Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Bu video, biyolojik olarak parçalanabilen poli anhidrit film ve nanopartikül kütüphanelerinin kombinatoryal sentezini ve bu kütüphanelerden protein salınımının yüksek verimli tespitini açıklamaktadır. İlk olarak, bileşimsel olarak çeşitli monomer dizisini cam küvetlere yerleştirmek için kullanılan yüksek verimli otomatik biriktirme aparatları. 1.5 saat boyunca 180 santigrat derece ve 0.3 tor'da bir poli yoğuşma reaksiyonu gerçekleştirilir.

Bu reaksiyon koşulları, C-P-H-S-A poli anhidrit polimer sentezi için spesifiktir. Otomatik biriktirme aparatı kullanılarak, çözücü ve kapsülleme için herhangi bir bileşen, polimer kitaplığını içeren küvetlere bırakılır. Sonikasyon, polimerin tamamen çözünmesini ve ek bileşenlerin düzgün bir şekilde dağılmasını sağlamak için uygulanabilir.

Daha sonra çözünmüş polimer, nanopartikül kütüphanesini nano çökeltme ile imal etmek için çözücü olmayan bir tüpe aktarılır. Nanopartiküller, vakumlu kurutma veya filtrasyon ile geri kazanılır ve daha sonra modifiye edilmiş 96 iyi serbest bırakılmış bir plakaya aktarılır. Son olarak, protein yüklü kütüphane fizyolojik koşullar altında inkübe edilir ve protein salınım kinetiği bir floresan boşluk algılama yöntemi kullanılarak değerlendirilir.

Sonuç olarak, polimer özelliklerinin veya salım ortamı koşullarının bir fonksiyonu olarak protein salım kinetiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yaklaşımın diğer geleneksel bir seferde bir örnek tekniklerine göre en büyük avantajı, aynı anda birden fazla örneği sentezleyebilmemizdir. Bu numuneler daha sonra protein, polimer, hücre polimeri veya konak polimer etkileşimleri için yüksek verimde taranabilir.

Bu daha sonra ilaç dağıtımı ve doku mühendisliği için bu biyomalzemelerin rasyonel tasarımını ve geliştirilmesini hızlandırır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir ameliyat sonrası olan La Tricia Peterson olacak. Videonun bu bölümünde, polimer sentezini takiben bileşimsel olarak değişken bir monomer kütüphanesini biriktirmek için bir Hyatt verim biriktirme aparatı kullanılmaktadır.

Bu aparat, boş veya protein yüklü polimer filmler veya nanopartiküllerden oluşan bir kombinatoryal kütüphane üretmek için kullanılır. Otomatik platform, bilgisayardaki bir bilgisayara seri olarak bağlanmış iki programlanabilir şırınga pompası ve üç doğrusal aktüatörden oluşur. LabVIEW yazılımı, komutları şırınga pompalarına ve aktüatörlere yönlendirmek için kullanılır.

10 cc'lik gaz geçirmez şırıngalar, polimer çözeltilerini cam küvetlere dağıtan yem kilit bağlantı parçaları ile bağlanan metal kılcal borularla şırınga pompalarına yüklenir. Bu gösteride, seik asit veya SA, Texas Red Boan serum albüminini kapsülleyen bir nanopartikül kütüphanesi yapmak için bir altı Biss para oksi heane veya CPH ile kullanılacaktır. Bu videodaki talimatlar ve beraberindeki belgeler, çok çeşitli polimer film ve nanopartikül kitaplıkları oluşturmak ve test etmek için uyarlanabilir.

Kütüphaneleri sentezlemek için, her bir monomer ve kloroformu bir cam şişede mililitre başına 25 miligramlık bir son konsantrasyonda çözerek başlayın. Daha sonra, çözeltiyi şırınganın yem kilit ucundan aspire ederek her bir çözeltiyi 10 cc'lik gaz geçirmez bir şırıngaya yükleyin. Hava kabarcıklarını çıkarın.

Ardından, solvente dayanıklı yem kilidi paslanmaz çelik kılcal boruyu şırınganın ucuna takın. Kılcal boruları kelepçelere sabitleyin, bir halka standına takın. Ardından her iki kılcal borunun ucunu başlangıç damarına yerleştirin.

Monomer biriktirme için. Şırıngaları programlanabilir şırınga pompalarına yerleştirin ve laboratuvar görünümü yazılımında yerlerine kilitleyin. Doğrusal aktüatörleri yazılımda başlangıç konumuna ayarlayın.

SA ve CPH monomerlerinin x, y ve Z eksenindeki cam küvetlere otomatik olarak biriktirilmesini başlatın. Aktüatörler, kılcal boruları her bir Q'ya uygun şekilde konumlandıracak, her bir monomerin programlanmış hacimlerini inceleyecek ve bunlara pompalayacak ve bileşimsel olarak değişken bir monomer kütüphanesi oluşturacaktır. Monomer birikimini takiben.

Monomer kitaplığını önceden ısıtılmış bir vakumlu fırına aktarın ve yoğuşma polimerizasyonunu sağlamak için 180 santigrat derecede ve 0,3 turda 1,5 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, polimer kütüphanesinin imalatı tamamlanır. Daha sonra protein yüklü polimer nanopartiküller üretilir.

Protein yüklü bir nanoparçacık kütüphanesi oluşturmak için protein yüklü polimer film kütüphanesi üretimi için eşlik eden protokole bakın. Bu durumda proteini, Texas kırmızı sığır serum albümini, polimer kütüphanesini çözebilecek şekilde uygun çözücüye ekleyin. Burada, metilen klorür mililitre başına iki miligram konsantrasyonda kullanılır.

10 cc'lik şırıngayı Texas Red BSA içeren solvent ile doldurun ve ilk şırınga pompasına yerleştirin. Daha sonra ikinci şırınga pompasına temiz, boş iki cc'lik bir şırınga yerleştirin, bu durumda 15 mililitre çözücü olmayan tüpleri yerleştirin, flakon platformuna bitişik tüp tutucusuna pentan yerleştirin. Laboratuvarın bir sonraki bölümünde, programı seçerek otomatik çözücü biriktirme işlemini başlatan yazılımı görüntüleyin.

Programın başlatılmasını takiben, çözücü, polimer kütüphanesini içeren küvetlere bırakılır ve bu da mililitre başına 20 miligramlık bir polimer konsantrasyonu ile sonuçlanır. Çözücünün tamamı biriktiğinde, polimeri bir ila beş dakika boyunca çözmesine izin verin. Bunu, tam bir polimer çözünmesi ve homojen protein dağılımı sağlamak için isteğe bağlı bir sendikasyon ile takip edin.

Ardından, laboratuvar görünümünde örnek aktarım programını başlatın. Kütüphanedeki her çözünmüş polimer numunesi daha sonra boş şırıngaya çekilir ve numune tutucudaki karşılık gelen çözücü olmayan tüpüne dağıtılır. Her numune aktarıldıktan sonra, nanopartikül kütüphanesini 10 milimetre cıva vakumunda bir vakum odasına yerleştirerek veya çözücü çıkarılana kadar vakum filtrasyonu kullanarak protein yüklü nanopartikülleri geri kazanın.

Kapsüllenmiş BSA'nın salınımını araştırmak için, plakadaki diğer her bitişik sütunun her bir kuyu duvarının üst yarım inçini çıkararak modifiye edilmiş derin bir 96 kaynak polipropilen plaka ile başlayın. A ve B, C ve DENF ve GNH sütunları arasındaki her bir kuyucuğun tepesinin çıkarılması, tam hacim transferine kadar doldurulduğunda her bir bitişik kuyu çifti arasında sıvı akışına izin verir. Teksas kırmızısı BSA standartları, mililitre başına 1000 ila 10 mikrogram arasında değişen derin 96 kuyulu plakaya.

Bunlar, protein miktarını hesaplamak için kullanılacak ve ayrıca florokrom söndürmeyi, PBS tamponunda istenen nanopartikül kütlesini yeniden oluşturmayı, daha sonra partikülleri düzgün bir şekilde dağıtmak için sonikasyonu hesaba katacaktır. Daha sonra, nanopartikül kütüphanesini derin 96 kuyulu plakaya aktarın ve numuneler kuyu plakasının dibine yerleşene kadar bekleyin. Daha sonra, bir pipetleyici kullanarak, tüm bitişik kuyucukları, kuyunun tepesinden bir inçin dörtte birine kadar PBS tamponu ile yavaşça doldurun.

Bitişik kuyularda, kuyular arasında serbest akış sağlayacak şekilde yeterli tampon bulunmalıdır. Ardından, serbest bırakma plakasını kapakla kapatın ve çalkalama altında 37 santigrat dereceye yerleştirin. Artımlı zaman noktalarında deney süresi boyunca, uygun uyarma, lazer ve emisyon filtrelerini kullanarak plakayı taramak için 9.400 Typhoon düz yataklı floresan tarayıcı kullanın.

Taramanın ardından, her sürümde salınan florokrom konjuge protein miktarını ölçmek için görüntü niceleme yazılımını kullanın. Texas Red BSA, polimer kimyasının bir fonksiyonu olarak protein salım kinetiğini belirlemek için bu videoda açıklandığı gibi SA ve CPH monomerlerinden sentezlenen bir polimer nanopartikül kütüphanesinde kapsüllendi. Protein yüklü nanopartiküller bir ay boyunca 37 santigrat derecede inkübe edildi, bu sırada protein salım ölçümü için artan zaman noktalarında floresan taramalar elde edildi.

Burada gösterildiği gibi, bu hidro verim yöntemi, ACPHSA poli anhidrit nanopartikül kitaplığından Texas Red BSA salım kinetiğini belirlemek için kullanıldı. Sarich film kimyalarından artan salınım oranları ile kimyaya bağlı eğilimler gözlendi. Standart protein miktar tayini testleri kullanılırken de benzer sonuçlar elde edildi.

Ayrı bir deneyde, CPT CPH Poli Anhidrit Film Kütüphanelerinden Texas Red BSA salınımı, burada gösterildiği gibi değerlendirildi, sıfıra yakın dereceli salım kinetiği, cpeg açısından zengin filmlerin proteini en hızlı şekilde saldığı ve tıbbi alanda biyolojik olarak parçalanabilen ilaç dağıtım cihazları olarak potansiyel uygulamalarla gözlemlendi. Bu sonuçlar, terapötik bir ilacın veya aşı antijeninin istenen salım profilinin, polimer kimyası değiştirilerek kontrol edilebileceğini göstermektedir. Bu prosedürü takiben, protein stabilitesi, hücresel toksisite, hücresel aktivasyon ve InVivo biyodağılım gibi alanları araştırmak için başka kombinatoryal yöntemler geliştirilmiştir.

Bu hususlar, ilaç dağıtımı ve doku mühendisliği için biyomalzemelerin rasyonel tasarımı için önemlidir. Tüm bu protokol boyunca uygun KKD giymeyi ve güvenli laboratuvar prosedürlerini uygulamayı unutmayın.