Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Bu video, biyobozunur polianhidrit film ve nanoparçacık kütüphanelerinin kombinatoryal sentezini ve bu kütüphanelerden protein salınımının yüksek verimli tespitini açıklamaktadır. İlk olarak, kompozisyonel olarak çeşitli monomer dizilerini cam küvetlere yerleştirmek için yüksek verimli bir otomatik biriktirme düzeneği kullanılır. Polikondenzasyon reaksiyonu 180 °C ve 0.3 tor basınç altında 1.5 saat boyunca gerçekleştirilir.

Bu reaksiyon koşulları, C-P-H-S-A polianhidrit polimer sentezine özgüdür. Otomatik biriktirme aparatı kullanılarak, solvent ve enkapsülasyon için gerekli tüm bileşenler, polimer kütüphanesini içeren küvetlere aktarılır. Polimerin tamamen çözünmesini ve ek bileşenlerin homojen dağılımını sağlamak için sonikasyon uygulanabilir.

Ardından, nanoopresipitasyon yoluyla nanopartikül kütüphanesi oluşturmak için çözünmüş polimer, bir çözücü olmayan solvent tüpüne aktarılır. Nanopartiküller vakumla kurutma veya filtrasyon yoluyla geri kazanılır ve ardından modifiye edilmiş 96 kuyucuklu bir salım plakasına aktarılır. Son olarak, protein yüklü kütüphane fizyolojik koşullar altında inkübe edilir ve protein salım kinetikleri floresan uzay tespit yöntemi kullanılarak değerlendirilir.

Nihayetinde, protein salınım kinetiğinin polimer özellikleri veya salınım ortamı koşullarının bir fonksiyonu olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yaklaşımın, her seferinde tek bir örneğin incelendiği diğer geleneksel tekniklere göre temel avantajı, çok sayıda örneğin eş zamanlı olarak sentezlenebilmesidir. Bu örnekler daha sonra protein-polimer, hücre-polimer veya konakçı-polimer etkileşimleri açısından yüksek verimlilikle taranabilir.

Bu durum, ilaç iletimi ve doku mühendisliği için bu biyomalzemelerin rasyonel tasarımını ve geliştirilmesini hızlandırır. Prosedürü, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan La Tricia Peterson gösterecek. Videonun bu bölümünde, polimer sentezini takiben kompozisyonel olarak değişken bir monomer kütüphanesi oluşturmak için yüksek verimli bir biriktirme düzeneği kullanılmaktadır.

Bu düzenek, boş veya protein yüklü polimer filmlerden veya nanopartiküllerden oluşan kombinatoryal bir kütüphane oluşturmak için kullanılır. Otomatik platform, bir bilgisayara seri olarak bağlı iki programlanabilir şırınga pompası ve üç lineer aktüatörden oluşmaktadır. Şırınga pompalarına ve aktüatörlere komut göndermek için LabVIEW yazılımı kullanılır.

10 cc gaz sızdırmaz şırıngalar, polimer çözeltilerini cam küvetlere aktaran luer lock bağlantılı metal kapiler tüplerle birlikte şırınga pompalarına yerleştirilir. Bu gösterimde, Texas Red işaretli sığır serum albüminini enkapsüle eden bir nanopartikül kütüphanesi oluşturmak için sebasik asit (SA) ve 1,6-bis(p-karboksifenil)hekzan (CPH) kullanılacaktır. Bu videodaki talimatlar ve beraberindeki belgeler, çok çeşitli polimer film ve nanopartikül kütüphaneleri üretmek ve test etmek için uyarlanabilir.

Kütüphaneleri sentezlemek için, her bir monomeri bir cam şişe içerisinde kloroform ile 25 mg/mL nihai konsantrasyonda çözerek başlayın. Ardından, çözeltiyi şırınganın luer lock ucundan aspire ederek her bir çözeltiyi 10 cc sızdırmaz şırıngaya yükleyin. Varsa hava kabarcıklarını giderin.

Ardından, çözücüye dayanıklı lure lock paslanmaz çelik kapiler tüpü şırınganın ucuna takın. Kapiler tüpleri klemplerle sabitleyip bir ring standa tutturun. Daha sonra, her iki kapiler tüpün ucunu başlangıç kuyucuğuna yerleştirin.

Monomer biriktirme işlemi için şırıngaları programlanabilir şırınga pompalarına yerleştirin ve LabVIEW yazılımında konumlarını sabitleyin. Yazılım üzerinden lineer aktüatörleri başlangıç konumuna getirin.

SA ve CPH monomerlerinin x, y ve Z eksenlerindeki cam küvetlere otomatik birikimini başlatın. Aktüatörler, kapiler tüpleri her bir küvete uygun şekilde yerleştirecek ve programlanmış monomer hacimlerini tüplerin içine pompalayarak bileşimsel olarak farklı bir monomer kütüphanesi oluşturacaktır. Monomer birikimini takiben.

Kondenzasyon polimerizasyonunu gerçekleştirmek için monomer kütüphanesini önceden ısıtılmış bir vakum fırınına aktarın ve 180 °C ve 0.3 tour değerlerinde 1,5 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından polimer kütüphanesinin üretimi tamamlanmış olur. Ardından protein yüklü polimer nanopartiküller oluşturulur.

Protein yüklü bir nanoparçacık kütüphanesi hazırlamak için protein yüklü polimer film kütüphanesi hazırlama ile ilgili ek protokole bakınız. Bu durumda proteini, yani Texas red sığır serum albümini'ni, polimer kütüphanesini çözebilecek uygun bir çözücüye ekleyin. Burada, iki miligram/mililitre konsantrasyonda metilen klorür kullanılmıştır.

10 cc'lik şırıngayı Texas Red BSA içeren çözücü ile doldurun ve birinci şırınga pompasına yerleştirin. Ardından, temiz ve boş iki cc'lik bir şırıngayı ikinci şırınga pompasına yerleştirin; vial platformunun yanındaki tüp tutucuya, içinde 15 mililitre çözücü olmayan bir madde (bu durumda pentan) bulunan tüpleri yerleştirin. Son olarak, lab view yazılımında programı seçerek otomatik çözücü biriktirme işlemini başlatın.

Programın başlatılmasının ardından, solvent, polimer kütüphanesini içeren küvetlere aktarılarak 20 mg/mL'lik bir polimer konsantrasyonu elde edilir. Tüm solvent aktarıldığında, polimerin çözünmesi için bir ila beş dakika bekleyin. Polimerin tamamen çözündüğünden ve proteinlerin homojen şekilde dağıldığından emin olmak için ardından isteğe bağlı olarak bir sendikasyon işlemi uygulayın.

Ardından, LabVIEW'de numune transfer programını başlatın. Kütüphanedeki çözünmüş her bir polimer numunesi boş şırıngaya çekilir ve numune tutucudaki karşılık gelen çözücü olmayan solvent tüpüne aktarılır. Her bir numune transfer edildikten sonra, nanopartikül kütüphanesi 10 mmHg vakum altındaki bir vakum kamarasına yerleştirilerek veya solvent tamamen uzaklaştırılana kadar vakum filtrasyonu uygulanarak protein yüklü nanopartikülleri geri kazanın.

Kapsüllenmiş BSA'nın salınımını incelemek için, plakadaki her iki komşu sütunun her bir kuyruk duvarının üst yarım inçlik kısmının çıkarılmasıyla modifiye edilmiş derin 96 kuyucuklu polipropilen plaka ile başlayın. A ve B, C ve D, E ve F ve G ve H sütunları arasındaki her bir kuyucuğun üst kısmının çıkarılması, tam hacim transferiyle doldurulduğunda her bir bitişik kuyucuk çifti arasında sıvı akışına izin verir. 1000 ila 10 mikrogram/mL aralığındaki Texas red BSA standartlarını derin 96 kuyucuklu plakaya ekleyin.

Bunlar, protein miktarını hesaplamak için kullanılacak ve aynı zamanda florokrom sönümlenmesini hesaba katacaktır; istenen kütledeki nanoparçacıkları PBS tamponu içinde yeniden çözünür hale getirin ve ardından parçacıkları homojen şekilde dağıtmak için sonikasyona tabi tutun. Ardından, nanoparçacık kütüphanesini derin 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve örneklerin kuyucuk plakasının dibine çökmesini bekleyin. Sonra, bir pipet kullanarak tüm bitişik kuyucukları, kuyucuk tepesinden yaklaşık bir dörtte bir inç mesafe kalana kadar yavaşça PBS tamponu ile doldurun.

Kuyucuklar arasında serbest akış sağlanabilmesi için bitişik kuyucuklarda yeterli miktarda tampon çözelti bulunmalıdır. Ardından, salım plakası kapakla kapatılmalı ve ajitasyon altında 37 °C'ye yerleştirilmelidir. Deney süresi boyunca belirlenen zaman aralıklarında, uygun eksitasyon, lazer ve emisyon filtrelerini kullanarak plakayı taramak için 9, 400 Typhoon flatbed floresan tarayıcı kullanın.

Tarama işleminin ardından, her bir salınımdaki salınan florokrom konjuge protein miktarını belirlemek için görüntü kantifikasyon yazılımı kullanın. Polimer kimyasının bir fonksiyonu olarak protein salınım kinetiğini belirlemek amacıyla, bu videoda açıklandığı üzere SA ve CPH monomerlerinden sentezlenen bir polimer nanoparçacık kütüphanesine Texas Red BSA kapsüllendi. Protein yüklü nanoparçacıklar 37 °C'de bir ay boyunca inkübe edildi ve bu süre zarfında protein salınımının kantifikasyonu için artımlı zaman noktalarında floresan taramalar gerçekleştirildi.

Burada gösterildiği gibi, A-C-P-H-S-A polianhidrit nanopartikül kütüphanesinden Texas Red BSA salınım kinetiğini belirlemek için bu hidro çıkış yöntemi kullanılmıştır. Sarich film kimyalarıyla artan salınım hızları ile kimyaya bağlı eğilimler gözlemlenmiştir. Standart protein kantifikasyon analizleri kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Ayrı bir deneyde, CPT CPH Polianhidrit Film Kütüphanelerinden Texas Red BSA salınımı burada gösterildiği şekilde değerlendirilmiş ve sıfıra yakın dereceli salınım kinetiği gözlemlenmiştir; proteinin en hızlı salındığı cpeg zengin filmler, tıbbi alanda biyobozunur ilaç iletim cihazları olarak potansiyel uygulama alanlarına sahiptir. Bu sonuçlar, terapötik bir ilacın veya aşı antijeninin istenen salınım profilinin, polimer kimyası değiştirilerek kontrol edilebileceğini göstermektedir. Bu prosedürün ardından protein stabilitesi, hücresel toksisite, hücresel aktivasyon ve InVivo biyodağılım gibi alanları araştırmak için diğer kombinatoryal yöntemler geliştirilmiştir.

Bu hususlar, ilaç iletimi ve doku mühendisliği için biyomalzemelerin rasyonel tasarımı açısından önemlidir. Bu protokolün tamamı boyunca uygun KKD kullanmayı ve güvenli laboratuvar prosedürlerini uygulamayı unutmayın.