Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları

Bu sunum, protein sindirim ürünlerinin ve sentetik peptitlerin stabil izotopla etiketlenmesine yönelik iş akışlarını göstermektedir; öncelikle proteaz katalizli paleo zaman seyri deneyinde, oksijen 18 atomlarını dahil etmek için substrat ve proteaz %50 Oxygen 18 zenginleştirilmiş su varlığında inkübe edilir. Ardından, proteaz çift etiketleme kapasitesine sahiptir. Sindirim sonrası cleavage ürünlerinin, %50 oxygen 18 zenginleştirilmiş su varlığında ilgili proteaz ile inkübasyonu tekrarlanır.

EO iş akışı, belirli zaman aralıklarında fonksiyonel gruplara oksijen 18 atomlarının asit katalizli dahil edilmesini gerçekleştirir. Reaksiyon karışımlarının matris ile birlikte kalıplanmış hedef plakalara alikotlar halinde damlatılması ve kütle spektrometrik veri kazanımı, peptit parçalanma reaksiyonlarının spektral zaman grafiklerinin yanı sıra bireysel peptit türlerinin oksijen 18 dahil edilme grafiklerini oluşturur; etiketli parçalanma ürünleri MSM S tabanlı sekans tanımlaması için seçilir. Nihayetinde, bu iş akışları kantitatif ve kalitatif proteomik çalışmalar için çok yönlü araçlar sunar.

Bu yöntem, karmaşık proteolitik yolaklardaki hız belirleyici basamakların ve reaksiyon ara ürünlerinin tanımlanması gibi proteaz araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Paleo zaman seyri ile belirlenen proteolitik imzalar, substrat spesifitesi hakkında önemli veriler sağlar. Ayrıca, veri zamanlayıcıları kinetik bilgileri de kullanır.

Laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı şimdi prosedürü gösterecek. Paleo zaman seyri iş akışı, proteaz katalizli oksijen 18 inklüzyonuna dayanarak proteolitik kesim reaksiyonlarının dinamiklerini izler; 20 µL'lik reaksiyon için, örnek peptidleri oksijen 18 ile zenginleştirilmiş su içeren proteaz reaksiyon tamponuna ekleyin, reaksiyon karışımının 0,5 µL'sini 0,5 µL matris ile karıştırın, bir opti to 3 84 maldi hedef plakasına damlatın ve solvent damlacıklarını oda sıcaklığında kuruyana kadar bırakın. Bu sırada, reaksiyon karışımını iki tüpe bölün.

Numune tüpü için kontrol ve numune. İlgili proteazı ekleyin ve önerilen enzim reaksiyon sıcaklığında inkübe edin. Belirlenen zaman noktalarını ekleyin.

Çoklu hedef plakasına damlatmak üzere 0,5 µL'lik bir alikotu alın ve 0,5 µL matris ile karıştırın. Reaksiyon dinamiğini, bu paleo sonrası sindirim etiketleme iş akışında daha sonra açıklanacağı üzere MALDI-TOF MS analizi ile analiz edin. Trypsin gibi proteazlar, oksijen-18'i dahil etmek için karboksil oksijen değişim reaksiyonunu katalize eder. Oksijen-18 etiketlemesi olmadan protein sindirimi gerçekleştirdikten sonra, kalıntı proteaz aktivitelerini ortadan kaldırmak için parçalanma ürünlerini bir PepClean C18 spin kolonundan geçirin.

Ardından örnekleri, oxygen 18 zenginleştirilmiş su içeren 20 µL tripsin reaksiyon tamponunda yeniden süspande edin. 0,5 µL'lik bir alikot alın ve eşit hacimdeki matriks ile karıştırın. Daha sonra, havada kuruması için bir opti off 3 84 maldi hedef plakasına damlatın.

Ardından, reaksiyon solüsyonunu kontrol ve örnek tüplerine bölün. Örnek tüpüne tripsin ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin. Reaksiyonu izlemek için 0,5 µL'lik bir alikot alın.

0.5 µL matris ile karıştırın ve bir MALDI hedef plakasına damlatın. Bu karboksil oksijen değişim reaksiyonunun dinamiklerini MALDI-TOF MS analizi ile inceleyin. IEO zaman seyri iş akışı, asidik peptit yan ve uç gruplarının asit katalizli karboksil oksijen değişim reaksiyonlarına dayanmaktadır.

Öncelikle, 50 nanomolar konsantrasyondaki münferit peptitleri, %0,1 nihai trikloroasetik asit varlığında veya yokluğunda, bir bölü bir oranında oksijen 18 zenginleştirilmiş su ile inkübe edin. Reaksiyondan her gün 0,5 mikrolitrelik alikotlar alarak doğrudan bir MALDI hedef plakası üzerine matris ile birlikte birlikte kristalleştirin. MALDI hedef plakasını düzenli olarak MALDI TOF MS/MS ürün analizine tabi tutun. Bu bölüm, ekteki makalede ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

İlk olarak, pozitif iyon modunda üç tekrarlı MS Spektrumları elde edin. Multipl kalibrasyonunu yaptıktan ve MS veri toplama ayarlarını yapılandırdıktan sonra, alt spektrumlar için tekli çekimler gerçekleştirin. Ardından, MS veri dosyalarını 4.000 serisi Explorer veri toplama yazılımından dışa aktarın.

Ardından, spektral işleme ve pik tespiti için mascot distiller yazılımını kullanan kurum içi bir bilgi sistemine aktarın. İzotopik zarfları dekonvolüsyona tabi tutun ve oksijen 18 katılım oranlarını otomatik olarak belirleyin; oksijen 18 katılım oranlarını, bireysel peptit izotop türlerinin tüm izotopik zarfa göre göreceli katkıları olarak kaydedin. Bin listesini filtreleyin ve her zaman seyri deneyi için 100 PP m kütle genişliğinde en az üç değeri binleyin.

İlgili MS veri dosyalarından tespit edilen tüm peptid türleri için moleküler kütleleri çıkarın. Şimdi X pacey'yi kullanarak, 200 PPM kütle hata kabul toleransı ile pep set a'yı bulun. Bin listesini, substrat peptid dizisinden öngörülen proteolitik parçalanma ürünleri verileriyle karşılaştırın.

find pep aracı tarafından öngörülen tüm parçalanma ürünü kütle değerleri ve oksijen 18 inklüzyonları ile ilişkili bin değerleri için msms spektrumlarının alınmasına geçin. Alt spektrum başına rastgele bir düzende 50 shot MSM S verisi toplayın (spot başına en fazla 40 alt spektrum) ve msms dosyalarını dışa aktarın. Ardından, pik tespiti için MSM S veri dosyalarını ve peptid tanımlama için ilgili bend MS verileriyle ilişkili MSM S pik listelerini analiz sistemine aktarın.

Mascot arama motorunda şu arama parametrelerini ayarlayın: enzim özgüllüğü yok, 150 PPM öncül iyon ve 0,2 Dalton fragman iyon kütle toleransları. M-S-M-S-P listelerini Swiss Pro veri tabanına karşı tarayın. Peptid tanımlamaları, spektral zaman grafikleri için yer fragman iyonları genelindeki karakteristik oksijen 18 inklüzyon modelleri doğrulanarak data explorer yazılımı kullanılarak ek olarak valide edilebilir.

Her bir reaksiyon zaman noktası için MS veri dosyalarını, veri gezgini yazılımı ASCI dosyalarından bir makro kullanarak dışa aktarın. Ardından, dosyaları bir veri analizi ve grafik yazılım programına aktarın ve her bir bükülme için oksijen 18 inklüzyon grafikleri oluşturmak amacıyla şelale grafikleri olarak görüntüleyin. Peptit kesim ürününde, tüm reaksiyon zaman noktaları boyunca bireysel peptit izotop türlerinin göreceli katkılarını çıkarın ve ardından zamana karşı grafiğe dökün.

Buna benzer spektral zaman grafikleri, proteolitik kesim reaksiyonlarının dinamiklerini görüntüler. Bu deney, biyoaktif peptit endo ve C'nin endotelyum dönüştürücü enzim bir tarafından kesilmesini analiz eder. Bir şelale düzenlemesi, substratın yıkımını, ara ürünlerin ve nihai ürünlerin ortaya çıkışını eş zamanlı olarak izlemek için paleo zaman seyri deneylerinin MS spektrumlarını grafikler.

Yarılma ürünleri, MSMS ve izotop zarflarının karakteristik oksijen 18 inklüzyon imzaları ile tanımlanır. Trypsin'in bu reaksiyon mekanizması, yarılma proteazlarının peptit yarılma ürünlerine iki adede kadar oksijen 18 atomunun inklüzyonuna aracılık ettiğini göstermektedir. Proteaz tabanlı etiketleme iş akışında, peptit bağı yarılma reaksiyonu, yeni oluşturulan peptit yarılma ürünleri için %50'lik tekli oksijen 18 inklüzyon oranıyla sonuçlanır; trypsin gibi reaksiyon ürünlerine yeniden bağlanan proteazlar, karboksil oksijen değişim reaksiyonu aracılığıyla ikinci bir oksijen 18 atomunun inklüzyonunu daha fazla katalize eder.

Dengede, oksijen 18 etiketi; etiketsiz, tek etiketli ve çift etiketli ürünler arasında bir iki bir oranında dağılır. Proteolitik uçların sindirim öncesi etiketleme iş akışında, hiçbir peptit bağı kopması meydana gelmez. Bunun yerine, iki adete kadar oksijen 18 atomunun katılımı, tamamen karboksil oksijen değişim reaksiyonuna dayanır.

Bu nedenle, oksijen 18 inklüzyonu yalnızca peptid cleavage ürünlerini yeniden bağlayan proteazlarda meydana gelir. Asit katalizli oksijen 18 markalaması, karboksil grubu başına iki oksijen 18 atomunun dahil edilmesine yol açar. Bu deney süresince, anjiyotensin birin izotopik zarfındaki çoklu artı iki Dalton kütle kaymaları, oksijen 18 atomlarının alımıyla haritalandırılabilir.

OPE etiketlemesi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi zaman çözünürlüklü bir şekilde birleştirilerek, paleo zaman seyri yöntemi sayesinde peptit ürünlerinin oluşumuna dair dinamik bir analiz gerçekleştirilebilir. Bu analiz, kantitatif ve kalitatif proteomik çalışmalar için stabilize edilmiş topikal olarak etiketlenmiş peptitler üretmek ve Protopic peptitlerin oluşum kinetiğini değerlendirmek amacıyla kullanılabilir.

Paleo zaman seyri, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında proteolitik yolakları değerlendirmek üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, insan kanser mikroçevrelerindeki litik süreçlere ilişkin yakın tarihli incelememize zemin hazırlamıştır.