisinde 20 RPM hızında sürekli rotasyona ayarlayın. 96 ila 120 saat sonra, şırıngaları çıkarıp boncukların ve hücrelerin çökmesine izin vermek için STLV'nin her iki musluğunu da açarak besiyerini değiştirin.

Çöktükten sonra, besleme protokolünü gerçekleştirmek için şırıngaları kullanarak yan porttan medyanın yaklaşık %75'ini boşaltın. Hücresel metabolizmaya bağlı olarak ihtiyaç duyuldukça medyayı yenilemeye devam edin. Ayrıca, agregatların büyümesini ve canlılığını her beş ila yedi günde bir izleyin.

Agregatların parçalanmasını önlemek için, ucundan yaklaşık iki santimetre kesilmiş ve sterilize edilmiş 1000 microliter pipet ucu kullanın. Merkez porttan dikkatlice 200 microliters agregat alın ve iki adet 1,5 milliliter tüpe paylaştırın. Alikotlardan birini hücresel canlılığı izlemek için kullanın. Hücreleri boncuklardan ayırdıktan sonra, canlılığı tripan mavisi dışlama yöntemiyle değerlendirin.

Hücresel agregatların görüntülenmesi için boyama. İkinci 1,5 mL Agregat alikotuna 0,5 ile 1 mL arasında besiyeri ekleyin ve bir kesici kullanarak küçük bir Petri kabına aktarın. Agregatları görüntülemek için 1000 µL pipet ucu kullanın.

Bazı epitel hücre modelleri için ters ışık mikroskobu kullanırken, agregatları hasat etmeden yaklaşık bir hafta önce, kültür havalandırmasını artırmak amacıyla agregatların tek kullanımlık bir kaba aktarılması gerekir. Analiz için, şırıngaları STLV'den çıkarın ve yan porttan medyanın yaklaşık %50'sini boşaltın. Orta tıpayı çıkarın ve tüm içeriği merkez porttan 50 milliliter'lik konik bir tüpe dikkatlice boşaltın.

STLV'yi beş mililitre ortam ile iki kez durulayın ve durulama sıvılarını hasat edilen agregatlarla birleştirin. Ardından, agregatları 50 mililitrelik konik tüpten Harv'a aktarın. Bir hafta sonra, potansiyel analiz formatları, analizler ve incelemeler için agregatları dikkatlice hasat edin; diferansiye insan epitelyal agregatları STLV biyoreaktör sisteminde büyütülmüştür.

SEM ve TEM görüntüleri, STLV'de 39 gün boyunca büyütülen insan vajinal hücrelerinden elde edilmiştir. 3D agregatların dokulara benzer ultrastrüktürel özellikler; mikro kıvrımlar, invajinasyonlar, hücre içi sekresyon vezikülleri ve apikal yüzeydeki mikrovillüsler sergilediğine dikkat edin. 3D vajinal hücrelerin konfokal immünofloresan mikroskopi görüntüleri, müsin ile epitel hücrelere ve terminal farklılaşmaya özgü markörlerin ekspresyonunu göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili fenotipler, bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için mükemmel bir platform görevi de görmektedir.

Hücre canlılığını, metabolizmasını veya proliferasyonunu ölçmek için yaygın olarak kullanılan MTT analizi, çeşitli kimyasalların ve bileşiklerin toksisitesini ölçmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, test bileşikleriyle tedavi sonrası toksisite, trypan blue dışlama yöntemi ile ölçülebilir. Bu örnekte, NONOXINOL nine tedavisi sonrası, vajinal agregatlar servikal eksplan modellerine benzer bir toksisite yanıtı gösterirken, monokatmanlara kıyasla farklı bir profil sergilemiştir.

3B agregatlar, örneğin toll benzeri reseptörler tarafından tanınan mikroplardan türetilen moleküllerle stimüle edildiklerinde fonksiyonel olarak yanıt verirler. Agregatlar yanıt vererek IL six proteini ve progesteron reseptörünün transkript ekspresyonu dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinler salgılarlar. Vajinal hücrelerde hormon stimülasyonuna yanıt veren bir reseptör de gözlemlenebilir.

3D agregatlar sadece patojen ve hormon moleküllerine yanıt verme yeteneğine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda işlevsel olarak herpes simplex virüs Tip iki enfeksiyonunu da destekleyebilirler. HSV iki ile enfekte edilmiş 3D vajinal agregatların konfokal mikroskopi görüntüsü enfeksiyonu kanıtlamaktadır. Agregatlar içindeki bireysel hücrelerin fiziksel ve fonksiyonel özellikleri akış sitometrisi ile de ölçülebilir; örneğin, bireysel vajinal hücrelerde mucin 1 yüzey ekspresyonunu ölçmek için bir akış sitometrisi analizi gerçekleştirilebilir.

3D vajinal agregatlar, gelişimlerinin ardından yüzeylerinde monokatmanlara kıyasla daha düşük oranda mucin 1 eksprese ettiler. Bu teknik, doku biyolojisi ve enfeksiyöz hastalıklar alanındaki araştırmacıların yapısal ve fizyolojik uyarılara verilen yanıtları incelemelerine olanak sağladı. Bu organotipik modelleri kullanarak, insan biyolojisini daha iyi taklit edebiliyoruz.