'Tek Virüs Genomik' kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Bu prosedürün genel amacı, karma bir konsorsiyumdan tekil virionları izole etmek ve kültüre gerek duymadan çeşitli ortamlardaki virüsleri tanımlamak için elde edilen genomik materyali dizilemekte yer almaktadır. Bu işlem, öncelikle tekil virionların agaroz boncuklar üzerine akış sitometrik sıralama kullanılarak izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Tekil virion yakalanması daha sonra konfokal mikroskopi ile doğrulanır.

Ardından, genomik materyal virionlardan izole edilir ve sekanslama için gereken DNA miktarını üretmek amacıyla çoklu yer değiştirme amplifikasyonu veya MDA kullanılarak çoğaltılır. Son olarak, virion genomunun aşırı kapsamını oluşturarak genom montajı ve anotasyonuna önemli ölçüde yardımcı olmak için yüksek kapasiteli teknolojiler kullanılarak viral DNA sekanslanır. Nihayetinde, kontig boyutunu artırmak için sekans alt-örnekleme yaklaşımlarını kullanan biyoinformatik teknikler, izole edilmiş virionların analizine olanak tanır.

Bu yöntem, açıklanmamış virioplankton genlerinin geniş havuzuna genomik bağlam kazandırarak viral ekoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve çeşitli ekosistemlerden yeni genomların keşfine olanak sağlayabilir. Genel olarak, bu yöntemi yeni kullanan kişiler, tekil virionların amplifikasyonu ve izolasyonunun mevcut teknolojinin sınırlarını zorlaması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, virioplankton topluluklarında MDA kullanımını değerlendirirken ortaya çıktı ve bu karmaşık topluluklardan tek bir viral partikülün ayrıştırılmasının, ardından dizilenmesinin ve böylece tam bir viral genomun birleştirilmesinin mümkün olduğunu fark ettik. Özel ileri saçılım fotomultiplayör tüplerle (FSCPMT) donatılmış bir akış sitometresi kullanarak virüsleri ayrıştırmak için; öncelikle viral partikülleri 0,1 mikron filtrelenmiş tris-EDTA içinde seyrelterek başlayın. T4 ve lambda faji partikülleri içeren karışık bir topluluk için, sinyal-gürültü oranını maksimize etmek amacıyla FSCPMT değerini 1000'e ve SSC değerini 200'e ayarlayın.

Kontrol örneklerini çalıştırdıktan sonra, boyanmış viral süspansiyondan toplam 5.000 olay gerçekleşene kadar yaklaşık 100 µL çalıştırın. Ardından, viral partiküllerin merkezine dar bir kapı (gate) yerleştirmek için sybr green one ve FSCPMT grafiklerini kullanın. Şimdi, P-T-F-E mikroskop lamındaki her bir kuyuya 37 °C'ye soğutulmuş TBE tamponu içinde %1 düşük erime noktalı agarozdan beş µL ekleyin ve ardından sıralanan viral partikülleri yakalamak için lamı akış sitometresine yerleştirin.

Konfokal lazer tarama mikroskobisi sırasında virüslerin derinliğinin tespitine yardımcı olmak amacıyla, bazı kuyucuklarda 10 veya daha fazla viral partikül olayı yakalayacak şekilde sıralamaya başlayın. Sıralama tamamlandığında, lamı akış sitometresinden çıkarın ve viral partikülleri gömen her kuyucuğa 37 °C'ye soğutulmuş beş µL daha düşük erime noktalı agaroz ekleyin. Tekil virionlar için konfokal lazer tarama mikroskobunu 488 nm eksitasyona ayarlayın. Ardından, yalnızca tek bir partikülün mevcut olduğunu ve birden fazla virüsün üst üste binmediğini doğrulamak için 63 x uzun çalışma mesafeli objektif kullanarak gömülü partikülleri görüntüleyin. Tekil virüslerin bulunduğu kuyucuklar belirlendikten sonra, istenen agaroz boncuklarını lamdan çıkarmak için bir jilet kullanın ve bunları steril bir PCR tüpüne yerleştirin.

Viral partikülü yerinde (in-situ) liz etmek için tüpü, 94 °C'ye ayarlanmış bir termosiklet ısı bloğunda üç dakika bekletin. Daha sonra, modifiye edilmiş bir MDA uyguladıktan sonra genomik DNA'yı 1,7 mL'lik Eppendorf tüplerine aktarın ve amplifiye edilmiş genomik materyali saflaştırmak için TBE tamponu içindeki üç molar sodyum asetatın onca bir hacmini ekleyin. Agarozu çözmek için örnekleri 10 dakika boyunca 55 °C'de tutun ve ardından enzimi eklemeden önce sıcaklığı düşürmek için tüpleri 42 °C'ye taşıyın. Şimdi her tüpe iki ünite Beta-agaraz ekleyin ve tüpleri iki saat boyunca inkübe edin.

Ardından, her tüpe bir hacim tamponlanmış doygun fenol çözeltisi ekleyin. Şiddetli bir şekilde karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.500 ×g'de santrifüjleyin. DNA içeren süpernatanları yeni bir 1,7 ml'lik Eppendorf tüpüne aktarın. Sonra, tüplere bir hacim %100 isopropanol ve bir µL glyco-blue ekleyin ve karıştırmak için tüpleri altüst edin. Tüpleri bu kez 4 °C'de 60 dakika boyunca 28.000 ×g'de tekrar santrifüjledikten sonra, pellet'i bozmamaya dikkat ederek isopropanolü boşaltın ve her tüpe 150 µL %70 etanol ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 28.000 ×g'de döndürün. Etanolü boşaltın, DNA pellet'ini havada kurutun ve DNA'yı uygun bir hacim tris-EDTA tamponu içinde yeniden süspande edin. Bir agaroz boncuk içindeki sybr green I ile boyanmış viral partikülün bu üç boyutlu rekonstrüksiyonu, konfokal lazer mikroskobisinin, agarozda yakalanıp gömüldükten sonra her kuyucukta tek bir virion elde edildiğini görselleştirmek ve doğrulamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir; içteki resim, izole edilen viral partikülün daha yüksek büyütmesini göstermektedir.

Burada, bir agaroz boncuk içindeki boyanmış tek bir viral partikülün bağıl floresansının profil grafiği gösterilmektedir. Bu son şekil serisi, ilk beş baz çifti hariç, neredeyse tüm Lambda genomunun bu temsili virüs için nasıl geri kazanıldığını göstermektedir. Burada, tanımlanan tek virüs genomuna ait GC grafiği gösterilmektedir. Bu şekil, lambda'nın genom haritasını göstermektedir. Son olarak, izole edilen ve çoğaltılan temsili bakteriyofaj lambda için tek bir virüs genomunun haritalaması gösterilmiştir. X ekseni genom konumunu, Y ekseni ise kapsama yüzdesini göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, steril tekniklerin kullanılması ve kontaminasyonun önlendiğinden emin olmak için gerekli zamanın ayrılması önemlidir. Bu prosedürün ardından, tüm genom dizileme öncesinde izole edilen virionların taksonomisini değerlendirmek için diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra; floresan aktivasyonlu hücre ayırma, konfokal mikroskopi ve tüm genom amplifikasyonu kullanarak tekil virionların nasıl izole edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.