'Tek Virüs Genomik' kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Bu prosedürün genel amacı, tek varyanları karışık bir konsorsiyumdan izole etmek ve elde edilen genomik materyali, ekime gerek kalmadan çeşitli ortamlardan virüsleri tanımlamak için sıralamaktır. Bu, ilk olarak akışın aro boncukları üzerine sitometrik sıralaması kullanılarak tek varyanların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Tek iyon yakalama daha sonra konfokal mikroskopi ile doğrulanır.

Daha sonra, genomik materyal iyonlardan izole edilir ve dizileme için gereken DNA miktarını üretmek için çoklu yer değiştirme amplifikasyonu veya MDA kullanılarak amplifiye edilir. Son olarak, viral DNA, virion genomunun aşırı kapsamını oluşturmak için yüksek verimli teknolojiler kullanılarak dizilenir ve genom montajına ve açıklamasına önemli ölçüde yardımcı olur. Sonuç olarak, kon boyutunu artırmak için dizi alt örnekleme yaklaşımlarını kullanmayı amaçlayan biyoinformatik teknikler, izole vonların analizine izin verir.

Bu yöntem, açıklamalı OC plankton genlerinin geniş havuzuna genomik bağlam kazandırarak viral ekoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve çeşitli ekosistemlerden yeni genomların keşfedilmesini sağlayabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, tek iyonların amplifikasyonu ve izolasyonu mevcut teknolojinin sınırlarını zorladığı için mücadele edebilir. Bu yöntem için ilk olarak, Vero plankton topluluklarında MDA'nın kullanımını değerlendirirken aklımıza geldi ve tek bir viral parçacığı ve diziyi sıralamanın ve dolayısıyla bu karmaşık topluluklardan tam bir viral genomu bir araya getirmenin mümkün olduğunu fark ettik Özel ileri saçılma fotoçoğaltıcı tüpler veya F-S-C-P-M-T ile donatılmış bir akış sitometresi kullanarak virüsleri sıralamak için, viral parçacıkları 0.1 mikron filtreli trislerde seyrelterek başlayın, T, dört ve lambda faj parçacıkları içeren karışık bir topluluk için EDTA, sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için FSCPM'yi 1000'e ve SSC'yi 200'e ayarlayın.

Kontrol örneklerini çalıştırdıktan sonra, yaklaşık 100 mikrolitre sürekli viral süspansiyonu toplam 5.000 olaya kadar çalıştırın. Ardından, viral parçacıkların merkezine sıkı bir kapı yerleştirmek için siber yeşil olanı ve F-S-C-P-M-T grafiklerini kullanın. Şimdi, A-P-T-F-E mikroskop lamındaki her bir oyuğa 37 santigrat dereceye kadar soğutulmuş TBE tamponunda beş mikrolitre% 1 düşük erime noktalı aros ekleyin ve ardından sıralanan viral partikülleri yakalamak için slaydı akış sitometresine yükleyin.

Konfokal lazer tarama mikroskobu sırasında virüslerin derinliğinin tespit edilmesine yardımcı olmak için bazı kuyucuklarda 10 veya daha fazla viral parçacık olayını yakalayarak sıralamaya başlayın. Sıralama tamamlandığında, slaytı akış sitometresinden çıkarın ve her bir oyuğa 37 santigrat dereceye kadar soğutulmuş beş mikrolitre daha düşük erime noktalı aros ekleyin. Tek varyasyon için viral partiküllerin gömülmesi.

Konfokal lazer tarama mikroskobunu 488 nanometreye ayarlayın. Uyarma daha sonra, yalnızca tek bir parçacığın mevcut olduğunu ve birden fazla virüsün üst üste istiflenmediğini doğrulamak için 63 x uzunluğunda bir çalışma mesafesi hedefi kullanarak gömülü parçacıkları görüntüler. Daha sonra, tek virüslü kuyucuklar tanımlandıktan sonra, istenen agros boncuklarını slayttan çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın ve bunları steril bir PCR tüpüne yerleştirin.

Viral partikülü yerinde bitlemek için tüpü üç dakika boyunca 94 santigrat dereceye ayarlanmış bir termosikleratörün ısı bloğuna yerleştirin. Daha sonra, modifiye edilmiş bir MDA gerçekleştirdikten sonra, genomik DNA'yı 1.7 mililitrelik einor tüplerine aktarın ve TBE tamponuna 10'uncu hacimde üç molar sodyum asetat ekleyin, Amplifiye edilmiş genomik materyali saflaştırmak için, örnekleri 10 dakika boyunca 55 santigrat dereceye yerleştirin arosları çözün ve ardından enzimi eklemeden önce sıcaklığı azaltmak için tüpleri 42 santigrat dereceye getirin. Şimdi her tüpe iki ünite beta aase ekleyin ve tüpleri iki saat inkübe edin.

Daha sonra her tüpe bir hacim tampon doymuş fenol çözeltisi ekleyin. Tüpleri kuvvetlice karıştırın ve oda sıcaklığında 3.500 kez 15 dakika santrifüjleyin G.At SUPERNATANTS içeren DNA'yı yeni bir 1.7 mililitrelik einor tüpe aktarın. Daha sonra, tüplere bir hacim% 100 izopropanol ve bir mikrolitre gliko mavisi ekleyin ve tüpleri tekrar santrifüjledikten sonra karıştırmak için tüpleri ters çevirin.

Bu süre 28.000 kez G ve dört santigrat derecede 60 dakika boyunca. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek izopropanolü boşaltın ve her tüpe 150 mikrolitre %70 etanol ekleyin. Tüpleri 28.000 kez 10 dakika döndürün.

Oda sıcaklığında G. Etanolü havayla kurutun, DNA peletini boşaltın ve DNA'yı uygun bir hacimde tris EDTA tamponunda yeniden süspanse edin. Bir siber yeşil, bir tarımsal hız içinde bir lekeli viral partikülün bu üç boyutlu rekonstrüksiyonu, konfokal lazer mikroskobunun yakalandıktan ve aros içine gömüldükten sonra her bir oyukta tek bir viryonun elde edildiğini görselleştirmek ve doğrulamak için nasıl kullanılabileceğini gösterir, iç kısım izole edilen viral partikülün daha yüksek bir büyütmesini gösterir.

Burada, bir aros boncuğu içindeki lekeli tek viral partikülün nispi floresansının bir profil grafiği gösterilmektedir. Bu son şekil serisi, ilk beş baz çifti dışında neredeyse tüm Lambda genomunun bu temsili virüs için nasıl kurtarıldığını gösteriyor. İşte tek virüs için GC grafiği.

Tanımlanan genom gösterilir. Bu şekil lambdanın genom haritasını göstermektedir. Son olarak, temsili izole edilmiş ve amplifiye edilmiş bakteri faj lambda için tek bir virüs genomunun haritalanması gösterilmiştir.

X ekseni genom pozisyonunu gösterir. Y ekseni kapsama yüzdesini gösterir. Bu prosedürü denerken, steril teknik kullanmak ve kontaminasyonun önlenmesini sağlamak için zaman ayırmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, tüm genom diziliminden önce izole edilen varyanların taksonomisini değerlendirmek için başka yöntemler de kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması, konfokal mikroskopi ve tüm genom amplifikasyonu kullanarak tek varyanları nasıl izole edeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.