Name: Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Keşfedin biyobozunur polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerinin kombinatoryal sentezi ve yüksek verimli protein salınımı tespiti yöntemini. Bu teknik ilaç dağıtımı ve doku mühendisliği için biyomalzeme geliştirmede kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mali destek için ONR-MURI Ödülü (NN00014-06-1-1176) ve US Army Medical Research ve Materyal Komutanlığı (Hibe No W81XWH-10-1-0806) kabul etmektesiniz. Bu malzeme Hibe sayılı AET 0552584 ve 0851519 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma dayanır.

1. Kombinatoryel Polimer Kütüphane Sentezi (Polimer Kimyası Değişen) - Robotik Kurulum için Şekil 1&#39;e bakınız <ol><li> Uygun bir çözücü (konsantrasyon = 25 mg / ml) her bir monomer çözülür ve bir 10cc gaz geçirmez şırınga içine her bir yük. </li><li> Her bir şırınga sonuna kadar çözücü dirençli yem kilit kılcal tüpler takın. </li><li> Şırınga pompaları (New Era Programlanabilir Şırınga Pompaları) üzerinde şırınga yerleştirin ve yerine kilitleyin. </li><li> Başlangıç ​​pozisyonuna lineer aktüatörler (Zaber) ayarlayın. </li><li> Halka standı kelepçeler kullanarak, monomer birikim için / de başlayan şişenin içine kılcal tüpler hem sonuna yerleştirin. </li><li> Her hangi sıra istenilen kopolimer bileşimi bağlı olarak pompalar her monomer değişken hacimler LabVIEW programı, başlatın. Bu, istenen hacim dağıtmak için, şişeyi / iyi ve daha sonra her bir pompa içine kılcal tüpler düşürmek için Z ekseni çalıştırıcı tarafından talimat programı ile elde edilir. Next, program / de sonraki flakon konuma taşımak onun ev konumu ve X ve Y-aktüatörler dönmek için Z-aktüatör bildirir. Her bir kuyucuğa monomer istenen hacmi içine tevdi kadar bu gerçekleştirilir. </li><li> Monomer çökelme sonra, çok iyi bir ya da çok-vial monomer kütüphane Önceden ısıtılmış bir vakumlu fırın transfer edilir ve yoğunlaşma polimerizasyon tepkime süresi boyunca vakum altında inkübe edildi. Için CPH: SA 1.5 saat için sentez reaksiyon 180 yürütülür ° C de, 0.3 torr, ancak bunlar reaksiyon koşullarında farklı polimer sistemleri arasında değişir. </li></ol> 2. Kombinatorik Boş ve Protein yüklü Polimer Nanopartikül ve Film Kütüphanesi İmalat - Robotik Kurulum için Şekil 1&#39;e bakınız <ol><li> Birinci programlanabilir şırınga pompası, şırınga, bir çözücü ile doldurulmuş (boş kütüphane) veya protein ile bir çözücü ikinci enjektör içinde enjektör iken (Protein yüklü kütüphane) içinde dağılırPompa boş bırakılır. Bitişik numune tutucu içinde nanoparçacık imalatı için tüpler olmayan çözücü ile doldurulur (olmayan çözücü ile çözücü oranı 1 100). Filmin imalatı için bir boş çok-plaka bitişik numune tutucu içindeki tüpler yerine kullanılmaktadır. </li><li> LabVIEW programı kullanarak, çözücü kütüphanenin her şişe polimer / kuyucuk (konsantrasyon = 20 mg / ml) içine tevdi ve 1-5 dakika için inkübe edilir. İsteğe bağlı sonication adım (40 Hz&#39;de 30 sn) tam polimer çözünmesi sağlamak için tanıttı olabilir. </li><li> Sonra, ayrı bir LabVIEW programı başlatarak, örnek boş enjektöre çekilir ve bitişik numune tutucu olmayan çözücü (nanopartiküller) veya boş kuyu (film) karşılık gelen bir tüp içine yatırılır. </li><li> Bu işlem, farklı polimer kütüphanesinin her bir bileşim için gerçekleştirilir. </li><li> Nanopartikül filmin veya kütüphane sonra çözücü ve çözücü olmayan çıkarılması (nanoparçacık Terazi için bir vakum odasına yerleştirilirry de) vakum filtrasyonu kullanılarak telafi edilebilir. </li></ol> 3. Yüksek throughput Protein Yayın Kinetiği <ol><li> , Bir polimer kütüphane yüksek verimli protein serbest bırakma kinetikleri araştırmak için bir 96 (2 ml / çukur) derin doldu, polipropilen levha değiştirilmiş öyle ki üst komşu sütun iyi duvar 1/3 &#39;(örn: A ve B, C ve D, E, F, G ve H) kuyulara bitişik için alınır. Protein yüklü filmlerde fabrikasyon veya nanopartiküller high-throughput sürüm kinetiği çalışmaları gerçekleştirmek için bu plaka içine aktarılması gerekir. Protein yüklü nanoparçacık veya film örnekleri sadece bitişik sütunları (: A, C, E ve G ex) çok iyi birine yerleştirilmelidir. Ayrıntılar için Şekil 4&#39;e bakın. </li><li> 96 derin dolmuştu release plaka nanoparçacıkların devrinden sonra, parçacıkların yerleşmek için izin verilir. PBS tamponu (0.1 mM, pH 7.4) her biri yavaş yavaş komşu sıra (kolon B, D, sonra da her bir numuneye eklenir (kolon A, C, E ve G) ve bir, F ve H) kuyu tam ve tampon bitişik kuyu arasında serbest akışlı olana kadar. Nanopartiküller, bu süreç, parçacıkların numunenin alt sıra (kolon A, C, E ve G) ve bitişik serbest bırakma aktarılır değil de (kolon B, D, F kalmasını sağlamak için ilave dikkatli bir şekilde yapılması gerekmektedir , ve H). Bazı durumlarda, santrifüjleme (kolon A, C, E ve G) &#39;de örnek altındaki nanoparçacık örnekleri tespit etmek için gereklidir. </li><li> Daha sonra, serbest bırakma plaka bir kapak ile kapatılmış ve deney süresi boyunca ajitasyon altında istenen sıcaklıkta (örn. 37 ° C) yerleştirilir. </li><li> Artan zaman noktalarında (yani 0.04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, ve 30 gün) &#39;de açıklanması florokrom-konjuge protein miktarı, bir tayfun 9.400 Düz Floresan tarayıcı (kullanarak ölçülür GE Healthcare). Salma plakasını tarayıcı yüzeyine yerleştirilir, uygun uyarma lazer ve emisyon filte kullanılarak tarananrs ve serbest kuyular (sütun B, D, F ve H) (Görüntü Quant) ölçülür yılında yayımlanan proteinin floresan yoğunluğu. Bilindiği konsantrasyonlarda protein standartları florokrom söndürülmesi için protein miktarı ve muhasebe hesaplanması için plaka dahil edilmesi önerilmektedir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Polimer kütüphane imalat üzerine, karakterizasyonu kombinatoryal yöntemi 1,7,8,11 doğrulamak için 1H NMR, GPC ve FTIR ile yürütülmektedir. 10,000-20,000 Moleküler ağırlık aralığı g / mol, polidispersite indeksi aralıkları 1.5-3.0 dan, ve kimyasal bileşim doğru ve polianhidrid sentez 12-15 için geleneksel yöntemler ile uyum içinde olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, nanopartiküller kütüphanelerin SEM görüntüleri benzeri bir yüzey morfolojisi, boyut ve geleneksel olarak imal edilmiş nanopartiküller 2&#39;ye kadar boyut dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Protein serbest kinetipolianhidrid veya nanopartiküller filmler Cs daha önce tarif edildiği gibi 1 modifiye edilmiş bir plaka içinde gerçekleştirilir. Elde edilen sonuçlar ile birlikte ya da protein yükleme ve polimer kimyası (Şekil 2 ve 3) 1,12,14,16 bağlı olarak bir çoğuşma olmaksızın, yaklaşık sıfır dereceden bir salınma saptandı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Şekil 1. Kombinatorik polimer film ve nanoparçacık üretim cihazları. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Şekil 2 CPH albümin Texas Red sığır serumu (TRBSA) Yüksek throughput sürümü:. SA polimer nanoparçacık kütüphanesi. CPH zengin polimer kimyaları yavaş bırakın ise SA-zengin polimer kimyası, en hızlı TRBSA kapsüllü bırakın. Hata çubukları standart sapma temsiltion ve n = 4. Petersen ve arkadaşları izni ile yayımlanmaktadır. ark. 1. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Şekil 3 CPTEG albümin Texas Red sığır serumu (TRBSA) Yüksek throughput sürümü:. CPH polimer film kütüphanesi. CPH zengin polimer kimyaları yavaş serbest iken CPTEG zengin polimer kimyası, en hızlı TRBSA kapsüllü bırakın. Hata çubukları standart sapma ve n = 3 temsil eder. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Şekil 4. &quot;Önce&quot; İki komşu kuyu gösteren resim ve 96 derin dolmuştu polipropilen plaka &quot;sonra&quot; değişiklik. Sağdaki &quot;sonra&quot; değişiklik dosyasını da kapsüllü floresan molekülü ile bir polimer film (sol kuyunun alt) ek gösteriyorBir tampon çözelti içine iki kuyu arasındaki serbest bırakılması. Serbest floresan molekül ardından sıra sağ algılanır.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Gerekli sentez koşulları ve sentezlendiği polimerlerin cam geçiş sıcaklığı (T g s) bilgisi kütüphane üretimi için gereklidir. T g s oda sıcaklığının altında olması durumunda, nanoparçacık imalat adımı polimerlerin T g altında bir sıcaklık kontrollü bir ortamda gerçekleştirilebilir gerekebilir. Ayrıca, dikkatli yüksek sıcaklık ve solvent ile temas tüm ekipmanların bu koşullar işlemek için uygun olmalıdır sağlamak için alınmalıdır. Bu protokol parametrelerini çeşitli sentez ya da parçacık ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Motorlu XYZ Aşama: 3x T-LSM050A, eksen başına 50 mm seyahat </td><td> Zaber Teknolojileri </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> KD-1000 Tek Şırınga Pompası </td><td> New Era Pompa Sistemleri </td><td> KD-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Çerçevesiz Yeniden Cam Kültür Tüpler </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Cam küvetler </td><td> Bilimsel Stratejileri </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE Gaz Geçirmez Şırınga, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 derin kuyucuklu plakalar 1.3 ml ve 2.0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Peki kap paspaslar </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Typhoon 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Sınıf 50 Çemberleri 90 mm </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

kombinatorik sentezi ve polimer film ve nanoparçacık kütüphaneler gelen yüksek throughput protein yayın

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides mükemmel biyouyumluluk ve ilaç dağıtım yetenekleri ile biyomalzemelerin bir sınıf vardır. Onlar ile kapsamlı araştırmalar yapılmış olsa da, geleneksel tek-örnek-bir-zamanda sentez teknikleri, daha yeni high-throughput yaklaşım polyanhydrides 1 büyük kütüphaneler sentez ve test edilmesi için geliştirilmiştir. Bu daha verimli optimizasyon ve ilaç ve aşı dağıtım uygulamaları için bu biyomalzemelerin tasarım süreci kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada yöntem biyolojik polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerin kombinatoryal sentezi ve bu kütüphanelerin protein serbest high-throughput algılama anlatılmaktadır. Bu robot ameliyat yöntemi (Şekil 1), lineer aktüatörler ve şırınga pompaları kullanıcı hatası ortadan kaldırarak, bir hands-free otomatik protokolü sağlayan LabVIEW, tarafından kontrol edilir. Dahası, bu yöntem, mikro ölçekte polimer kütüphanelerinin hızlı üretim, kırmızı sağlarmultivaryan polimer sistemlerinin kurulması ile sonuçlanan süre toplu iş boyutu ucing. Bu polimer sentezi için kombinatoryal yaklaşım geleneksel olarak bir polimer sentezlemek için alacağı zaman eşdeğer bir miktar içinde 15 farklı polimer kadar sentezini kolaylaştırır. Buna ek olarak, kombinatoryal polimer kütüphanesi (nanopartiküller için) olmayan bir çözücü içinde ya da vakum kurutma (filmleri için) bir çözücü ile çökeltme olarak polimer film ya da kütüphane çözünme üzerine boş veya nano partiküller içeren protein yüklü geometrilere imal edilebilir. Polimer kütüphaneler içine bir florokrom-konjuge protein yükleme sonra, protein serbest bırakma kinetikleri daha önce tarif edildiği gibi 1, bir floresan merkezli tespit yöntemi, (Şekil 2 ve 3) kullanılarak yüksek işlem de tespit edilebilir. Bu kombinatoryal platformu geleneksel yöntemlerle valide edilmiş 2 ve polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphaneler ile karakterize edilmiştir <sup&gt; 1 H NMR ve FTIR. In vitro hücresel toksisite, sitokin üretimi, yüzey işaretleyici ifade, yapışması, çoğalması ve farklılaşması;; kütüphaneler proteini serbest kinetiği, istikrar ve antijeniteye için elemeden geçirildi ve in vivo biyodağılımını ve mucoadhesion 1-11. Burada geliştirilen kombinatoryal yöntem, sırayla, biyomalzeme performansın optimizasyonu için in vitro ve in vivo olarak taranması için protein yüklü nanopartikül filmin ve kütüphanelerinin yüksek verimli polimer sentezi ve imalatı mümkün kılar.

Bu yöntem biyolojik polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerin kombinatoryal sentezi ve bu kütüphanelerin protein serbest high-throughput algılama anlatılmaktadır.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Polianhidritler, mükemmel biyouyumluluğa ve ilaç iletim kapasitelerine sahip bir biyomalzeme sınıfıdır. ... ile kapsamlı bir şekilde çalışılmış olsalar da...

Bu video, biyobozunur polianhidrit film ve nanoparçacık kütüphanelerinin kombinatoryal sentezini ve bu kütüphanelerden protein salınımının yüksek verimli tespitini açıklamaktadır. İlk olarak, kompozisyonel olarak çeşitli monomer dizilerini cam küvetlere yerleştirmek için yüksek verimli bir otomatik biriktirme düzeneği kullanılır. Polikondenzasyon reaksiyonu 180 °C ve 0.3 tor basınç altında 1.5 saat boyunca gerçekleştirilir.Bu reaksiyon koşulları, C-P-H-S-A polianhidrit polimer sentezine özgüdür. Otomatik biriktirme aparatı kullanılarak, solvent ve enkapsülasyon için gerekli tüm bileşenler, polimer kütüphanesini içeren küvetlere aktarılır. Polimerin tamamen çözünmesini ve ek bileşenlerin homojen dağılımını sağlamak için sonikasyon uygulanabilir.Ardından, nanoopresipitasyon yoluyla nanopartikül kütüphanesi oluşturmak için çözünmüş polimer, bir çözücü olmayan solvent tüpüne aktarılır. Nanopartiküller vakumla kurutma veya filtrasyon yoluyla geri kazanılır ve ardından modifiye edilmiş 96 kuyucuklu bir salım plakasına aktarılır. Son olarak, protein yüklü kütüphane fizyolojik koşullar altında inkübe edilir ve protein salım kinetikleri floresan uzay tespit yöntemi kullanılarak değerlendirilir.Nihayetinde, protein salınım kinetiğinin polimer özellikleri veya salınım ortamı koşullarının bir fonksiyonu olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yaklaşımın, her seferinde tek bir örneğin incelendiği diğer geleneksel tekniklere göre temel avantajı, çok sayıda örneğin eş zamanlı olarak sentezlenebilmesidir. Bu örnekler daha sonra protein-polimer, hücre-polimer veya konakçı-polimer etkileşimleri açısından yüksek verimlilikle taranabilir.Bu durum, ilaç iletimi ve doku mühendisliği için bu biyomalzemelerin rasyonel tasarımını ve geliştirilmesini hızlandırır. Prosedürü, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan La Tricia Peterson gösterecek. Videonun bu bölümünde, polimer sentezini takiben kompozisyonel olarak değişken bir monomer kütüphanesi oluşturmak için yüksek verimli bir biriktirme düzeneği kullanılmaktadır.Bu düzenek, boş veya protein yüklü polimer filmlerden veya nanopartiküllerden oluşan kombinatoryal bir kütüphane oluşturmak için kullanılır. Otomatik platform, bir bilgisayara seri olarak bağlı iki programlanabilir şırınga pompası ve üç lineer aktüatörden oluşmaktadır. Şırınga pompalarına ve aktüatörlere komut göndermek için LabVIEW yazılımı kullanılır.10 cc gaz sızdırmaz şırıngalar, polimer çözeltilerini cam küvetlere aktaran luer lock bağlantılı metal kapiler tüplerle birlikte şırınga pompalarına yerleştirilir. Bu gösterimde, Texas Red işaretli sığır serum albüminini enkapsüle eden bir nanopartikül kütüphanesi oluşturmak için sebasik asit (SA) ve 1,6-bis(p-karboksifenil)hekzan (CPH) kullanılacaktır. Bu videodaki talimatlar ve beraberindeki belgeler, çok çeşitli polimer film ve nanopartikül kütüphaneleri üretmek ve test etmek için uyarlanabilir.Kütüphaneleri sentezlemek için, her bir monomeri bir cam şişe içerisinde kloroform ile 25 mg/mL nihai konsantrasyonda çözerek başlayın. Ardından, çözeltiyi şırınganın luer lock ucundan aspire ederek her bir çözeltiyi 10 cc sızdırmaz şırıngaya yükleyin. Varsa hava kabarcıklarını giderin.Ardından, çözücüye dayanıklı lure lock paslanmaz çelik kapiler tüpü şırınganın ucuna takın. Kapiler tüpleri klemplerle sabitleyip bir ring standa tutturun. Daha sonra, her iki kapiler tüpün ucunu başlangıç kuyucuğuna yerleştirin.Monomer biriktirme işlemi için şırıngaları programlanabilir şırınga pompalarına yerleştirin ve LabVIEW yazılımında konumlarını sabitleyin. Yazılım üzerinden lineer aktüatörleri başlangıç konumuna getirin.SA ve CPH monomerlerinin x, y ve Z eksenlerindeki cam küvetlere otomatik birikimini başlatın. Aktüatörler, kapiler tüpleri her bir küvete uygun şekilde yerleştirecek ve programlanmış monomer hacimlerini tüplerin içine pompalayarak bileşimsel olarak farklı bir monomer kütüphanesi oluşturacaktır. Monomer birikimini takiben.Kondenzasyon polimerizasyonunu gerçekleştirmek için monomer kütüphanesini önceden ısıtılmış bir vakum fırınına aktarın ve 180 °C ve 0.3 tour değerlerinde 1,5 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından polimer kütüphanesinin üretimi tamamlanmış olur. Ardından protein yüklü polimer nanopartiküller oluşturulur.Protein yüklü bir nanoparçacık kütüphanesi hazırlamak için protein yüklü polimer film kütüphanesi hazırlama ile ilgili ek protokole bakınız. Bu durumda proteini, yani Texas red sığır serum albümini'ni, polimer kütüphanesini çözebilecek uygun bir çözücüye ekleyin. Burada, iki miligram/mililitre konsantrasyonda metilen klorür kullanılmıştır.10 cc'lik şırıngayı Texas Red BSA içeren çözücü ile doldurun ve birinci şırınga pompasına yerleştirin. Ardından, temiz ve boş iki cc'lik bir şırıngayı ikinci şırınga pompasına yerleştirin; vial platformunun yanındaki tüp tutucuya, içinde 15 mililitre çözücü olmayan bir madde (bu durumda pentan) bulunan tüpleri yerleştirin. Son olarak, lab view yazılımında programı seçerek otomatik çözücü biriktirme işlemini başlatın.Programın başlatılmasının ardından, solvent, polimer kütüphanesini içeren küvetlere aktarılarak 20 mg/mL'lik bir polimer konsantrasyonu elde edilir. Tüm solvent aktarıldığında, polimerin çözünmesi için bir ila beş dakika bekleyin. Polimerin tamamen çözündüğünden ve proteinlerin homojen şekilde dağıldığından emin olmak için ardından isteğe bağlı olarak bir sendikasyon işlemi uygulayın.Ardından, LabVIEW'de numune transfer programını başlatın. Kütüphanedeki çözünmüş her bir polimer numunesi boş şırıngaya çekilir ve numune tutucudaki karşılık gelen çözücü olmayan solvent tüpüne aktarılır. Her bir numune transfer edildikten sonra, nanopartikül kütüphanesi 10 mmHg vakum altındaki bir vakum kamarasına yerleştirilerek veya solvent tamamen uzaklaştırılana kadar vakum filtrasyonu uygulanarak protein yüklü nanopartikülleri geri kazanın.Kapsüllenmiş BSA'nın salınımını incelemek için, plakadaki her iki komşu sütunun her bir kuyruk duvarının üst yarım inçlik kısmının çıkarılmasıyla modifiye edilmiş derin 96 kuyucuklu polipropilen plaka ile başlayın. A ve B, C ve D, E ve F ve G ve H sütunları arasındaki her bir kuyucuğun üst kısmının çıkarılması, tam hacim transferiyle doldurulduğunda her bir bitişik kuyucuk çifti arasında sıvı akışına izin verir. 1000 ila 10 mikrogram/mL aralığındaki Texas red BSA standartlarını derin 96 kuyucuklu plakaya ekleyin.Bunlar, protein miktarını hesaplamak için kullanılacak ve aynı zamanda florokrom sönümlenmesini hesaba katacaktır; istenen kütledeki nanoparçacıkları PBS tamponu içinde yeniden çözünür hale getirin ve ardından parçacıkları homojen şekilde dağıtmak için sonikasyona tabi tutun. Ardından, nanoparçacık kütüphanesini derin 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve örneklerin kuyucuk plakasının dibine çökmesini bekleyin. Sonra, bir pipet kullanarak tüm bitişik kuyucukları, kuyucuk tepesinden yaklaşık bir dörtte bir inç mesafe kalana kadar yavaşça PBS tamponu ile doldurun.Kuyucuklar arasında serbest akış sağlanabilmesi için bitişik kuyucuklarda yeterli miktarda tampon çözelti bulunmalıdır. Ardından, salım plakası kapakla kapatılmalı ve ajitasyon altında 37 °C'ye yerleştirilmelidir. Deney süresi boyunca belirlenen zaman aralıklarında, uygun eksitasyon, lazer ve emisyon filtrelerini kullanarak plakayı taramak için 9, 400 Typhoon flatbed floresan tarayıcı kullanın.Tarama işleminin ardından, her bir salınımdaki salınan florokrom konjuge protein miktarını belirlemek için görüntü kantifikasyon yazılımı kullanın. Polimer kimyasının bir fonksiyonu olarak protein salınım kinetiğini belirlemek amacıyla, bu videoda açıklandığı üzere SA ve CPH monomerlerinden sentezlenen bir polimer nanoparçacık kütüphanesine Texas Red BSA kapsüllendi. Protein yüklü nanoparçacıklar 37 °C'de bir ay boyunca inkübe edildi ve bu süre zarfında protein salınımının kantifikasyonu için artımlı zaman noktalarında floresan taramalar gerçekleştirildi.Burada gösterildiği gibi, A-C-P-H-S-A polianhidrit nanopartikül kütüphanesinden Texas Red BSA salınım kinetiğini belirlemek için bu hidro çıkış yöntemi kullanılmıştır. Sarich film kimyalarıyla artan salınım hızları ile kimyaya bağlı eğilimler gözlemlenmiştir. Standart protein kantifikasyon analizleri kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmiştir.Ayrı bir deneyde, CPT CPH Polianhidrit Film Kütüphanelerinden Texas Red BSA salınımı burada gösterildiği şekilde değerlendirilmiş ve sıfıra yakın dereceli salınım kinetiği gözlemlenmiştir; proteinin en hızlı salındığı cpeg zengin filmler, tıbbi alanda biyobozunur ilaç iletim cihazları olarak potansiyel uygulama alanlarına sahiptir. Bu sonuçlar, terapötik bir ilacın veya aşı antijeninin istenen salınım profilinin, polimer kimyası değiştirilerek kontrol edilebileceğini göstermektedir. Bu prosedürün ardından protein stabilitesi, hücresel toksisite, hücresel aktivasyon ve InVivo biyodağılım gibi alanları araştırmak için diğer kombinatoryal yöntemler geliştirilmiştir.Bu hususlar, ilaç iletimi ve doku mühendisliği için biyomalzemelerin rasyonel tasarımı açısından önemlidir. Bu protokolün tamamı boyunca uygun KKD kullanmayı ve güvenli laboratuvar prosedürlerini uygulamayı unutmayın.

combinatorial-synthesis-high-throughput-protein-release-from-polymer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir çip üzerinde fotopolimerizasyon tekniği kullanılarak bir polimer mikro oluşumu açıklaması. Atomik kuvvet mikroskobu, temas açısı ölçümleri, X-ışını fotoelektron spektroskopisi ve uçuş ikincil iyon kütle spektrometresi ve hücre bağlanma testinin zaman kullanarak yüksek aktarım yüzey karakterizasyonu da açıklanmıştır.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Bu makale, yüksek bir verim yöntemi antijen sunan hücreler üzerinde belirli reseptörlerine yönelik olarak kullanım için polianhidrid Nanopartiküllerin yüzeyine oligosaccharidler ve ekin sentezi için sunulmuştur.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Şablon ücretsiz zeminler üzerine makroskobik nanoparçacık-ligand tek katmanlı filmler işlevselleştirmek ve kendine monte Basit, sağlam ve ölçeklenebilir tekniği bu protokol açıklanmıştır.

Şablon-ücretsiz Substratlarm üzerine makroskobik Nanoparçacık-ligand tabakalı Filmler işlevselleştirmek ve Öz-montajı A Tekniği

Çeşitli polimer kapsüllenmiş metal nanopartikül türlerini "homo-" ve "ko-polimerler" oluşan uzun zincirlere "polimerize etmek" için protokoller rapor ediyoruz.

Polistiren kullanma<em&gt; Bloğu</em&gt; -poli (Akrilik asit) Bunların homo- ve ko-polimerizasyon için monomer olarak metal Nanopartiküller -kaplı

Sigara karıştırıldı çökelti polimerizasyonu uyaranlara duyarlı poli (N -isopropylacrylamide) dar bir boyut dağılımı mikrojelleri sentezi için hızlı, kopyalanabilir bir prototip bir yaklaşım sağlar. Bu protokol sentezinde, ışık saçılması karakterizasyonu ve geniş alan mikroskopisi kurulumunda bu mikrojellerin tek parçacık floresan izleme gösterilmiştir.

Kontrollü Sentezi ve yüksek Düzgün Poli Floresan Takibi (<em&gt; K</em&gt; -isopropylacrylamide) Mikrojeller

Nanomalzemeler çok yönlü kontrollü tedavi teslimat temel bilim ve çevirim uygulamalar için mekanizmalar kullanır, ancak onların imalat kez en Biyomedikal laboratuvarlarda kullanılamaz uzmanlık gerektirir. Burada, iletişim kuralları ölçeklenebilir imalat ve terapötik flash nanoprecipitation kullanarak çeşitli kendi kendine monte nanocarriers yüklenmesini için mevcut.

Ölçeklenebilir, Hızlı montaj ve biyoaktif proteinler ve Immunostimulants yükleme yolu ile birden parlamak Nanoprecipitation çeşitli sentetik Nanocarriers içine

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Nanojeller, biyolojik maddelerin verilmesi için mükemmel ve çok yönlü bir nanoparçacık platformudur. Protein bazlı yükleri kapsülleyebilen uyaranlara duyarlı poli (etilen) glikol bazlı polimerik nano jeller, sulu koşullarda tek aşamalı çapraz bağlama ko-nanopolimerizasyon stratejisi kullanılarak sentezlendi. Bu yeni nanopartiküllerin optimal üretimi ve karakterizasyonu burada sunulmaktadır.

Sulu Tek Adımlı Çapraz Bağlama ve Ko-nanopolimerizasyon Kullanılarak Uyaranlara Duyarlı Nanojellerin Sentezi

Burada, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını harici bir sıvı faza ihtiyaç duymadan makro ölçekli hidrojel matrislerine gömmek için iki protokol sunuyoruz.

Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri

Yağda su emülsiyonlarında (tapalar) kombinatoryal kütüphanelerin üretimi için polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı iki katmanlı bir cihazın imalatı burada sunulmaktadır. Fiş üretimini otomatikleştirmek için gerekli donanım ve yazılım protokolde detaylandırılmıştır ve kantitatif bir floresan fiş kütüphanesinin üretimi de gösterilmiştir.

Kombinatoryal Fiş Üretimi için İki Katmanlı Mikroakışkan Cihaz

Keşfedin biyobozunur polianhidrid film ve nanoparçacık kütüphanelerinin kombinatoryal sentezi ve yüksek verimli protein salınımı tespiti yöntemini. Bu teknik ilaç dağıtımı ve doku mühendisliği için biyomalzeme geliştirmede kullanılır.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Daha fazla video keşfet