Name: Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Öğrenin, farelerde NADPH oksidaz kaynaklı reaktif oksijen türlerinin biyoluminesans görüntüleme ile gerçek zamanlı izlenmesi için minimal invaziv bir yöntemi. Bu teknik, inflamatuar hastalıklarda ROS dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH RO1 AI079253 ve Gazi İşleri Bakanlığı tarafından finanse edildi.

1. Hayvan Modelleri <ol><li> Fare: S47 phox-Kullanım / - farelerde, yaş ve cinsiyete göre eşleştirilmiş C57BL6/DBA fareler. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi deneyler için onay alın. </li><li> Anestezi: Anestezi ikna etmek için sürekli bir izofluran yönetim sistemi kullanın. Buharlaştırıcı sistemi (VetEquip) (% 2-3) izofluran ile doldurulur. Fareler dış uyaranlara yanıt olarak solunum, hareket ve korneal refleks gözlemleyerek tamamen uyuşturulduktan olduğunu onaylayın. </li><li> Cerrahi yöntemler:% 70 etanol ile cerrahi alan (benchtop) fırçalayın. Steril eldiven ve temiz bir cerrahi önlük ve maske takın. Saç kırpma ve kesik olan alanı için% 70 etanol ile dönüşümlü olarak betadin uygulayarak fareler hazırlayın. Steril bir yüzey üzerinde ameliyat gerçekleştirin ve steril aletler kullanın. Monitör fareler postoperatif kadar uyanık ve serbestçe hareket. </li><li> Intratrakeal zymosan yönetimi <ol><li> Anesteziklereolarak 1.2 nitelendirdi. </li><li> Betadin ve% 70 etanol ile cerrahi alan (boyun) Dezenfekte ve cerrahi diseksiyon ile trakea maruz. </li><li> Pierce, 27-gauge iğne ile soluk borusu ve steril PBS içinde eritildi, 0.5 ug / ml &#39;den çözeltisi (25 g fare için toplam hacim 50 ul) ile 1 ug / gr&#39; lik bir dozda zymosan (St. Louis, MO) enjekte edilir. </li><li> Kapat fareler boyun aseptik koşullarda 5-0 steril ipek dikişlerle yara. </li><li> 4 saat ve 24 saat sonra resmi. </li></ol></li><li> Çekal ligasyon ve delme <ol><li> 1.2 &#39;de tanımlanan anesteziklere. </li><li> Ameliyat bölgesinin (karın) saç Klip ve betadin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. </li><li> Bir orta hat laparotomi gerçekleştirin ve çekum tanımlamak. </li><li> 4-0 ipek sütür ve 21-gauge iğne tek geçişe sahip ligasyonu distal ponksiyon çekum ile maruz çekum distal 50% Arter. </li><li> 4-0 steril ipek dikişlerle kesi kapatın. </li><li> 4 saat sonra görüntü ve24 saat. </li></ol></li><li> Sözlü karbon tetraklorür (CCl4) idaresi <ol><li> 1.2 &#39;de tanımlanan anesteziklere. </li><li> Ağızdan sonda yoluyla mısır yağı içinde çözülmüş CCl4 (2 ug / g, St Louis, MO) uygulayın. CCl4 uygulama prosedür IBC / EHS ilkelerine uygun olarak belirlenmiş bir bölge içinde yapılmalıdır. </li><li> 4 saat ve 24 saat sonra resmi. </li></ol></li></ol> 2. Bir Bioluminescent Görüntü Kazanılması <ol><li> Lüminesans moduna ayarlı IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Görüntüleme Sistemi, Initialize ve şarj bağlı cihaz (CCD) kilitlemek için sıcaklık için bekleyin. </li><li> Maruziyet süresi, binning (orta) ve F / Stop (8) ayarlarını seçin. </li><li> Normal vücut ısısını korumak için ateşli bir sahne görüntüleme odasında yatar pozisyonda yer fareler. Fareler IVIS görüntüleme odasında ise burun konisi ile 1.2 &#39;de tanımlanan anesteziklere. </li><li> L-012 yönetme<html> (20 mg / g) görüntüleme için seçilen her bir zaman noktasında retroorbital enjeksiyon yoluyla damardan steril PBS (10 mikrogram / ul) içinde eritildi. </li><li> L-012 enjeksiyonundan sonra 2 dk başlayarak görüntüler yakalayın. Biz genellikle 40 sn pozlama kullanın. </li></ol> 3. Region of Interest kullanarak Veri Analizi <ol><li> Yaşayan Image yazılımı V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) kullanılarak veriler analiz. </li><li> Bir görüntüyü açın ve İlgi araçları Bölgesi ölçümü seçin. </li><li> Göğüs ve / veya fare fotoğrafik görüntünün üzerinde pseudo-renkli dijital görüntü (foton algılama temsilen) overlaying sonra karın üzerine Faiz şekil ve boyut Bölge seçin. </li><li> İlgi Bölgesi&#39;nden gelen sinyal yoğunluğu (foton akısı) sayısal. </li></ol> 4. Istatistik <ol><li> Bireysel zaman noktalarında Bonferroni post-test ile iki yönlü ANOVA gerçekleştirmek için istatistiksel analiz yazılım paketi kullanın. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Temsilcisi Sonuçlar Zymosan bir pro-inflamatuar maya hücre duvarı ürünleri ve NADPH oksidaz 3 güçlü bir aktivatörü olan. Biz daha önce bu intratrakeal zymosan daha sağlam nötrofilik akciğer inflamasyonu ve S47 phox-/ pro-enflamatuar sitokin üretimini indükler gösterdi - farelerde 1 yabani-tip ile karşılaştırıldığında. Zymosan karşılaştırmadan sonra fareler - Burada amacımız yabani-tip ve S47 phox-/ akciğerleri ROS üretimi karşılaştırmaktır. 4 saat ve 24 saatte fareler - 4 saatte zymosan intratrakeal uygulamadan sonra, bu temel hem de S47 phox-/ göre yabani-tip olarak foton emisyon bir artış ile karşılaştırıldığında, yabani-tip farelerde göğüs boyunca foton emisyon önemli bir artış gözlenmiştir. Buna karşılık, S47 phox-/ in biyolüminesans sinyalleri - farelerde zymosan tedavisi (Şekil.1 AB) sonra 4 saatte bazal seviyelerde kalmıştır. Böylece, NADPH oksidaz b görünüyorE zymosan verilmesini takiben akciğerlerde ROS üretiminin ana kaynağı. Sonra, CLP-indüklenen sepsis modelinde ROS üretimi değerlendirilmiştir. Sepsis akut akciğer hasarı (ALI) ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) 4, 5 gibi uç organ hasarı ile ilişkili hayatı tehdit eden bir sendromdur. ROS aracılı yaralanma sepsis kaynaklı çoklu organ disfonksiyonu sürüş önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Biz ROS belirgin göğüs (4 saat) üzerinde ve başlangıca göre yabani-tip farelerden CLP takiben karın (24 saat) fazla arttığı bulunmuştur. Ancak, S47 phox-/ ROS seviyeleri - fareler zaman noktalarında (Şekil.2 AC) hem de bazal düzeyleri benzer bulunmuştur. Bu sonuçlar, CLP-indüklenmiş fare sepsis modelinde, ROS kuşak oksidaz bağımlı NADPH olduğunu göstermektedir. Son olarak, biz bir CCl 4-bağlı karaciğer hasarında modunda ROS üretimini tespit etmek bioluminescent görüntüleme kullanılırl. CCl 4 hepatosellüler nekroz neden olur ve akut karaciğer hasarı ve karaciğer fibrozisi 6 hem modellemek için kullanılır olmuştur. CCl 4 uygulamadan sonra 4 saatte fareler - iltihabı ve hasarı daha önce anlatılan modellerin aksine, biz karın ROS üretimi (yaklaşık% 35) S47 phox-/ başlangıca göre artış ılımlı olduğunu ortaya koymuştur. Fareler (Şekil 3 AB) - Ancak, 4-indüklenen ROS üretimi CCl büyüklüğünü S47 phox-/ daha yabani-tip farelerden anlamlı olarak daha fazla idi. Bu veriler hem S47 phox içeren NADPH oksidaz-bağımlı ve bağımsız ROS üretimi akut CCl 4-bağlı karaciğer hasarında meydana öneririz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> Zymosan tedaviden sonra akciğer Şekil 1. ROS üretimini. A) Temsilcisi bioluminescenROS üretimi ce görüntüleme. Fareler ve karın ışıldama zymosan muamele ile değişmez - göğüs ek olarak, lüminesans yabani-tip ve S47 phox-/ her ikisi de karın üzerine tespit edilebilir olduğuna dikkat edin. Yabani-tip ve S47 phox-/ ve göğüs B) foton sayım - zymosan bir (BT) intratrakeal tek enjeksiyondan sonra fareler. Biyoparlaklık görüntüleme taban, 4 saat ve 24 saat sonra yapıldı. Göğüs üzerinde ilgi bölgeden Işık emisyonu belirtilen sahte renk skalası kullanılarak tespit edilmiştir. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır ± SE, n = 6-9, grup başına * = p &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam için tıklayınız</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> Şekil 2. ROS tespiti sonrasında CLP. ROS üretimi, B A) Temsilcisi biyolüminesans görüntüleme) Foton göğüs sayıları ve yabani-tip ve S47 phox-/ ve karın C) foton sayımı - başlangıçta fare, 4 saat ve CLP sonra 24 saat. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır ± SE, n = grup başına 4-5, * = p &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam için tıklayınız</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> CCl sonrası karın 4-bağlı karaciğer hasarında Şekil 3. ROS üretimi. Oral CCl 4 tedaviden sonra başlangıçta fare, 4 saat ve 24 saat - ROS üretimi ve yabani-tip ve S47 phox-/ ve karından B) foton sayımı A) Temsilcisi biyolüminesans görüntüleme. . N = 4-5 grup başına, * = p &lt;0.05; Sonuçlar ortalama ± SE olarak sunulmuştur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">için tıklayınız büyük bir rakam</a> </a&gt;.

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
<li>Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p47phox+mouse+knock-out+model+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease.</a> J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).</li>
<li>Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+induction+of+inflammatory+responses+by+dectin-1+and+Toll-like+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2.</a> J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).</li>
<li>Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septic+shock%3B+current+pathogenetic+concepts+from+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Monit%22%5BJournal%5D)">Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective.</a> Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).</li>
<li>Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+carbon+tetrachloride+induced+liver+fibrosis%3A+Histopathological+changes+and+expression+of+CD133+and+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.</a> BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).</li>
<li>Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+complement-induced+lung+injury+in+mice+with+deficiency+of+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase.</a> J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).</li>
<li>Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidase+contributes+to+host+defense+against+Burkholderia+cepacia+in+the+p47%28phox-%2F-%29+mouse+model+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease.</a> Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical-free+biology+of+oxidative+stress.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).</li>
<li>Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture.</a> Shock. 24, 52-57 Forthcoming.</li>
<li>Wardman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+and+luminescent+probes+for+measurement+of+oxidative+and+nitrosative+species+in+cells+and+tissues%3A+progress%2C+pitfalls%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).</li>
<li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease%2C+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li>
<li>Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).</li>
<li>Daiber, A., Oelze, M., August, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+superoxide+and+peroxynitrite+in+model+systems+and+mitochondria+by+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012.</a> Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).</li>
<li>Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı hayvanlar reaktif oksijen türlerinin &quot;Gerçek zamanlı&quot; ölçümü (ROS) floresan ve kemilüminesans problar kullanılarak elde edilebilir. Floresan problar zayıf sinyal-gürültü oranı 12 olan muzdarip iken, açıklanan görüntüleme tekniği luminol tabanlı substrat L-012 ile ROS bir kimyasal reaksiyon sonrasında ışık emisyon tespiti için daha duyarlıdır. Tüm bioluminescent görüntüleme teknikleri gibi, bu metodoloji organ ve dokular tarafından dalgaboyu bağımlı ışık emilimi ve yayılımı ile sınırlıdır. Fare...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako Chemicals USA, Inc </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> Sigma, St Louis, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> karbon tetraklorid </td><td> Sigma, St Louis, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

farklı hayvan modelleri nadph oksidaz aktivitesinin biyoparlaklık görüntüleme

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oksidaz antibakteriyel ve antifungal konak savunma aracılık kritik bir enzimdir. Antimikrobiyal konak savunma rolüne ek olarak, NADPH oksidaz inflamatuvar yanıt 1 modüle kritik sinyalizasyon fonksiyonları vardır. Böylece, NADPH oksidaz kökenli ROS nesil &quot;gerçek zamanlı&quot; kinetik ölçmek için bir yöntem geliştirilmesi savunma, inflamasyon ve yaralanma barındırması ilgili mekanizmalar anlamak için değerli bir araştırma aracı olması bekleniyor. Kronik granülomatöz hastalık (CGD) ciddi enfeksiyonlar ve aşırı inflamasyon ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır. Fagosit NADPH oksidaz aktivasyonu, kendi sitosolik alt birimden (S47 phox, phox P67, P40 ve phox) ve bir membran-sınırlayıcı flavocytochrome (bir gp91 phox ve p22 heterodimeri phox oluşur) Rac translokasyon gerektirir. KayıpCGD bu NADPH oksidaz bileşenlerin sonucu herhangi birinde işlev mutasyonlar. ÇGD olan hastalarda benzer, gp91 phox-eksik farelerde ve S47 phox-eksik farelerde arızalı fagosit NADPH oksidaz aktivitesi ve bozulmuş konak savunması 13, 14 var. Yukarıda tarif edilen NADPH oksidaz bileşenler içeren fagositler, ek olarak, diğer hücre tipleri arasında, çeşitli NADPH oksidaz izoformları değişik ifade eder. Burada yaşayan farelerde ROS üretimini ölçmek ve inflamasyon ve yaralanma modellerinde ROS nesil NADPH oksidaz katkısını belirginleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir şarj bağlı cihaz (CCD) tarafından kaydedilir ışıldama yayma L-012 (luminol bir analog) ile reaksiyona ROS dayanmaktadır. L-012 prob orijinal tanımı olarak, L-012-bağlı kemiluminesans tamamen bu reaksiyon tespit ana ROS süper olduğunu gösteren, süperoksit dismutaz kaldırılmış;oksit anyon 15. Daha sonraki çalışmalar, L-012 reaktif nitrojen türleri 16, 17 gibi diğer serbest radikaller, tespit edebildiğini göstermiştir. Kielland ve ark. 17 forbol miristat asetat, NADPH oksidaz güçlü bir aktivatörü, bu topikal uygulama ışıldayan sonda L-012 fare kullanılarak tespit edilebilir oksidaz bağımlı ROS NADPH üretim yol göstermiştir. Bu modelde, L-012-bağımlı lüminesans S47 phox-eksik farelerde kaldırılmış olduğunu gösterdi. Biz yabani-tip farelerden ve NADPH oksidaz eksikliği S47 phox-/ ROS üretimi karşılaştınl - aşağıdaki üç model fareler 2: zymosan, NADPH oksidaz aktive edebilirsiniz duvara türetilmiş ürün pro-inflamatuar fungal hücre 1) zerk; 2) çekal ligasyon ve delme (CLP), sekonder akut akciğer inflamasyonu ve hasarı ile intra-abdominal sepsis modeli ve 3) sözlü karbon tetraklorür(CCl4), ROS-bağımlı karaciğer hasarının bir model. Bu modeller özellikle sırasıyla, non-enfeksiyöz inflamasyon, polimikrobiyal sepsis ve toksin kaynaklı organ hasarının bağlamında NADPH oksidaz bağımlı ROS üretimi değerlendirmek için seçilmiştir. S47 için yabani-tip farelerde biyolüminesans karşılaştırma phox-/ - farelerde bize bu modellerde bioluminescent sinyal S47 phox içeren NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS özgül katkıda tasvir sağlar. S47 ile karşılaştırıldığında yabani-tip farelerden artmış ROS seviyeleri gösterdi Biyoparlaklık görüntüleme sonuçları phox-/ - farelerde NADPH oksidaz enflamatuvar uyaranlara yanıt olarak ROS üretiminin ana kaynağı olduğunu belirtti. Bu yöntem, in vivo enflamasyon sırasında ROS nesil &quot;gerçek zamanlı&quot; izlenmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sağlar.

NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) &#39;dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

NADPH oksidaz, antibakteriyel ve antifungal konakçı savunmasına aracılık eden kritik bir enzimdir. Antimikrobiyal konakçı savunmasındaki rolünün yanı sıra NADPH...

Bu prosedürün genel amacı, üç farklı inflamatuar fare modelinde N-A-D-P-H oksidaz kaynaklı reaktif oksijen türlerinin veya ROS üretiminin gerçek zamanlı izlenmesi içinle minimally invaziv bir yaklaşım sağlamaktır. İlk model, pro-inflamatuar bir molekül olan Xan'ın anestezi altındaki farelerin trakeasına enjekte edildiği intratrakeal Xan uygulamasıdır. Xan, N-A-D-P-H oksidazı aktive edebilen, fungal hücre duvarı kaynaklı bir üründür.İkinci model, ligasyon ve perforasyon veya CLP modelidir. Bu modelde, farenin karnı açılır ve intraabdominal sepsis ile sekonder akut akciğer enflamasyonu ve hasarı oluşturmak için sekum ipek sütür ile ligatlanır ve ardından bir iğne ile delinir. Üçüncü model, oral gavaj yoluyla karbon tetraklorür uygulamasıdır.Karbon tetraklorür, hepatoselüler nekroza neden olur ve hem akut karaciğer hasarının hem de hepatik fibrozun modellenmesinde kullanılabilir. ROS üretimini değerlendirmek için model fareler üzerinde biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirilir. Elde edilen veriler, inflamatuar stimülasyonlara yanıt olarak ROS oluşumunun ana kaynağının N-A-D-P-H oksidaz olduğunu göstermektedir.Bu tekniğin, örneğin Florence probu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, in vivo inflamasyon sırasında RS oluşumunun gerçek zamanlı izlenmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sunmasıdır. Bu yöntem, akciğer inflamasyonu ve hasarında RS'nin rolü gibi, savunma sonrası inflamasyon ve hasardaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, konak savunmasında reaktif oksijen türlerinin rolü üzerine çalışmaya başladığımızda ortaya çıkmıştır. Bu videoda gösterilen ROS oluşumuna dair her üç hayvan modeli için de geçerlidir.P 47 Fox null fareler ile yaş ve cins açısından eşleştirilmiş C 57 BL six DBA fareler kullanın. Xin'in intratrakeal uygulamasına hazırlık olarak, deneyler için kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinden onay alın. Cerrahi platformu %70 etanol ile sterilize edin ve üzerini steril bir pedle kaplayın.Cerrahi işlem; temiz bir cerrahi önlük, eldiven ve maske giyilerek ve anestezi için steril aletler kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Sürekli isofloran uygulama sisteminin vaporizatörünü %2 ila %3 isofloran ile doldurun ve cihazı açın. Ardından, iki ila üç dakika sonra fareleri anestezi odasına yerleştirin; ayak parmaklarını sıkarak, solunumu ve hareketleri gözlemleyerek farelerin tamamen anestezi altında olduğunu doğrulayın.Solunum hızı yaklaşık %50 oranında düşürülmelidir. Ardından, tüy alma makinesi kullanarak farenin boynunun ön kısmındaki insizyon bölgesini tıraşlayın. Fareyi cerrahi platform üzerine düz bir pozisyonda yerleştirin ve anesteziyi sürdürmek için bir burun koni yerleştirin. Boyun bölgesine sırasıyla Betadine ve %70 etanol uygulamasını üç kez tekrarlayın.Ardından, düz ve keskin bir makas kullanarak ön boyun derisini yaklaşık 0.5 santimetre kesin. Daha sonra, Xan'ı intratrakeal olarak uygulamak için trakeayı açığa çıkarmak amacıyla kavisli pens ile trakea etrafındaki kasları diseke edin. Trakeayı, kıkırdak halkalar arasındaki orta kısımdan delmek için 27 gauge iğne uçlu bir şırınga kullanın.Ardından iğneyi ön tarafa yönlendirin ve vücut ağırlığının gramı başına bir mikrogram Xan'ı yavaşça enjekte edin. İnsizyonu ameliyat sonrası beş adet steril naylon sütürle kapatın. Fareyi, üzeri düz kağıtla örtülmüş bir iyileşme kafesine yerleştirin ve iyileşme kafesinin yarısını bir ısıtıcı pedin üzerine koyun.Fareleri, uyanana ve serbestçe hareket edene kadar izleyin. İkinci bir ligasyon ve ponksiyon gerçekleştirmek için, anestezize edilmiş bir farenin karnını tıraş makinesiyle tıraş edin ve fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi platforma yerleştirin. Ardından cerrahi bölgeyi Betadine ve %70 ethanol ile dezenfekte edin.Daha önce bistüri kullanıldığı gibi, makas yardımıyla abdominal orta hat derisinde 1,5 santimetre uzunluğunda bir insizyon yapın. Peritonyumu kesin ve bir ekartör ile abdominal boşluğu açarak, abdominal boşluğun sol tarafında bulunan sekumu bulun ve açığa çıkarın. Ezmeyen pensler kullanarak ekteryorize edin.Ardından, açığa çıkarılan sekumun distal %50'lik kısmını dört adet ipek sütür ile bağlayın. Bağlama bölgesinin distalinden sekumu delmek için 21 gauge bir iğne kullanın. Sekumu karın boşluğuna geri yerleştirin.Karın duvarını kapatmak için dört adet sterile naylon sütur kullanın. Ardından insizyonu beş sterile naylon sütur ile kapatın. Subkutan olarak 2.5 micrograms buprenorphine içeren 0.5 milliliters salin uygulayın ve daha önce olduğu gibi postoperatif gözlem gerçekleştirin.Oral karbon tetraklorür, reaktif oksijen türlerine bağlı hepatik hasar modelidir; karbon tetraklorürü oral gavajla uygulamak için, ensesinden tutulmuş ve anestezi uygulanmış farenin başı yemek borusuyla dikey hizada tutulur. Ardından, karbon tetraklorür içeren 22 gauge'lik bir besleme ve dozaj iğnesinin ucu kesici dişlerin arkasından, boğazın arka kısmına ve yemek borusuna doğru yönlendirilerek yerleştirilir ve karbon tetraklorürü uygulamak için piston basılır. Fare, derlenme süreci boyunca izlenir; biyolüminesans görüntüler ROS üretimi tetiklenmeden önce ve tetiklendikten 4 ve 20 saat sonra alınmalıdır.Bunun için Live Image 4.2 yazılımını açın. Ardından, IVIS 200 görüntüleme sistemini başlatmak için "initialize" butonuna tıklayın ve sistemi lüminesans moduna ayarlayın.Yazılımdaki ekranda belirtilecek olan şarj coupled cihaz sıcaklığının sabitlenmesini bekleyin. Pozlama süresini 40 saniyeye ayarlayın. Ardından Benning ayarını orta seviyeye ve F-stop değerini sekizde bire getirin.Anestezize edilmiş bir fareyi, sıcaklık kontrollü sahneye sahip görüntüleme odasına sırt üstü pozisyonda yerleştirin. Her görüntü yakalamadan iki dakika önce, daha önce olduğu gibi anestezi uygulamak için bir burun konisi yerleştirin. Lüminal türev L 0 1 2'den 50 µL'yi intravenr olarak uygulamak için 27 gauge iğneye sahip bir mililitrelik şırınga kullanın.Retroorbital enjeksiyon yapın. Son olarak, görüntülere ulaşın ve bunları açıklandığı şekilde analiz edin. Videonun bir sonraki bölümünde, yazılımda yer alan Living Image yazılım versiyon 4.2'yi kullanarak toplanan verileri analiz edin.Bir görüntü açın ve araç paletindeki ROI araçlarına tıklayın. Ardından, ROI araçları menüsünden ROI şeklini seçin ve açılır listeden daireye tıklayın. Görüntüye eklenecek ROI sayısını seçin.ROI araçları menüsünden, ilgi bölgesindeki sinyal yoğunluğunu veya foton akısını nicelendirmek için ROI konumunu göğüs ve/veya karın üzerine göre ayarlayın. Görüntülerde oluşturulan tüm ROI'lere ait verileri görüntüleyen ROI ölçüm tablosunu açmak için ölçüm düğmesine tıklayın. Vahşi tip ve N-A-D-P-H oksidaz eksikliği olan farelerin akciğerlerindeki ROS üretimini karşılaştırmak için, bireysel zaman noktalarında Bon Ferone post testi ile iki yönlü ANOVA gerçekleştirmek üzere bir istatistiksel analiz yazılım paketi kullanın.Xan challenge sonrası P 47 Fox null fareler. Xan, bu videoda açıklandığı şekilde bazal seviyede, dördüncü saatte ve 24. saatte uygulanmıştır. Fareler burada gösterildiği gibi görüntülenmiştir.Yaban tipi farelerde göğüs bölgesindeki foto emisyonda, bazal seviyeye kıyasla dört ve 24 saatte anlamlı bir artış gözlemlenirken, P 47. Fox sno farelerinde bu artış görülmemiştir. Bu durum, XUS Sand uygulaması sonrası akciğerlerdeki ROS üretiminin temel kaynağının N-A-D-P-H oksidaz olduğunu göstermektedir.Ardından, CLP ile indüklenen sepsis modelinde ROS üretimi değerlendirildi. Sepsis, akut akciğer hasarı ve akut respiratuar distres sendromu dahil olmak üzere uç organ hasarıyla ilişkilendirilen, yaşamı tehdit eden bir sendromdur. ROS aracılı hasarın, sepsise bağlı çoklu organ fonksiyon kaybını tetikleyen önemli bir faktör olduğu kabul edilmektedir.Bu grafikte gösterildiği üzere, vahşi tip farelerde ROS seviyeleri CLP sonrası göğüs bölgesinde dört saatte, karın bölgesinde ise CLP sonrası 24 saatte önemli ölçüde artmıştır. Buna karşın, P 47 Fox null farelerdeki ROS seviyeleri, her iki zaman noktasında da bazal seviyelere benzerlik göstermiştir. Bu sonuçlar, CLP ile indüklenen sepsis fare modelindeki ROS üretiminin N-A-D-P-H oksidaz bağımlı olduğunu göstermektedir.Son olarak, karbon tetraklorür ile indüklenen bir karaciğer hasarı modelinde ROS üretimini saptamak için biyolüminesans görüntüleme kullanılmıştır. Önceden açıklanan inflamasyon ve hasar modellerinin aksine, karbon tetraklorür uygulamasından dört saat sonra P 47, Fox null farelerin abdomenindeki ROS üretimi, bazal seviyenin yaklaşık %35 oranında düşük bir artış göstermiştir. Bununla birlikte, karbon tetraklorürle indüklenen ROS üretimi miktarı, wildtype farelerde P 47 Fox null farelere göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur.Bu veriler, akut karbon tetraklorürle indüklenen karaciğer hasarında hem P47phox içeren N-A-D-P-H oksidaz bağımlı hem de bağımsız ROS üretiminin gerçekleştiğini göstermektedir. Yabanıl tip farelerde P47 nakavt farelere kıyasla artmış ROS seviyelerini gösteren biyolüminesans görüntüleme sonucu, inflamatuar stimülüse yanıt olarak RS üretiminin ana kaynağının N-A-D-P-H oksidaz olduğunu göstermiştir.Bu yöntem, in vivo inflamasyon sırasında RS oluşumunun gerçek zamanlı izlenmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sunmaktadır.

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Gua Sha, geleneksel Çin tedavi cilt kazıma, subkutan mikrovasküler kan ekstravazasyon neden olur. Biz, biyoparlaklık görüntüleme protokolü rapor...

Hem oksijenaz-1 ekspresyonunun Gua Sha Usul Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini...

Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Kaynak: Valentine, M. E. ve diğerleri, Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silinme Mutantlarının Üretimi ve Basit Fare Enfeksiyon Modelinde Virulans Zayıflamasının Testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyonu izlemek için biyolüminesans tabanlı görüntüleme yaklaşımının kullanıldığını göstermektedir. Ardışık biyolüminesans ve X-ışını görüntüleme, konak genelinde yayılan enfeksiyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi ve anatomik lokalizasyonu mümkün...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde bakteriyel enfeksiyonun gerçek zamanlı görüntülemesi

Kaynak: Weber, R. Z., et al., Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İntraserebral Transplantasyon ve İn Vivo Biyolüminesans İzleme. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, bir fare beynine enjekte edilen genetik olarak değiştirilmiş insan nöral progenitör hücrelerinin in vivo biyolüminesans görüntüleme yöntemini göstermektedir. İşlem, lusiferin enjeksiyonu, görüntüleme hazırlığı ve enjeksiyon bölgesinde nakledilen hücrelerden biyolüminesan sinyallerin tespit edilmesini içerir.

Bir fare beyninde insan nöral progenitör hücrelerinin in vivo biyolüminesans görüntülemesi

Biz inflamatuvar aşamaları ayırt için invaziv olmayan bir görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Luminol sistemik teslim nötrofillerinde MPO aktivitesi bağlı akut inflamasyon alanları ortaya koymaktadır. Bunun aksine, lusigenin enjeksiyon makrofajlarda Phox aktivitesi bağlı kronik inflamasyon görselleştirme sağlar.

In vivo Görüntüleme Yöntemi Akut ve Kronik İltihap ayırt

Model organizma Caenorhabditis elegans'ta mitokondriyal inhibitörlerin etkilerinin in vivo tespiti ve potansiyel arttırıcı bileşiklerin tanımlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonu modüle eden bileşikler için ilaç kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Küçük moleküllü bir substratı oksitleyen bir lusiferaz enzimi tarafından yayılan biyolüminesans ışığı, bir lusiferin, fotosensoriyel proteinleri aktive etmek için kullanılabilir, böylece ışık stimülasyonuna başka bir boyut ekler ve hücrelerde zamansal ve mekansal ölçeklerde çok sayıda ışık aracılı fonksiyonun manipülasyonunu sağlar.

Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

Öğrenin, farelerde NADPH oksidaz kaynaklı reaktif oksijen türlerinin biyoluminesans görüntüleme ile gerçek zamanlı izlenmesi için minimal invaziv bir yöntemi. Bu teknik, inflamatuar hastalıklarda ROS dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

Daha fazla video keşfet