Name: Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Öğrenin, endotelyal hücre kaplı mikroakışkan cihazlarla hematolojik hastalıklardaki mikrovasküler etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, kan hücreleri ve endotelyal hücreler arasındaki biyofiziksel etkileşimleri kontrollü ortamda çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz T. Hunt, M. Rosenbluth ve onların tavsiye ve faydalı tartışmalar için Lam Lab teşekkür ederim. Biz G. Spinner gelen destek ve Teknoloji Georgia Institute Elektronik ve Nanoteknoloji Enstitüsü kabul ediyorsunuz. Bu çalışma için maddi destek bir NIH hibe K08-HL093360, UCSF REAC ödül, bir NIH Nanotıp Geliştirme Merkezi Ödülü PN2EY018244 ve Atlanta Çocuk Sağlık ve Endotel Hücre Biyolojisi Merkezi&#39;nden fon tarafından sağlandı.

1. Endotel mikrocihazda Fabrikasyon <ol><li> Dışarıdan bir maske satıcıya mikroakışkan cihazın bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) çizim göndererek bir photomask oluşturun. Kullanılan maske soda kireç camına bir krom tabakası oluşuyordu. Bu durumda mikroakışkan kanalın eni 30 mikron olmuştur. </li><li> 15 dakika boyunca piranha sahip çıplak silikon (sülfürik asit ve hidrojen peroksit 10:01 oranında) temizlemek ve 30 saniye boyunca hidroflorik asit eğimlidir. Yaklaşık 10 saniye deiyonize (DI) su ile durulayın. </li><li> 30 mikron yüksekliğinde gofret üzerine bir spin lak kullanılması, spin Microchem SU-8 2025 fotorezist. SU-8 2025, 3000 rpm arasında bir dönüş hızı tavsiye edilir. SU-8 diğer viskoziteler Bu yüksekliğe ulaşmak hangi mevcuttur. SU-8 kullanmak için Tam talimatlar mevcuttur <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> Için 95 ° C&#39;de bir ocak gözünde SU-8 ile gofret yerleştirin5 dakikadan fazla çözücü kovmak için. Not: Bir fırın, bir ocak gözünün farklı gofret kurulayın ve edecektir tavsiye edilmez. </li><li> Gofret üzerinde istenilen özelliği şekli ile bir maske yerleştirin ve UV ışık (160 mj ​​/ cm 2 maruz Bir maske hizalama (Karl süß, MA-6)) 365 nm&#39;de ölçülür. Bu çapraz fotorezist bağlar. </li><li> Daha da SU-8 polimerizasyon hızlandırmak için ek bir 5 dakika süreyle 95 ° C &#39;de bir ısı plakası üzerine geri gofret yerleştirin. </li><li> Olmayan bir çapraz bağlı SU-8 kaldırmak 4 dakika boyunca PGMEA (propilen glikol metil eter asetat) ile esas olarak oluşan SU-8 Developer gofret, batırmak. </li><li> 10 sn için% 100 izopropil alkol (IPA) sahip yeni geliştirilen gofret çalkalayın. Gofret ve sonra solvent birkaç dakika için temiz bir çeker ocak içinde gofret buharlaşmasına izin vererek veya basınçlı nitrojen kullanılarak kurutulur. </li><li> Teyp bir petri kaplarına desenli SU-8 ile kuru gofret kenarlarına öncesi içinhareketi için önlem alınmalıdır. </li><li> Gofret tam kaplama sağlamak için petri üst ve girdap gofret ile kapağı, bir pipet kullanarak gofret için Sigmacote 1 mL uygulayın, kapağını kaldırın ve tüm çözücü çekinceye kadar gofret, birkaç dakika kurumasını bekleyin. </li></ol> 2. PDMS (polidimetilsiloksan) hazırlanması <ol><li> Mix PDMS polimer ve sertleştirici 10:1 oranı (w / w) az ve bir vakum desikatörde kullanarak hava kabarcıklarını çıkarmak. Gazını almak PDMS için gerekli olan zamanın uzunluğu, kullanılabilir vakum sisteminin gücüne göre değişir, ancak genellikle birkaç dakika ile bir saat arasında değişmektedir. Için bir önceden döküldü PDMS, polimerin 60 mL toplam hacim ile altı inçlik petri tavsiye edilir. </li><li> Yaklaşık 5 mm kalınlığında, gofret üzerine karışımı dökün. Ayrıca, PDMS ince bir tabaka oluşturmak için, düz dipli çanak üzerine yaklaşık 1 mm kalınlığında dökün. 60 gece boyunca bir fırında ° C&#39;de tedavisi. </li><li> Bir bıçak ya da bistüri kullanarak, c etrafında kesipPDMS cihaz edili ve gofret çıkarın. Buna ek olarak, cihaz, biraz daha büyük PDMS ince bir tabaka kesilir. </li><li> 1.0 mm delik kullanarak PDMS cihazın giriş ve çıkış delikleri oluşturun. Bu da iğne mengenesi, Harris Uni-Core veya benzer bir cihaz kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Cihazın yüzeyler ve seloteyip kullanılarak levha temizlenir. </li><li> Ve plazma kullanılarak, PDMS aygıtı ve 30 saniye bir oksijen plazmaya PDMS tabakanın yüzeyi maruz bırakmaktadır. Oksijen plazma fiziksel temas ettirilir bağı PDMS açıkta kalan yüzeyi üzerinde reaktif türün oluşturur. </li><li> PBS içinde insan plazmasından 50 ug / ml fibronektin ile doldurulmuş sırayla bir küt-noktası iğne ile bir şınngaya bağlanmış bir çok tüp küçük bir uzunluğu (birkaç santimetre), daha küçük boru bağlanır. Tüp ve iğne bir sürtünme uygun borular arasında oluşturulan bu tür ölçekli vardır. Küçük PDMS mikrocihazda girişinde boru ve eklemepply şırıngaya basınç fibronektin çözeltisi ile tamamen kanalları doldurmak için ve çıkış deliği küçük bir 100 uL damla oluşturmak için, kanallar ıslak kalmasını sağlamak için. 40-60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe cihazı. </li><li> Künt noktaya iğne için PBS ile dolu yeni bir şırınga bağlayın. PBS ile cihaz durulama şırıngaya basınç uygulayın. </li></ol> 3. Endotel Hücreleri ile mikroakışkan Aygıt tohumlama <ol><li> % 8 dekstran ile endotelyal büyüme ortamında insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC&#39;lere) 1.000.000 hücre / ml hazırlayın. 500.000 ile 2.000.000 hücre / ml Bir dizi başarıyla kullanılmaktadır. Hücre yükleme orta dekstran ilavesiyle bunlar fibronektin kaplı mikroakışkan sistemi girerken endotel hücrelerinin hızı azalır sıvısı, viskozitesi arttırır. Bu da, hücrelerin mikrocihazda içinde başarıyla yapışır ve kültür olasılığını artırır. </li><li> CAdım 2.7 gibi yeni şırınga ve tüp onnect. fakat daha uzun bir boru ile (uzunluk yaklaşık 1 metre). </li><li> Bu sistemin performansını optimize etmek için, tüm perfüzyon sisteminde herhangi bir sızıntı veya kabarcıklarını engellemek için bu noktada önemlidir, çözüm ya da medyada kabarcıklarının varlığı herhangi bir sızıntı akışını değiştirebilir ve endotelyal hücrelerin başarılı tohumlama önleyecektir. Bu nedenle, boru sıkı uyan herhangi bir bağlantıları arasındaki sızıntıyı ortadan kaldırmak için gereklidir. Hücreleri mikrocihazda tanıtıldı ve tüm perfüzyon sistemi hava kabarcıklarının giriş önlemek için mikroakışkan tüp takmadan önce hücre çözümü ile astarlanmalıdır önce şırınga ve / veya boru Bubbles ortadan kaldırılmalıdır. </li><li> Bir şırınga pompası kullanılarak, 37 de 2 saat için 1.23 ul / dak akış hızında hacimsel PDMS aygıtı içine hücre süspansiyonu aşılamak ° C&#39;de ve% 5 CO2. Şırınga pompası olduğu zaman iyi sonuçlar elde edildi<html> PDMS aygıtı olarak aynı yükseklikte. Girişi için inkübatöre içinde sarmal olabilir uzun tüp, hücreler ve medya yeterince cihazı ile temas öncesi ılıtıldı edilmesini sağlar. Bizim sistemde, 1.23 ul / dakika debili ~ 1 dyne / tam kan kullanarak bu kanalları cm 2. Bir duvar kayma gerilmesi karşılık küçük mikrokanallarda içinde ~ 1 mm / s orta akım hızı yaklaşık olarak </li><li> 1,23 ul / dk oranında 2-8 gün boyunca aynı şırınga pompası ve uzun bir tüp, yayma taze büyüme ortamı kullanılarak. Başarılı bir cihaz 24-48 saat içinde aygıt iç büyüyen endotel hücreleri, bir tek tabakalı sahip olacaktır. Önceki deneyler konfluent mono tabakalar uygun bir cihaz 14 boyunca hücre-hücre kavşaklarda VE-cadherin ifade olduğunu göstermiştir. </li><li> Deneysel sistem içine kan veya hücre süspansiyonu enjekte edilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar _content &quot;&gt; Bu protokol kullanılarak standart litografik imalat teknikleri fizyolojik olarak mikrovasküler (Şekil 1a) sizescale taklit mikroakışkan kanal üretmek için gerekli kalıp oluşturmak için kullanılır. optimize edilmiş bir perfüzyon tekniği kullanarak, endotel hücreleri daha sonra, tohum ve confluently kültürü mikroakışkan sistemi şeffaf olduğu için hücre ekimi 24-48 saat içinde mikroakışkan sistemi (Şekil 1B) tüm iç yüzünü., tüm mikrocihazda görüntüleme ve veri toplama için bir aydınlık / floresan mikroskop sahnede yerleştirilebilir. Sistemimiz daha sonra orak kırmızı hücreleri ve anormal lökosit ve endotel adezyon artan sertlik mikrovasküler obstrüksiyon katkıda bulunduğu gibi orak hücre hastalığı gibi biyofiziksel özellikleri, değiştirilemez barındırır hematolojik hastalıklar çalışma uygulanabilir. Klinik olarak onaylanan ilaç, hidroksiüre, belirtiler ancak d düzeltirmikrovasküler akımı üzerine irect etkisi bilinmemektedir. Bizim test hesabı hücre sertliği ve yapışma hem de içine alır ve hidroksiüre önemli orak hücre hastalığı (Şekil 2) akış düzeltir olduğunu gösteriyor. Bu sistemin ideal kan hücrelerinin mikrovasküler birbirlerine ve endotel hücreleri ile etkileşim içinde herhangi bir hematolojik süreci incelemek için uygundur gibi orak hücre hastalığı, mikrovasküler-on-a-chip için bir uygulama sadece bir örnektir. Daha temel uygulamaları pek çok diğerleri arasında lökosit biyoloji ve hematopoetik kök hücre biyolojisi, yer alırken, diğer klinik uygulamalar inflamatuar hastalıklar, sepsis / akciğer hasarı, trombotik mikroanjiopatilerdir, sıtma ve kanser metastazı içerir. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. A) endothelializasyona önce, başlangıç ​​PDMS mikroakışkan cihazı. Burada, mikrocihazda wit enjekte edilirh gıda sisteminin sizescale ve genel tasarımı göstermek için boyama. B) aydınlık mikroskobu mikroakışkan sistemi tamamen burada açıklanan protokolü kullanılarak hücre ekiminin 48 saat içinde endothelialized gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. A) mikrokanallar ile mikrovasküler-on-a-chip post-kapiller venüller (30 mikron), en orak hücreli mikrovasküler obstrüktif olayların sitenin boyutu yakındır. Hidroksiüre alan orak hücre hastalarında ve hidroksiüre almayan hastalardan tam kan iki farklı mikrodolaşımını-on-a-chip cihazlar üzerinden akar. Endothelialized mikrokanallar içinde göreli kolaylıkla hidroksiüre akımlarının alan orak hücre hastalarında B) Tam kan. C) aynı hemodinamik şartlar altında, hidroksiüre almayan orak hücre hastalardan alınan kan, bununla birlikte, microch ile çok daha yavaş akış sergileyenannel tıkanıklığı. Alt kanalı tamamen hiçbir akışı ile engellenmiş ve diğer endothelialized mikrokanallardaki akım hızları hidroksiüre durumda önemli ölçüde daha düşüktür edilir. Her üç görüntüler ölçek çubuğu 30 mikron olduğunu.

<ol><li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li>
<li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li>
<li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li>
<li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li>
<li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li>
<li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li>
<li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li>
<li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolytic+uraemic+syndrome%3A+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim endothelialized mikrocihazda sistemi in vivo deneyler ile birlikte kullanıldığında en uygun olan, ve indirgemeci bir yaklaşım, insan ve hayvan modellerinde gözlenen hematolojik süreçlerinin biyofiziksel mekanizmaları aydınlatmak yardımcı olabilir. Ayrıca, sistem sınırlamaları olmaksızın değildir. Örneğin, bizim mikroakışkan kanal kesitinin kare vardır. Teknik dairesel mikrokanallar 10,11 imal edilebilir olsa da, diğer araştırmacılar kolayca kendi çalışmaları için bu sistemi uygulamak için izin ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> künt noktası iğne </td><td> Tamam Uluslararası </td><td> 920.050-TE </td><td> Hassas TE iğnesi 20 Gauge x 1/2 &quot;, pembe </td></tr><tr><td> dekstran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> Delgeç (pin mengene) </td><td> Teknik Yenilikler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnsan göbek kordonu endotel hücreleri (HUVEC&#39;lere) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> Plazma temizleyici </td><td> Plazma </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer KİTİ </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 Geliştirici </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga pompası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> boru (büyük) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg microbore boru, 0.020 &quot;ID x 0,060&quot; OD </td></tr><tr><td> boru (küçük) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE microbore boru, 0.012 &quot;ID x 0,030&quot; OD </td></tr></tbody></table>

hematolojik hastalıklarında mikrovasküler etkileşimleri Öğrenmenin endothelialized mikroakiskan

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Imalat teknikleri gelişmeler mikro ve nanoscales 1,2 &#39;de biyolojik ve biyokimyasal deneyler için ucuz ve tekrarlanabilir mikroakışkan sistemleri üretim sağlamıştır. Buna ek olarak, aynı zamanda spesifik olarak Mikroakiskan nedeniyle kolayca dinamik bir akışkan ortam ve biyolojik şartlar 3-6 kontrol etme konusunda, kantitatif hematolojik ve mikrovasküler süreçler kullanılarak analiz edilmiştir. Gibi araştırmacılar, son zamanlarda kan hücrelerinin şekil, kan hücre agregasyonu, mikrovasküler kan akımı ve kan hücre-endotel hücre etkileşimleri 6-13 incelemek için mikroakışkan sistemleri kullandık. Ancak, bu mikroakışkan sistemler ya kültürlü endotel hücreleri içeren veya büyüktü vermedi mikrovasküler patolojik süreçleri sizescale ilgili daha. Kültürlü endotel hücreleri ile mikroakışkan platformu doğru özetlediği hücresel, fiziksel ve hemodyn bumikrodolaşımında Amic ortamı mikrovasküler içeren hematolojik hastalıkların temel biyofiziksel patofizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için gereklidir. Burada, hematolojik hastalığı meydana patolojik biyofiziksel mikrovasküler etkileşimleri çalışmak için standart endotel hücre kültür teknikleri ile birlikte, basit bir, tek bir maske mikroimalat sürecini kullanarak, mikrovasküler bir in vitro model &quot;endothelialized&quot; oluşturmak için bir yöntem sunduk. Bu &quot;mikrovasküler-on-a-chip&quot; sıkı biyolojik hem de biyofiziksel koşulları kontrol ve standart bir şırınga pompası ve aydınlık / floresan mikroskobu kullanarak işletilmektedir sağlam bir yöntem ile araştırmacı sağlar. Böyle mikrosirkülatuar hemodinamik şartlar, endotel hücre tipi, küre tipi (ler) ve konsantrasyon (s), ilaç / inhibitör konsantrasyonu, vs gibi parametreler her kolayca kontrol edilebilir. Bu, bizim mikrosistem sağlarkantitatif mikrovasküler akış nedeniyle hücre adezyon, agregasyon ve deformabilitesi, mevcut testler ile ulaşılamıyor bir yeteneği değişikliklerden engelli olduğu hastalık süreçleri araştırmak için bir yöntem.

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrovasküler modeli kan hücreleri, endotelyal hücreler ve kan hastalıkları çözünür faktörler arasında biofiziksel etkileşimlerin çalışma sağlar.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Mikrofabrikasyon tekniklerindeki gelişmeler, biyolojik ve ... yürütmek için ucuz ve tekrarlanabilir mikroakışkan sistemlerin üretilmesine olanak sağlamıştır.

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerle kaplanmış bir mikroakışkan cihaz oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle mikroakışkan kalıbın imal edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise PDMS kanalın oluşturulmasıdır.Ardından, endotel hücreler cihazın içine ekilir. Son adım, hücrelerin cihaz içerisinde kültüre edilmesidir. Nihai olarak, endotel hücre kaplı mikroakışkan cihazlar, in vitro ortamda hücreden hücreye etkileşimleri göstermek için kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, araştırmacıya biyolojik ve biyofiziksel koşullar üzerinde sıkı kontroller sağlaması ve floresan mikroskopi ile uyumlu olmasıdır. Bu yöntem, hematolojik hastalıklardaki biyofiziksel hücre-hücre etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, lökosit biyolojisi, kanser metastazı ve hematopoetik kök hücre biyolojisi gibi fenomenlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, başarılı hücre yerleşimi için koşulların sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerektiği nedeniyle zorluk yaşayabilirler.Fabrikasyon hazırlığı kapsamında, mikroakışkan cihazın bilgisayar destekli tasarım görüntüsü harici bir maske tedarikçisine gönderilerek bir fotomaske oluşturulur. Teslim alındığında maske, soda kireç cam üzerindeki bir krom tabakadan oluşur. Burada mikroakışkan kanal genişliği 30 mikron'dur.Mikroakışkan cihazın üretimine başlamak için, çıplak bir silikon gofret piranha çözeltisi ile 15 dakika boyunca temizleyin, ardından 10 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Daha sonra silikon gofreti 30 saniye boyunca hidrofluorik asit içerisinde bekletin ve yaklaşık 10 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Ardından, bir spin kaplayıcı kullanarak, 3000 rpm dönüş hızıyla gofret üzerine 30 mikron yüksekliğinde MicroChem SU-8 2025 fotoresist kaplayın.Fazla çözücüyü uzaklaştırmak için SU 8 20 25 kaplı wafer'ı 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerinde beş dakika bekletin. Bu adım için fırın kullanılması önerilmez. Ardından, fotomaskeyi wafer'ın üzerine yerleştirin ve SU 8 20 25 fotoresistin çapraz bağlanmasını sağlamak için bir maske hizalayıcıda UV ışığına maruz bırakın.Çapraz bağlanma işleminden sonra, SU 8 20 25 fotoresistin polimerizasyonunu daha da hızlandırmak için wafer'ı beş dakika daha 95 °C sıcaklıktaki sıcak plakaya yerleştirin. Ardından wafer'ı, temel olarak P-G-M-E-A'den oluşan SU sekiz geliştiricide dört dakika boyunca bekletin.Bu işlem, çapraz bağlanmamış SU 8 20 25 fotoresistlerini uzaklaştıracaktır. Yeni geliştirilen wafer'ı 10 saniye boyunca %100 izopropil alkol ile durulayın, ardından basınçlı nitrojen kullanarak veya solventin temiz bir çeker ocak içerisinde birkaç dakika boyunca wafer üzerinden buharlaşmasını sağlayarak kurulayın. Şimdi, bantları wafer'ın kenarlarına yerleştirmeye dikkat ederek, kurulanmış wafer'ı Petri kabının merkezine bantlayın.Son olarak, wafer üzerine 500 µL sigma coat pipetleyin. Petri kabını kapağıyla kapatın ve ardından wafer'ın tamamen kaplandığından emin olmak için kabı dairesel hareketlerle sallayın. Kapağı kaldırın ve solventin tamamı buharlaşana kadar wafer'ın birkaç dakika boyunca kurumasını bekleyin.PDMS polimeri ve kürleme ajanı 10'a 1 ağırlıkça oranında karıştırıldıktan sonra, mevcut vakum sisteminin gücüne bağlı olarak birkaç dakika ile bir saat arasında vakumlu desikatör kullanarak hava kabarcıkları giderin. Tüm hava kabarcıkları giderildikten sonra, wafer ve kabın yüzeyi kapanacak şekilde karışımı kaba dökün. Yaklaşık beş milimetre kalınlığında bir PDMS tabakası oluşturun.Ayrıca bir milimetre kalınlığında, özelliği olmayan ince bir PDMS parçası oluşturun. Ardından karışımı 60 °C'lik bir fırında gece boyunca kürleyin. Ertesi gün, bir bıçak veya neşter kullanarak goferin etrafından kesin ve birden fazla PDMS mikroakışkan cihazı çıkarın.Ardından, her bir cihazı ayırmak için tabakayı kesin. PDMS tabakayı, mikroakışkan cihazdan biraz daha büyük olacak şekilde kesin. Şimdi, mikroakışkan cihazda giriş ve çıkış delikleri oluşturmak için bir pin mengene Harris unicorn veya benzeri bir cihaz kullanın.Ardından, mikroakışkan cihazın ve tabakanın yüzeylerini şeffaf bant kullanarak temizleyin. Daha sonra, mikroakışkan cihazın ve PDMS tabakasının yüzeylerini 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakmak için bir plazma temizleyici kullanın. Oksijen plazması, PDMS'nin açıkta kalan yüzeyinde, fiziksel temas sağlandığında bağ kuran reaktif türler oluşturur.Ardından, 20 gauge kör uçlu iğne takılmış bir mililitrelik bir şırıngayı, PBS içindeki insan plazmasından elde edilmiş 50 µg/mL Fibronectin ile doldurun ve ardından iğnenin üzerine bir parça tüp yerleştirin. İki tüp arasında sıkı bir geçme oluşturmak için ilk tüp parçasının içine daha ince bir tüp parçası yerleştirin.Ardından, daha ince olan tüp parçasının diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine bağlayın. Kanalları tamamen fibronektin çözeltisiyle doldurmak ve kanalların ıslak kalmasını sağlamak için çıkış portunda 100 microliter boyutunda küçük bir damla oluşturmak üzere şırıngaya basınç uygulayın. Şimdi, mikroakışkan cihazı 37 °C'de, nemlendirilmiş bir inkübatörde 40 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, PBS ile doldurulmuş yeni bir şırıngayı küt uçlu iğneye bağlayın. Mikroakışkan cihazı PBS ile yıkamak için basınç uygulayın. Endotel büyüme medyumunda %8 dekstran ile mililitre başına 500.000 ile 2 milyon arasında insan göbek kordonu ven endotel hücresi (hve) hazırlayın.Dekstran eklenmesi, hücrelerin mikroakışkan aygıt içerisinde başarılı bir şekilde yapışma ve kültüre girme olasılığını artırır. Küt uçlu bir iğne ve daha geniş bir tüple donatılmış temiz şırıngayı hücre süspansiyonu ile doldurun ve yaklaşık bir metre uzunluğunda daha uzun bir tüp parçası bağlayın. Herhangi bir bağlantı arasında sızıntıyı önlemek için tüpün sıkıca oturduğundan emin olmak kritik önem taşır.Sistemin performansını optimize etmek için, şırıngada veya boruların herhangi birinde hava kabarcığı kalmadığından emin olarak boruları hücre çözeltisiyle doldurun. Bu noktada, sisteme herhangi bir sızıntı girmesini veya kabarcık oluşmasını önlemek kritik öneme sahiptir. Çözelti sızıntısı veya ortamda kabarcık bulunması, endotel hücrelerin başarılı bir şekilde yerleşmesini engelleyecektir.Tüm hava kabarcıkları giderildiğinde ve boru hattının tamamı hücre süspansiyonu ile doldurulduğunda, şırıngayı pompaya yerleştirin ve diğer ucunu mikroakışkan girişe bağlayın. Şırınga pompası, mikroakışkan cihazla aynı yüksekliğe ayarlanır. Hücrelerin ve medyumun cihaza temas etmeden önce yeterince ısınmasını sağlamak için boru hattının uzun kısmı inkübatör içinde dikkatlice sarılır.Ardından, hücre süspansiyonu sistemimizde 37 °C ve %5 karbondioksit altında, dakikada 1,23 µL'lik bir hacimsel akış hızıyla iki saat boyunca mikroakışkan cihaza infüze edilir. Dakikada 1,23 µL'lik hacimsel akış hızı, en küçük kanallarda saniyede bir milimetrelik bir orta akış hızına karşılık gelir. Bu, tam kan kullanıldığında söz konusu kanallarda santimetrekare başına bir din değerinde bir duvar kayma gerilimine yaklaşık olarak tekabül eder.Hücre süspansiyonu infüzyonu tamamlandıktan sonra, aynı şırınga pompasını ve uzun boruyu, daha büyük bir şırınga kullanarak iki ila sekiz gün boyunca dakikada 1,23 microliters hızında taze büyüme medyası infüze etmek için kullanın. Hücre monokatmanı istenen konfluens seviyesine ulaştığında, deney için sisteme kan veya hücre süspansiyonu enjekte edin. Burada, mikro akışkan cihaz endotelyalizasyon öncesindeki haliyle gösterilmiştir.Vasküler fizyolojiyi taklit eden cihazın boyutunu, ölçeğini ve genel tasarımını göstermek amacıyla mikroakışkan cihaza gıda boyası verilmiştir. Brightfield mikroskopisi, mikroakışkan bir cihazın endotelize olduğunu ortaya koymaktadır. Bu görüntü, açıklanan protokol kullanılarak hücre ekiminden 48 saat sonra elde edilmiştir; optimize edilmiş perfüzyon tekniği, endotel hücrelerin mikroakışkan sistemin tüm iç yüzeyini konfluent şekilde kaplamasına olanak tanır.Hücre ekiminden sonraki 24 ila 48 saat içinde. Bu konfokal görüntüde gösterildiği üzere, mikro kanallı çip üzerindeki mikrovasküler tümör, orak hücreli anemiye bağlı mikrovasküler obstrüktif olayların çoğunun gerçekleştiği yer olan postkapiller venüllerin 30 mikron boyutuna yakındır. Bu deneyde, sağlıklı hastalardan alınan tam kan, oksijensiz koşullar altında çip üzerindeki bir mikrovasküler sisteme infüze edilir.Bu film, endotelyal mikroakışkan sistemimizdeki tam kan akışının düzenli, pürüzsüz ve sürekli olduğunu ve mikrokanal tıkanıklığına yol açan alanların bulunmadığını göstermektedir. Burada, orak hücreli anemi hastalarından alınan tam kan, bir çip üzerindeki mikro vaskülarizasyon cihazına infüze edilmektedir. Oksijensiz koşullar altında, birkaç kanalda tam tıkanıklıkların görülmesiyle birlikte kan akışında önemli değişiklikler gözlemlenmektedir.Bu prosedürü uygularken, tüpler değiştirilirken hava kabarcığı oluşmamasına dikkat etmek önemlidir. Tamamlanan cihaz floresan mikroskopi ile uyumludur ve geleneksel floresan analizlerine uyarlanabilir. Bu teknik, deneysel hematologların kontrollü bir biyofiziksel ve hemodinamik ortamda tek hücreler kullanarak deneyler gerçekleştirmesinin önünü açmaktadır.Kabarcık Oluşmamalıdır.

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, biz insan kordon kanı endotel koloni oluşturan hücrelerin (ECFCs -) ve kemik iliğinden elde edilen bağışık yetmezliği olan farelere subkutan kollajen / fibronektin jel gömülü mezenkimal kök hücreler (MKH), teslim etmek için bir metodoloji tarif Bu hücre / jel kombinasyonu, fare damarsal ile bağlayan bir insan bir damar ağı oluşturur.

Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Bir mikro-on-a-chip platformu fotolitografik reflowable ışığa tekniği, yumuşak litografi ve Mikroakiskan kombinasyonu tarafından geliştirilmiştir. Endothelialized mikro platformu, in vivo mikrodamar içinde üç boyutlu (3D) geometrisi ile taklit eden sürekli perfüzyon kontrollü akış altında çalışan, yüksek kaliteli ve gerçek zamanlı görüntü sağlar ve mikrovasküler araştırma için uygulanabilir.

Çok derinlemesine Dairesel kesit Endothelialized mikro kanallar-on-a-chip Geliştirme Prosedürü

Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Akış altındaki trombosit fonksiyonu değerlendirilebilir ve simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon, travma ve transfüzyon tıbbında uygulamaları olan bir mikroakışkan cihaz kullanılarak modellenebilir.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Burada, endotel hücrelerini senkronize salınımlı hiperglisemi ve pulsatil kayma stresine maruz bırakan mikrofluidik bir sistem üretip çalıştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, diyabetik endotel disfonksiyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model sunar. Bu protokol, oksidatif stres ve endotel hücre yanıtlarının nicel ölçümünü sağlar.

Kombine Fizyolojik Pulsatil Kayma Stresi ve Salınım Hiperglisemi Altında Endotel Disfonksiyonunu Modellemek İçin Mikrofluidik Bir Sistem

Öğrenin, endotelyal hücre kaplı mikroakışkan cihazlarla hematolojik hastalıklardaki mikrovasküler etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, kan hücreleri ve endotelyal hücreler arasındaki biyofiziksel etkileşimleri kontrollü ortamda çalışmanıza olanak tanır.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Daha fazla video keşfet