Name: Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları 18 O-zenginleştirilmiş Su (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, 18O-zenginleştirilmiş su kullanarak protein sindirimlerinde stabil izotop etiketleme yöntemlerini. Proteaz destekli ve asit katalizli iş akışları, kantitatif ve kalitatif proteomik çalışmalar için etkili araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796 tarafından desteklenmiştir.

Sunulan Leo-iş akışları protein izotop etiketleme sindirir ve sentetik peptidler için izin verir. Bu zaman süreci deneyler (Şekil 1) ve kantitatif proteomikler karşılaştırmalı çalışmalar gibi proteaz araştırma için de geçerlidir. Her iş akışı iki deneysel adımlar (Şekil 2) oluşur: A) ilgili 18 O-izotop kodlanmış reaksiyonu (proteaz-katalizli peptid bölünme karar örnekleme zamanı; proteaz-katalizli karboksil oksijen alışverişi reaksiyonu; asit katalizörlü karboksil oksijen alışverişi kütle spektrometresi ve 18 O-birleşme kinetiği grafiksel gösterimi ile reaksiyonu) ve B) analizi. A. timecourse Deneyler I. Paleo-timecourse: proteolitik dilinimleri of Proteaz-katalizli etiketleme <ol><li> (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır25 mM NH4 50, 30 dakika süre ile inkübasyonu ile HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) ° C. </li><li> (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla. </li><li> Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein örneklerinin için tamponlar alışverişinde peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri (Sartorius) için PepClean C-18 sıkma sütunlar (Termo) kullanın. </li><li> / Çözülür değiş tokuş peptitler / 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz proteinler (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5.5; tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) ile 1:1 (v / v) nihai H 2 içeren 18 O (% 95, Sigma IsoTec). </li><li> Önceki proteaz ilave olarak bir sıfır zaman noktası numune alımı için: Karışım reaksiyon karışımının 0.5 ul, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamikmatris asit (% 50 asetonitril içinde 10 mg / ml,% 0.1 TFA). Opti bir MALDI-TOF 384 hedef plaka (AB Sciex) üzerinde Noktası numune ve oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakmak kuruyana kadar (yaklaşık 5 dakika). </li><li> Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta:;: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM tripsin 75 nM ECE-1) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve kontrol örneği olarak hizmet verecek. Birinci kısım proteaz-katalize 18 O-etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve proteolitik bölünme reaksiyonları peptid ve protein tespiti, proteolitik etkinlikler tespit edilmesi ve izlenmesi için de kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz neden olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, ne etiket veya dilinim Bu örnek için bekleniyor. </li><li> Reaksiyon çözeltisi kısmı kaldırılması ve des olarak lekelenme ile reaksiyon takipzaman aralıklarında 5. adımı altında açıklanan şekilde değiştirin kadar formda görünüyor. Yukarıda tarif edilen reaksiyon koşulları, en fazla dört günde (yaklaşık 24 noktası) için bir proteolitik reaksiyon izlemek için kullanılır. 30 dk kadar her 5 dk örnekleme başlayın, sonra 4 gün kadar 8 saat ve her 8 saat kadar sonra 2 saat kadar her 30 dakikada, her saat nokta. Parçalanma ürünleri ilk 12 saat içinde gösterilecektir ve alt tabaka 24 saat sonra tamamen hidrolize olması gerekir. Genişletilmiş reaksiyon inkübasyon sürelerinde daha işlenir reaksiyon ara, ayrık olan stabil reaksiyon ürünleri tanımlamak için izin verir. Lekelenme süreleri ve inkübasyon sıcaklığı optimal reaksiyon örnekleme sağlamak için modülasyonlu olması, araştırma sorusu ve verilen enzim-substrat çiftleri üzerinde var olarak. </li><li> Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi uzun lekelenme aralıkları arasında, MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra. </li></ol> II. Paleo-timecourse: Postdigproteolitik terminallerinin estion etiketleme <ol><li> (İsteğe bağlı) proteinleri (10 uM) ve peptidler (250 uM), disülfür bağlarıyla 50 ° C&#39;de 30 dakika inkübasyon ile 25 mM NH 4 HCO 3 (her ikisi de taze hazırlanmış) içinde DTT (nihai konsantrasyon 2.5 mM) ile azaltılır </li><li> (İsteğe bağlı) Serbest sistein iodoacetamide ile alkile edilir (nihai konsantrasyon 10 mM) 25 mM NH 4 HCO3 karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için inkübasyon yoluyla. </li><li> Ilgi proteaz bağlı olarak, protein / peptid çözümleri artık tampon ve alkilleme ajanı çıkarmak için temizlenmiş olması gerekir. Protein tampon degişimi peptid temizleme ve Vivaspin Santrifüj Konsantratörleri için PepClean C-18 sıkma sütunları kullanın. </li><li> Çözülür / temizlenmiş peptid ürünler / proteinler 20 ul proteaz reaksiyon tamponu içinde (örneğin tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) değişimi (örn. tripsin tamamlanması için ilgi proteaz ve özeti: 0.04 nM; 37 ° C, 12 saat). </li><li> PepClean C-18 sıkma sütunlarla Temizleme parçalanma ürünleri. Bu adım, kalan proteaz aktiviteleri ortadan kaldıracaktır. </li><li> Çözülür / (tripsin: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8.0) 20 ul reaksiyon tamponu içinde proteaz temizlenmiş peptid ürün değişiminde 1:1 (v / v) nihai H 2. 18 O. içeren </li><li> Önceki enzimi eklenmeyen bir sıfır zaman noktası numune alımı için: reaksiyon karışımı, 0.5 ul alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) Karışımı 0.5 ul. MALDI bir hedef plaka üzerinde Noktası numune ve (yaklaşık 5 dak) kuru kadar oda sıcaklığında çözücü damlacıkları bırakın. </li><li> Iki kısım halinde reaksiyon çözeltisi bölme. Özellikle enzim için oda sıcaklığında ya da tavsiye edilen sıcaklıkta: birinci kısım ilgi proteaz (0.04 nM örneğin, tripsin) ile inkübe edilir. İkinci kısım proteaz olmadan inkübe edilecek ve bir kontrol olarak hizmet verecek. Birincialikot proteaz katalize 18 O-postdigestion etiketleme için standart bir örneğini temsil eder ve peptid ve protein ölçümü için kullanılabilir. İkinci kısım 18 O-dahil proteaz tarafından katalize olduğunu göstermek için kullanılır, bu nedenle, hiçbir etiketleme için bu örnek bekleniyor. </li><li> Reaksiyon alikotları çıkarırken ve bunları adım 7 altında açıklanan tespit ederek tepki uygulayın.) Zaman aralıklarında kadar formda görünüyor. Örneğin, tripsin tarafından katalize karboksil oksijen alışverişi tepkisini izlemek için bundan sonra başlangıçta yukarı 30 dakika ve her 15 dakika için her 5 dk gördü. </li><li> Nihai reaksiyon zaman noktasında fark edilir ya da (B bölümü) aşağıda tarif edildiği gibi yakalama uzun aralıklar arasında da MALDI hedef plaka MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi ile gönderildikten sonra. </li></ol> III. Aleo-timecourse: karboksil gruplarının asit katalizörlü etiketleme <ol><li> 1:1 (v / v) t olarak 18 O-zenginleştirilmiş su ile tek tek peptidler (50 nM) inkübeo varlığında ya da% 0.1 yokluğunda (kontrol) (v / v) nihai trifluoroasetik asit (toplam hacim 30 ul). </li><li> Numune ile 48 gün süreyle günlük reaksiyon ürünlerinin doğrudan doğruya bir MALDI hedef üzerine alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit matris (10 mg /% 50 asetonitril ml,% 0.1 TFA) ve 0.5μl ile karışım 0.5 ul alikot eş-lekelenme plaka. </li><li> Lekelenme aralığında ve Bölüm B de aşağıda tarif edildiği gibi MALDI-TOF/TOF MS / MS analizi için MALDI hedef plaka sunmak nihai reaksiyon zaman noktasında tespit sonra </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Kütle spektrumları 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB Sciex) üzerinde elde edilir. </li><li> Önce analiz, enstrüman ± 50 ppm ve maç için altı tepe asgari sayıda azami kütlesi ölçüm hatası toleransı ile peptid standartları karışımı (AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Kiti) ile kalibre edilir. </li><li> MS spektrumları (kütle aralığı2,000 kabul edilebilir bir temel pik yoğunluğu aralığı ile adım büyüklüğü 50) - 45,000; 400 - 3.800 - 4.000 m / z) ayarlanabilir bir lazer yoğunluğu (3,400 pozitif iyon modunda kullanarak üç nüsha halinde elde edilir. Tek çekim 400 toplam çekim / spektrumu, alt-spektrumları amacıyla elde edilen, 800 alt-spektrumları sonra yürürlüğe girer koşulları durdurmak (geçmek veya başarısız) satın alınan veya 400 alt-spektrumları geçiş kabul kriterleri. Düşük miktarda numune halinde ya da kompleks biyolojik kökenli varlığında MS tespiti aralığının alt ucunun 800 m / z için yükseltilmiş olmalıdır. Buna ek olarak, LC ayrımı ile ya da yukarıda anlatıldığı gibi, bir örnek temizleme adımı ile tuz ve diğer müdahale bileşikleri çıkarmak için gerekli olabilir. </li><li> MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explorer veri toplama yazılımı ihraç ve spektral işleme ve pik algılama için MASCOT Distiller yazılımı (Matrix Bilimi) kullanır bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi, içine alınır. İzotopik zarflardeconvoluted ve otomatik olarak Mason et al. 12 tarafından tanımlanan ve grup 9 ile uyumlu bir benzer bir algoritma kullanılarak belirlenmiştir 18 O-birleşme oranını göstermektedir. Alternatif olarak, bu tür ZoomQuant 13 ve 14 engerek gibi yazılım araçları, hem de bu tür ticari yazılım paketleri BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) ve Maskot Distiller kantitasyonu Araç Kutusu gibi (Matrix Bilim) 18 O-tipi verileri 15,16 deconvolute yapabilirsiniz. 18 O-şirketleşme oranları (yani, 16 içeren peptidler bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları olarak ifade edilir O, tüm izotopik zarf ile 18 O ya da 1 18 O 2). </li><li> Her bir timecourse deney için, moleküler kütleleri ([M + H] +) tespit edilen tüm türlerin ilişkili peptid MS verileri ve dosyaları elde değerler 100 ppm kütle genişlikte binned birer. </li><li> Aen t üç [M + H] + bir depo doldurmak için gerekli ayarlanır. Bilinen substratlar olması halinde, kutu listesi filtrelenmiş EXPASY FindPept aracını 17 (kullanarak, substrat peptid sekansı ile tahmin proteolitik bölünme ürünleri bir liste ile karşılaştırılır <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) ve bir 200 ppm kitle hata kabul toleransı. </li><li> MS / MS spektrumları FindPept araç ve onlarla ilgili 18 O-birleştirmeleri var bin değerler için öngörülen parçalanma ürünleri tüm kütle değerleri için elde edilir. MS / MS veri kapalı modunda sabit lazer 4200 yoğunluğu ve CID-gaz ile 1kV reflektör pozitif iyon modunda 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer elde edilir. 50 çekim nokta başına 40 alt-spektrumları (2,000 kare / nokta toplam verimli) toplam alt spektrumları başına randomize desen kadar elde edilir. </li><li> MS / MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) 4000 Serisi Explo ihraç edilmektedirrer veri toplama yazılımı ve bizim in-house laboratuvar bilgi sistemi ithal, zirveleri tespit edilir ve MS / MS tepe listeleri ilgili binned MS verileri ile ilişkilidir. </li><li> Peptid belirlenmesi için, MS / MS tepe listeleri aşağıdaki arama parametreleri ile MASCOT arama motorunu kullanarak SwissProt veritabanı karşı aranır: Hiçbir enzim spesifitesi, 150 ppm öncül iyon ve 0.2 Da fragmanı iyon kütle toleransları. </li><li> Peptit ayrıca kimlik Şevçenko ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi Y-dizi parça üzerinde karakteristik iyonlar 18 O-birleşme paternleri teyit ederek veri Explorer yazılımı (AB Sciex) kullanılarak doğrulanabilir. 18. </li></ol> Spektral Zaman ve 18 O-şirketleşme Arsalar C. Hazırlanması Spektral süresi araziler: Bir kullanarak her reaksiyon süresi noktası için MS veri dosyaları (. T2d dosyaları) olarak Veri Explorer yazılım ihraç edilmektedir ASCII dosyalarımakro ve veri analizi ve grafik yazılım programı (originlab örneğin Kökeni) ithal ve şelale araziler (Şekil 3) olarak görüntülenir. 18 O-kuruluş grafikleri: Her binned peptid bölünme ürün için, bireysel peptid izotop türlerin göreceli katkıları (16 O, 18 O 1 veya 18 O 2) her reaksiyon zamanı noktalarında ayıklanır ve (Şekil 4) Zamana karşı çizilen.

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
<li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li>
<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li>
<li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+proteolytic+18O+labeling%3A+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li>
<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
<li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156(2009).</li>
<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
<li>Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li>
<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
<li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Izotop etiketleme ve zamana bağımlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştirerek, Paleo-timecourse yöntemi peptid ürünlerinin nesil dinamik bir analiz sağlar. Tahlil nicel ve nitel proteomikler çalışmalar için kararlı izotopik olarak etiketlenmiş bir peptit üretmek için ve proteotypic peptidler elde edildikleri kinetik değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, Paleo-timecourse spesifik olarak, fizyolojik olarak uygun koşullar altında ex vivo olarak proteolitik yollar değerlendirmek iç...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzemenin adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Sütunlar </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI hedef plakası </td><td> AB Sciex </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB Sciex </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Malzemeler <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Alfa siyano-4-hidroksisinnamik asit </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiyotretol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endotelin-1 enzim (ECE-1) dönüştürme </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsin Altın </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Su-18 O, 97 atom% 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> AB Sciex TOF / TOF cihazları kalibrasyonu için Kütle Standartları Seti </td><td> AB Sciex </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler

istihdam proteaz-ve asit-katalizli etiketleme İş akışları<sup&gt; 18</sup&gt; o-zenginleştirilmiş su

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Kararlı izotoplar biyolojik kütle spektrometresi için temel araçlardır. Tarihsel olarak, 18 Ey-kararlı izotopu yaygın 1-3 proteolitik enzimlerin katalitik mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik gelişiyle birlikte, istikrarlı izotopik zenginleştirilmiş su 18 O-atomların enzimatik katalize eklenmesi kantitatif protein ekspresyon düzeyleri (Fenselau ve Yao 4, Miyagi ve Rao 5 ve Ye tarafından gözden karşılaştırmak için popüler bir yöntem haline gelmiştir ark. 6). 18 O-etiketleme bir kimyasal için basit ve düşük maliyetli bir alternatif (örneğin iTRAQ, ICAT) ve metabolik (örneğin SILAC) etiketleme teknikleri 7 oluşturmaktadır. Kullanılan proteaz bağlı olarak, 18 O-etiketleme bölünme ürün 3, C-terminal karboksil grubunda, iki 18 O-atomuna kadar birleşme sonuçlanabilir </sup&gt;. Etiketleme Reaksiyon iki bağımsız süreçler, peptid bağı bölünme ve karboksil oksijen değişiminin reaksiyon 8 ayrılabilir. Bizim paleo (p rotease-bir 18 O-zenginleştirilmiş su mploying ssisted l abeling e) enzimatik 18 O-etiketleme adaptasyonu, biz farklı izotop imzaları verim 50% 18 O-zenginleştirilmiş su kullanılmıştır. Yüksek çözünürlüklü ile kombinasyon halinde matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu zaman-of-flight tandem kütle spektrometresi (MALDI-TOF/TOF MS / MS), karakteristik izotop zarf özgüllük yüksek düzeyde bir bölünme ürünleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz daha önce proteolitik reaksiyonlar 10-11 algılamak ve karakterize endojen proteazlar 9 ve izlemek için paleo-metodolojisi kullanılmıştır. Paleo proteolitik bölünme reaksiyonu özünü kodlar yana, deneysel kurulum basit ve biyokimyasal Enri olduğunuklevaj ürünlerinin chment adımlar atlatılabilir. Paleo-yöntem kolaylıkla proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini ve fizyolojik koşulları temsil karmaşık biyolojik örneklerde proteoliz (ii) analizi izlemek (i) zaman ders deneyler kadar uzatılabilir. Paleo-timecourse deneyler karmaşık proteolitik yolağı reaksiyonlarda hız sınırlayıcı işlem adımları ve reaksiyon ara tanımlamak için yardım. Buna ek olarak, reaksiyon paleo-bize bu tür kendi parçalanma ürünleri rebind ve bir ikinci 18 O-atomu ile birleşmesiyle katalize etmek için yeteneğine sahip serin proteaz tripsin gibi proteolitik enzimlerin belirlemesini sağlar. Böyle bir &quot;çift etiketleme&quot; enzim postdigestion 18 peptidler özel olarak karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile etiketlenmiş olduğu O-etiketleme için de kullanılabilir. Bizim üçüncü strateji enzimler ötesinde 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam etiketleme uzatır ve 18 O-izotop işareti tanıtmak asidik pH koşullarında kullanırpeptidler içine atures.

Biz dinamik proteolitik enzimler tarafından üretilen peptit parçalanma ürünleri içine 18 O-kararlı izotoplar dahil izlemek için paleo-timecourse iş akışı kullanılır. Sunulan yaklaşım nispeten farklı substrat ve proteaz kombinasyonları için proteolitik işleme yolları incelemek için çok yönlü bir araçtır. Reaksiyon boyunca art arda proteolitik reaksiyonlar alınarak, Paleo-timecourse deney substrat ve ürün bolluk zaman çözüme anlık ve işleme ayrıntıları sağlar. Co-lekelenme bir hedef plaka üzerinde asidik matris...

Istihdam izotop etiketleme iş akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş su (LEO-iş akışları) nicel ve nitel proteomik çalışmaları için çok yönlü araçlar vardır. (Paleo) proteaz-destekli iş akışlarında,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomları proteazları aracılığıyla proteolitik bölünme ve karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar tarafından tanıtıldı. Asit katalizörlü (aleo) iş akışında<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomları düşük pH&#39;da karboksil oksijen alışverişi tarafından tanıtıldı.

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş Su

Kararlı izotoplar, biyolojik kütle spektrometrisinde temel araçlardır. Tarihsel olarak, 18O-kararlı izotoplar, katalitik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır...

Bu sunum, protein sindirim ürünlerinin ve sentetik peptitlerin stabil izotopla etiketlenmesine yönelik iş akışlarını göstermektedir; öncelikle proteaz katalizli paleo zaman seyri deneyinde, oksijen 18 atomlarını dahil etmek için substrat ve proteaz %50 Oxygen 18 zenginleştirilmiş su varlığında inkübe edilir. Ardından, proteaz çift etiketleme kapasitesine sahiptir. Sindirim sonrası cleavage ürünlerinin, %50 oxygen 18 zenginleştirilmiş su varlığında ilgili proteaz ile inkübasyonu tekrarlanır.EO iş akışı, belirli zaman aralıklarında fonksiyonel gruplara oksijen 18 atomlarının asit katalizli dahil edilmesini gerçekleştirir. Reaksiyon karışımlarının matris ile birlikte kalıplanmış hedef plakalara alikotlar halinde damlatılması ve kütle spektrometrik veri kazanımı, peptit parçalanma reaksiyonlarının spektral zaman grafiklerinin yanı sıra bireysel peptit türlerinin oksijen 18 dahil edilme grafiklerini oluşturur; etiketli parçalanma ürünleri MSM S tabanlı sekans tanımlaması için seçilir. Nihayetinde, bu iş akışları kantitatif ve kalitatif proteomik çalışmalar için çok yönlü araçlar sunar.Bu yöntem, karmaşık proteolitik yolaklardaki hız belirleyici basamakların ve reaksiyon ara ürünlerinin

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Hassas ve özellikle maya Saccharomyces cerevisiaeyeni transkripsiyonu RNA arındırmak için tiolated urasil kullanımı .

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Öğrenin, 18O-zenginleştirilmiş su kullanarak protein sindirimlerinde stabil izotop etiketleme yöntemlerini. Proteaz destekli ve asit katalizli iş akışları, kantitatif ve kalitatif proteomik çalışmalar için etkili araçlar sunar.

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları

Daha fazla video keşfet