Epitel Hücre lizatları bir GST-etiketli Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) Kullanarak Active Rho-gefs ve Affinity Yağış

Bu prosedürün genel amacı, aktive edilmiş Gs proteinlerine karşı yüksek afiniteye sahip mutant RhoA GST füzyon proteinini kullanarak, kültürlenmiş hücrelerdeki spesifik G-D-P-G-T-P değişim faktörlerinin veya gaf'ların aktivasyonunu takip etmektir. Bu işlem, öncelikle GST etiketli mutant RhoA proteininin bakterilerde üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, boncuğa bağlanmış GST RhoA saflaştırılır.

Ardından, GST RO A proteininin saflığı ve konsantrasyonu SDS page kullanılarak değerlendirilir. Son olarak, hücre lizatları hazırlanır ve GST RO A proteini ile bir GEF çöktürme deneyi gerçekleştirilir. Nihayetinde, çöktürülen proteinlerin spesifik bir anti GF antikoru ile western blot analizi ve densitometrik miktar tayini yoluyla, işlem görmüş hücrelerde aktive olmuş GS'nin çöktürmesinin arttığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, ham GTPS alanındaki birçok heyecan verici sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, çok sayıda row G-D-P-G-T-P değişim faktörleri sinyale özgü bir şekilde nasıl düzenlenir ve aktiviteleri nasıl koordine edilir? Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, GST RO G 17 A proteininin nispeten kararsız olması ve hazırlama sırasında parçalanabilmesi nedeniyle başlangıçta zorluk çekeceklerdir. Ayrıca, GF çöktürme analizinin hızlı ve tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Pfizer Vahid, e coli transformasyonu yoluyla gösterecektir.

DH5α kompetan hücrelerin 1/4'lük hacmini buz banyosunda hızlıca çözün ve üzerine 25 ila 50 ng/µL konsantrasyonunda 1 µL pX-rowA-G17A DNA ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın ve 30 dakika boyunca buzda inkübe edin. Hücrelere 42 °C'de 45 saniye boyunca ısı şoku uygulayın ve ardından iki dakika boyunca tekrar buzun üzerine yerleştirin.

900 µL SOC besiyeri ekleyin ve 37 °C'de çalkalamalı olarak bir saat boyunca büyütün. Bükülmüş steril bir pasta pipet kullanarak, transform edilmiş bakterilerin 50 ila 100 µL'sini önceden hazırlanmış LB agar ve persin plakasına yayın. Plağı 37 °C'lik bir inkübatörde beş dakika boyunca düz konumda inkübe edin, ardından ters çevirerek gece boyunca büyütün.

Transforme edilmiş bakterilerin iyi izole edilmiş bir kolonisini seçin ve bunu ampisilinli 50 mililitre LB besiyerini inoküle etmek için kullanın. 37 °C'de, ajitasyon altında gece boyunca büyütün. Kültür tam yoğunluğa ulaştığında, 450 mililitre ampisilinli LB ile seyreltin ve 30 dakika daha büyütün. 500 mililitrelik kültüre 500 mikrolitre 100 milimolar IPTG ekleyerek, 37 °C'de bakterileri raw protein üretmesi için indükleyin.

Sıcaklığı 22 ila 24 °C'ye düşürün ve yaklaşık 16 saat boyunca büyütün. Kültürü 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.600 ×g hızında santrifüj edin. Peletleri en az bir saat veya tercihen gece boyunca -80 °C'de dondurun.

Yazılı protokolde belirtildiği gibi 200 mililitre lizis tamponu hazırladıktan sonra, buz üzerinde çalışarak 10 mililitre tamponu bir milimolar DTT, bir milimolar PMSF ve bir proteaz inhibitör tableti ile takviye ederek lizis tamponu plus hazırlayın. Thor peletlerine 10 mililitre lizis tamponu plus ekleyin ve pipetleme ve vorteksleme yoluyla iyice süspanse edin. Süspansiyonu buz üzerinde, dört ayarında ve %50 puls ile bir dakika boyunca sonike edin.

Sonike edilmiş lizatı 4 °C'de 15 dakika boyunca 15.000 ila 20.000 ×g'de santrifüjleyin ve berraklaşmış sonikatı steril kapaklı 15 mL'lik bir tüpe aktarın. %75'lik süspansiyonu nazikçe karıştırarak ve geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak 335 µL'yi 15 mL'lik bir tüpe aktararak glutatyon sfero boncuklarını hazırlayın. 10 mL soğuk PBS ekleyin ve 4 °C'de beş dakika boyunca 500 ×g'de santrifüjleyin.

Süpernatantı atın. Boncuklara 1 mL lize tamponu artı ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı tekrar atın ve lize tamponu ekleyin.

Ayrıca, %50'lik bir süspansiyon hazırlamak için, iki adet 50 µL dengelenmiş boncuk süspansiyonunu hazırlanan süpernatant ile birleştirin. 4 °C'de 45 dakika boyunca rotasyona tabi tutun. 100 mL HBS tamponuna 5 mM magnezyum klorür ve 1 mM DTT ekleyerek HBS plus hazırlayın; süpernatant ve boncukları 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 ×g hızında santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve boncukları iki kez 10 milliliters lysis buffer plus ile ve iki kez 10 milliliters HBS plus ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncukları proteaz inhibitörü eklenmiş HBS plus içinde yeniden süspanse ederek %50'lik bir bulamaç hazırlayın. Nihai boncuk preparasyonunun 10 microliters kısmını, beamr cap iki ethanol içeren iki katı lam ly örnek tamponu ile seyreltin.

Ardından, 2 mg/mL BSA stok çözeltisinden sırasıyla 10 µL, 5 µL ve 2,5 µL'yi, 10 µL Laemmli tamponu ile karıştırarak üç adet BSA standart örneği hazırlayın.

Numuneleri beş dakika boyunca kaynatın, ardından kısa süreliğine santrifüjleyin ve boyama işleminin ardından %10'luk SDS poliakrilamid jel üzerinde moleküler ağırlık belirteci ile birlikte yürütün; BSA standartlarını referans olarak kullanarak GST row A G 17 A'nın jel üzerindeki değerini tahmin edin. Yaklaşık 10 ila 15 µg protein içeren boncuklardan eşit hacimlerdeki porsiyonları 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırın. GF pull-down deneyi hazırlığı için, kullanılacak hücreleri 10 cm'lik kaplarda konfluens seviyesine gelene kadar büyütün ve deneyden önce en az üç saat boyunca serumdan yoksun bırakın.

Analiz başlamadan hemen önce, buz üzerinde çalışarak proteaz inhibitörleri eklenmiş lizis tamponu hazırlayın. Kaplardaki kültür ortamını uzaklaştırın ve buz gibi soğuk HBS ile yıkayın.

Tüm HBS'yi uzaklaştırın ve her bir kaba 700 µL lysis Buffer plus ekleyin. Tüm alanları kaplayacak şekilde plakaları sallayın.

Ardından lizatları sıyıra sıyıra toplayın ve numaralandırılmış 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. 4 °C'de, bir dakika boyunca 15,000 ×g hızda santrifüjleyin. Her plaka için hücre sayısı eşdeğerse, analiz için üst fazı saklayın; her bir üst fazdan 30 µL alın ve 30 µL 2x indirgeyici lizis örnek tamponu ile karıştırın.

Ardından kaynatın ve buz üzerinde bekletin. Geri kalan süpernatantları, GST row a G 17 A boncukları içeren alikotlara ekleyin ve 4 °C'de 45 dakika boyunca rotasyona bırakın. Boncukları 4 °C'de 10 saniye boyunca 6.800 ×g hızında santrifüjleyin.

Süpernatantı atın ve boncukları lizis tamponu ile üç kez yıkayın. 30 gauge iğne takılı 1 cc'lik bir şırınga kullanarak son yıkama sıvısını tamamen uzaklaştırın ve 20 µL iki kat konsantrasyonlu indirgen laly örnek tamponu ekleyin. Örnekleri beş dakika boyunca kaynatın, boncukları çöktürmek için santrifüjleyin ve toplam hücre lizatları ile çöktürülmüş protein örneklerini, incelenen GF boyutuna uygun yüzdedeki SDS-PAGE jeli üzerinde yürütün.

Son olarak, ilgili GF'yi başarılı bir GF analizi ile tespit etmek için western blotting uygulayın. Değişim faktörü GFH 1'in aktivasyonunun tespiti burada gösterilmiştir. A G 17 A protein satırı, kontrol hücre lizatlarından bir miktar GFH 1 yakalayarak GFH 1'in bazal aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir.

Buna karşın, TNF-α'nın G FH1'i aktive ettiği görüşüyle uyumlu olarak, inflamatuar sitokin tümör nekroz faktör alfa ile işlem görmüş hücrelerde çöktürülen miktar artış göstermiştir. Önemli bir nokta olarak, toplam hücre lizatı kontrol ve işlem görmüş örnekte benzer miktarlarda gfh1 göstermekte; bu durum, işlemin G FH1 seviyelerini değiştirmediğini ve analizde kullanılan giriş miktarının eşit olduğunu göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, GSE RO G 17 A proteininin ve hücre lizatlarının buz üzerinde tutulması önemlidir.

GF analizini hızlı ve tutarlı bir şekilde gerçekleştirin ve geçersiz kılma ile sorun giderme işlemlerine olanak sağlayacak yeterli pozitif kontroller kullanın.