Name: Tek Virüs Genomik kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Keşfedin tek virüs genomik yöntemiyle karma viral süspansiyonlardan tek viryon izolasyonu ve MDA ile genom amplifikasyonu. Bu teknik, yüksek verimli dizileme ve biyoinformatik analiz için virüs tanımlamasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz yazının hazırlık süreci boyunca onun fikir ve tavsiye için Ken Nealson teşekkür etmek istiyorum.

1. Viral süspansiyonlar, bölgesinin hazırlanması Akım sitometri yöntemiyle tek bir virionlar izolasyonu önce, sabitlenmemiş viral süspansiyonlar hazırlamak. <ol><li> Emin yarıyıl sonu viral bir askıya alma yapma daha önce belirlenmiş olan iletişim kuralları&#39;nı kullanarak viral partiküller izole edin 0.1 &#39;de içerdiği almaktadır mikron-süzüldü Yatay aralık TE (Tris-EDTA, pH 8). Diğer yöntemler söz konusu kullanım kimyasal flokülasyon 7 geliştirilmiştir olmasına rağmen Biz yaklaşımlar teğetsel akış filtrasyon (TFF) kullanarak 6 tavsiye ederiz. </li><li> Örneğin Epifloresans 8-10 veya akış sitometri 11,12 kullanarak kurulmuş bir protokolleri, kullanarak viral parçacıkların numaralandırılamıyor. </li><li> Iki Eppendorf tüpleri (son hacim 1.000 ul olması tavsiye edilir) içine kısım viral süspansiyon. </li></ol> 2. Akım Sitometri <ol><li> Özel bir İleri Saçılım PMT (FSC PMT) ile donatılmış BD FACSAria II Akış Sitometresi kullanarak virüsleri sıralamak için, 0.1 yılında viral parçacıkların sulandırmak TE, pH 8 mikron-filtre.0 200 olaylar sn -1 bir olay oranı için uygun bir titresi için. </li><li> Sinyal--gürültü rasyonlarına üst düzeye çıkarmak için eşikleri, örneğin ayarlayın. T4 ve lambda faj parçacıkları aşağıdaki içeren bir karışık malzeme grubuyla karşılaşılmıştır için tavsiye edilir: FSC PMT 1.000 ve SSC az 200 de. </li><li> Sadece 1 içeren &quot;boş&quot; örnekleri) 0,1 mikron-filtre TE ve 2) 1e-4 at 0.1 mikron-filtre TE ve SybrGreen1 stok seyreltme (10.000 X) 100 ul Run. </li><li> Lekeli viral süspansiyon (stokunun 1e-4 dilüsyon at SybrGreen1), 5.000 olaylar her bir toplam için viral parçacıklar tarafından takip arka plan değerlendirmek için boyanmamış viral süspansiyon bir küçük bir kısım (100 ul tavsiye edilir), çalıştırın. Bu tür için önce, gerekirse, konsantrasyon kontrol edin ve sıralama kapıları ayarlamak için olduğunu. Biz viral parçacıkların merkezinde sıkı bir kapısı tavsiye ederiz. Ayrıca, kapılar üreten için biz SYBR Green ve FSC PMT arsa kullanın. </li><li> 1% alçak erime alanına (LMP) ve bölgesinin 5&#39;te ul ekleyin agaroz ile (TBE tamponu otelinin), her ile 37 ° C bulundunuz soğutulduiyi bir politetrafloroetilen (PTFE) mikroskop lamı üzerine (Elektron Mikroskobu Bilimler). </li><li> Sıralama kriteri viral parçacıkların yakalamak için akış sitometresinin içine PTFE mikroskop lamı yükleyin. </li><li> Doğrudan LMP agaroz ile PTFE slayt üzerine SYBR yeşil lekeli viral parçacıkların tür başlayın. Biz konfokal lazer tarama mikroskobu (CSLM) sırasında virüslerin derinliği algılama yardımcı olmak için bazı kuyularda 10 veya daha fazla olaylar (viral parçacıklar) sıralama tavsiye ederiz. </li><li> Sınıflandırıcı tamamlandı olduğunu Ne zaman, akış sitometresinin ışık adlı işletmeye slayt kaldırmak ve yorum eklemek 5 ul devamı LMP, agaroz ve böylece, viral partikül (ler) katıştırma, her bir kuyunun bulundunuz 37 ° C arası ° C&#39;ye soğutuldu. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskop kullanarak Tek Kişilik viryonlar görselleştirme , Bir Tek bir virionu arzu edilen edilir halinde, her bir ayrıca bir bireysel virüs içeriyorsa,, o zaman belirlenmesi zorunludur olduğunu ve CLSM yalnızca, bir tek bir parçacık mevcut olduğunu ve bu olduğunu doğrulamak için 3 Boyutlu otelinin katıştırılmış virion (temizle) görselleştirmek için gerekli olan Birden çok virüsHer bir Diğer bölgesinin En iyi ilgili sayısız yığılmış değil, uygulanır. <ol><li> Dalga boyu 488 nm eksitasyon için mikroskop lazer ayarlayın. </li><li> Bir 63X uzun çalışma mesafesi objektif kullanarak katıştırılmış viral parçacıkların Görüntü. </li></ol> 4. Tüm Genom Amplifikasyon <ol><li> Tek virüsleri ile kuyu CLSM ile tanımlanır Bir kez, agaroz (in situ) içinde birden çok yer değiştirme amplifikasyon (MDA) kullanarak tüm genom amplifikasyon gerçekleştirin. </li><li> DNA kontaminasyonu tanıtılması olasılığını azaltmak için, slayt gelen istenen agaroz &#39;boncuk&#39; kaldırmak ve bir steril PCR tüp yerleştirilir. Steril cımbız ve / veya bu adımı için jilet bir çift kullanın. </li><li> In situ bir termalcycler sıcağında bloğunda 3 dk için (94 ° C) ısı kullanılarak en viral parçacık lyse. </li><li> Aşağıdaki değişiklikler ile MDA reaksiyon aşağıdaki üretici tavsiyelerine (GenomiPhi HY kiti, GE Healthcare) gerçekleştirin <ol><li> Örnek ve reaksiyon buf hacmi azaltın30 de 11.25 ul ve inkübe için fers ° nonspesifik amplifikasyon azaltmak için 2 hr bir maksimum için C. </li></ol></li><li> , Bir, 1.7 ml Eppendorf tüp etmek için genomik DNA&#39;sı (gDNA) aktarmak edenler tarafından güçlendirilmiş genomik malzeme Purify ve 1/10 ses seviyesi TBE tamponu otelinin 3 M sodyum asetat (edilerek NaOAc) (aynı tampon maddesi LMP, agaroz hazırlanmasında otelinin ikinci el) ekleyin. </li><li> 55 Place at numune (ler) ° C 10 dakika için agaroz çözmek için. </li><li> 42 için tüp (ler) hareket ettirin ° C enzim eklemeden önce sıcaklığını düşürmek için. </li><li> Her bir tüp ve 2 saat boyunca inkübe edin bulundunuz β-Agarase 2 adet sahipsiniz. </li><li> , Tüp için bir tampon-doymuş bir fenol çözeltisi bölgesinin 1 hacim Ekleyin olarak, şiddetle mix ve 15 dakika Ülke: için 3,500 &#39;den x g&#39;de okuyun santrifüj. , Bir yeni 1.7 ml lik Eppendorf tüp bulundunuz süpernatant ihtiva eden DNA aktarın. </li><li> Glycoblue, bölgesinin% 100, izopropanol ve 1μl bölgesinin bir hacim ekleyin. Tersini tüp tarafından iyi karıştırın. </li><li> 60 dakika için 4 ° C de 28.000 xg&#39;de santrifüjleyin. Durusu izopropanol pelet rahatsız için değil emin yapım. 70% etha 150 ul ekleyinHer bir tüp için nol. 10 dakika için 28.000 xg&#39;de ve oda sıcaklığında Spin. Etanol Durusu için hava, çalıştırıldığında DNA pelet kuru ve TE tampon maddesinde bölgesinin, bir uygun bir hacmi eksiksiz yer alan DNA tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Biz aşağıdaki modifikasyonlar ile adımları 4,4-4,9 tekrar tavsiye ederiz. Ortalama gönderim süresi 3-5 çoğaltmak MDA reaksiyonları Set up ve 1 saat için 30 de inkübasyon ° C azaltır. Arzu edilen konsantrasyonunun elde edilmesi için% 95-100 aralığı şekilde, etanol kullanılarak ve temizlemesi için çökelti, Aşağıdaki Yüzme Havuzu örnekleri. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, bu SVG sürecini özetler. Bu yöntemler sıralama için yeterli olan gDNA miktarları elde etmek için MDA tarafından takip bir karışık malzeme grubuyla karşılaşılmıştır gelen tek virionlar izole etmek için agaroz içeren PTFE mikroskop slaytlar üzerine viral parçacıkların sıralamak için akım sitometri kullanın. Bir kanıtı-of-kavram olarak, bakteriyofaj lambda ve T4 karıştırıldı ve SVG Süreci 11 tabi. Virionlar agaroz, CLSM wa yakalanan ve gömülü edildi Bir keztemizle görselleştirmek ve, bir tek bir virionu elde edildi olduğunu teyit etmek için ikinci el;. sonuçları Şekil 2&#39;de otelinin yeri gösterilmiştir arıyorsunuz Bir kez tek kişilik virionlar ile kuyu tespit edilmiştir, onlar gDNA bölgesinin MDA için seçilmişlerdir, edildi. Biz o zaman T4 ve izole virion, Şekil 3. Tanımlamak için lambda Bir izole faj lambda genom sıralama için seçildi için multipleks PCR özel kullanılır. Genom sekanslaması özellikle, ve SVG kullanıyorsanız elde edilen seçenekleri içerisinde bölgesinin seviyeler-ini belirlemek için gerçek zamanlı verilerin referans ilaç politikasına tabi edildi 454-Titanyum teknolojisi ve sıralama okuma kullanılarak gerçekleştirildi. Şekil 4, gösterileri hemen hemen tüm lambda genomu (olanlar önce Herhangi 5&#39;te bp bölgesinin özel durum ile birlikte) kurtarıldı olduğunu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig1.jpg" /> 1 Şekil. Bir karışık malzeme grubuyla karşılaşılmıştır içeren SVG metodolojisi. Viral süspansiyonları daha sonra ler vardır akım sitometri yöntemiyle tek bir virüs parçacıkları indirgenirbireysel agaroz &quot;boncuk&quot; üzerine orted. Virüs agaroz yazılan Mesajı akım sitometrik sıralama ek bir tabaka ile overlaying tarafından agaroz boncuk içinde gömülü edilir. Son olarak, Bütün Genom Dizileme Sistemi amplifikasyon in situ otelinin gerçekleştirilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3899/3899fig2.jpg" /> Şekil 2. Konfokal lazer bir agaroz boncuk gömülü bir sıralama kriteri viral parçacığın mikrografı tarama. Bir agaroz boncuk içinde bir SYBR Green I-lekeli viral parçacığın A) Üç boyutlu rekonstrüksiyon. Inset: izole viral parçacığın daha yüksek büyütme bir agaroz boncuk içinde lekeli tek bir viral parçacığın göreceli floresans B) Profil arsa.. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/3899/3899fig3.jpg" /> Şekil 3,. PCR kullanılarak, Bakteriyofaj kimlik belgesi. A) &#39;&lt;/ Strong&gt; Multipleks PCR genotip, Lanes için T4 ve lambda-özel primerler kullanılarak: 1. TrackIt 1 kb artı merdiven (Invitrogen), 2. lambda integraz (750 bp), 3. T4, majör kapsid proteini (1,050 bp), 4. . 1: lambda integraz ve T4 büyük kapsid protein Mix B) ek lokusların ile Bilanço Tarihinden Sonraki lambda spesifik PCR daha fazla faj genom izolasyon, Lanes onaylamak için. Lambda integraz (750 bp), 2. Lambda repressör (356 bp) 3. Lambda sie (süperenfeksiyon hariç tutma) (456 bp) 4. TrackIt 1 kb artı merdiven (Invitrogen). <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3899/3899fig4.jpg" /> 4 Şekil. Lambda genom nitelikleri ve kapsama. A) GC arsa, B) lambdanın Genom Haritayı (adapte <a href="http://img.jgi.doe.gov" target="_blank">http://img.jgi.doe.gov</a> ), ve C) SVG of Mapping referans bakteriyofaj lambda için okur, x-ekseni olduğu genom konumu, yaxis% kapsama alanı.

<ol><li>Raghunathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+amplification+from+a+single+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA amplification from a single bacterium.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).</li>
<li>Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomic+sequencing+using+Multiple+Displacement+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).</li>
<li>Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+single+microbial+cells+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).</li>
<li>Edwards, R. A., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral metagenomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).</li>
<li>Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of viruses in the environment.</a> Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).</li>
<li>Williamson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+metagenomic+characterization+of+viruses+within+aquatic+microbial+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456(2008).</li>
<li>John, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+concentration+of+ocean+viruses+by+chemical+flocculation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).</li>
<li>Noble, R., Fuhrman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+viruses+in+marine+waters%3A+assessment+by+epifluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).</li>
<li>Hennes, K. P., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+counts+of+viruses+in+natural+waters+and+laboratory+cultures+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy.</a> Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).</li>
<li>Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+marine+viruses+in+culture+and+natural+samples+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).</li>
<li>Brussaard, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophages+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophages using flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).</li>
<li>Allen, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Virus+Genomics%3A+A+New+Tool+for+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+cloning+using+phi+29+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

SVG yaklaşımlar uygularken önemli bir dizi faktör dikkate alınmalıdır. Genotipleme, proof-of-concept deney 13 sırasında yapılan gibi, korunmuş astarlar tüm viral gruplarında mevcut değildir gibi çevresel veya bilinmeyen izolatların için geçerli bir seçenek değil. Ayrıca, arka plan DNA sentezi ya da spesifik olmayan amplifikasyon sık MDA reaksiyon 14 kullanılarak amplifikasyon sırasında bildirilir. Spesifik olmayan amplifikasyon reaksiyonu reaktif maddeler ve / veya reaksiyon karışımı içinde rastgel...

<table><tbody><tr><td>1X TE tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Tampon doyurulmuş Fenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>GenomiPhi HY kiti</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-22</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>15 mg/ml</td></tr><tr><td>LMP agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>PTFE mikroskop lamı</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63430-04</td><td>24 kuyucuklu, 4 mm Çap</td></tr><tr><td>SybrGreen</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000X</td></tr><tr><td>&amp;#946;-agaraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0392S</td><td></td></tr></tbody></table>

&#39;tek virüs genomik&#39; kullanarak tek viryonlar İzolasyonu ve genom analizi

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Tek mikrobiyal hücrelerin tüm genom amplifikasyon ve sıralama ekimi 1-3 en gerek kalmadan genomik karakterizasyonu sağlar. Her yerde ve gezegenimizin 4 üzerindeki en çok sayıda varlıklar ve tüm ortamlarda 5 içinde önemli olan Virüsler,, benzer yaklaşımlar yoluyla ortaya çıkmak için henüz. Burada &#39;Tek Kişilik Virüs Genomik&#39; (SVG) adı verilen tek virionlar genom izole ve karakterize için bir yaklaşım tarif. SVG daha sonraki dizi analizi reaksiyonlar otelinin ikinci el kullanılabilen, yüksek molekül ağırlığı genomik DNA (gDNA) elde etmek üzere tek tek virüs ve Bütün Genom Dizileme Sistemi amplifikasyon izole etmek için akım sitometri kullanır.

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Tekil mikrobiyal hücrelerin tüm genom amplifikasyonu ve sekanslaması, kültüre gerek kalmaksızın genomik karakterizasyona olanak tanır 1-3. ... olan virüsler,

Bu prosedürün genel amacı, karma bir konsorsiyumdan tekil virionları izole etmek ve kültüre gerek duymadan çeşitli ortamlardaki virüsleri tanımlamak için elde edilen genomik materyali dizilemekte yer almaktadır. Bu işlem, öncelikle tekil virionların agaroz boncuklar üzerine akış sitometrik sıralama kullanılarak izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Tekil virion yakalanması daha sonra konfokal mikroskopi ile doğrulanır.Ardından, genomik materyal virionlardan izole edilir ve sekanslama için gereken DNA miktarını üretmek amacıyla çoklu yer değiştirme amplifikasyonu veya MDA kullanılarak çoğaltılır. Son olarak, virion genomunun aşırı kapsamını oluşturarak genom montajı ve anotasyonuna önemli ölçüde yardımcı olmak için yüksek kapasiteli teknolojiler kullanılarak viral DNA sekanslanır. Nihayetinde, kontig boyutunu artırmak için sekans alt-örnekleme yaklaşımlarını kullanan biyoinformatik teknikler, izole edilmiş virionların analizine olanak tanır.Bu yöntem, açıklanmamış virioplankton genlerinin geniş havuzuna genomik bağlam kazandırarak viral ekoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve çeşitli ekosistemlerden yeni genomların keşfine olanak sağlayabilir. Genel olar

isolation-genome-analysis-single-virions-using-single-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir...

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Kaynak: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, klik kimyası ve manyetik boncuk saflaştırması kullanarak hücre çekirdeklerinden protein-viral DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Protokol; viral genomların alkin-modifiyeli nükleotidlerle işaretlenmesini, bir klik reaksiyonu aracılığıyla biyotinilasyonu ve streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanmayı içerir. Yıkama ve ısı...

Viral DNA-Protein Komplekslerinden Proteinlerin İzolasyonu

Kaynak: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Dev Virüs Karışımlarının Ayrılması için Floresan Aktive Hücre Ayıklamaya Alternatif Bir Strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, konak hücreler olarak amipleri kullanarak, karışık bir viral popülasyondan tek bir dev virüs popülasyonunu izole etmek ve çoğaltmak için tek hücreli mikro-aspirasyon yöntemini göstermektedir.

Amoebalar Kullanılarak Karışık Bir Viral Popülasyondan Tek Bir Dev Virüsün İzolesi

Kaynak: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).Bu video, floresan tabanlı tespit ve hassas partikül sıralama yoluyla karışık popülasyonlardan genom içeren tekil virüslerin akış sitometrisi ile nasıl izole edildiğini ve ardından sonraki genomik karakterizasyon için agaroz gömme işleminin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir.

Genomik Analiz İçin Tekil Virüs Partiküllerinin Floresan Tabanlı Ayrıştırılması

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

Burada, siyanofajları (ve konakçılarını) izole etmek için deniz ve tatlı su ekosistemlerinin öfotik bölgelerinden örnekleme yöntemlerini ve tek genotipleri zenginleştiren ve virüs-konak etkileşim dinamiklerini karakterize eden örnekleme sonrası süreçleri açıklıyoruz.

Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

İnsan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli viral boyutlu fraksiyon metagenomları (viromlar) üretmek için esnek bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta toprak viromikleri için geliştirilen bu protokol, burada dışkı örneklerine başarıyla uygulanarak insan bağırsak virosferinin sağlam bir şekilde karakterizasyonu sağlanmıştır.

İnsan Dışkısı Örnekleri için DNA Viral Boyut Fraksiyonu Metagenomikleri

Keşfedin tek virüs genomik yöntemiyle karma viral süspansiyonlardan tek viryon izolasyonu ve MDA ile genom amplifikasyonu. Bu teknik, yüksek verimli dizileme ve biyoinformatik analiz için virüs tanımlamasına olanak tanır.

'Tek Virüs Genomik' kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Daha fazla video keşfet