Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücreleri ile kaplanmış bir mikroakışkan cihaz oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle mikroakışkan kalıbın üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise PDMS kanalın oluşturulmasıdır.

Ardından, endotel hücreler cihazın içine ekilir. Son adım, hücrelerin cihaz içerisinde kültüre edilmesidir. Nihayetinde, endotel hücre ile kaplanmış mikroakışkan cihazlar, hücreler arası etkileşimleri in vitro olarak göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, araştırmacıya biyolojik ve biyofiziksel koşullar üzerinde sıkı kontroller sağlaması ve floresan mikroskopi ile uyumlu olmasıdır. Bu yöntem, hematolojik hastalıklardaki biyofiziksel hücre-hücre etkileşimlerine dair içgörü sağlayabildiği gibi lökosit biyolojisi, kanser metastazı ve hematopoetik kök hücre biyolojisi gibi olgulara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, hücrelerin başarılı bir şekilde yerleşmesi için koşulların sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerektiğinden zorluk yaşayacaklardır.

Üretim hazırlığı aşamasında, mikroakışkan cihazın bilgisayar destekli tasarım görüntüsü harici bir maske tedarikçisine gönderilerek bir fotomaske oluşturulur. Teslim alındığında maske, soda kireç camı üzerine krom tabakasından oluşmaktadır. Burada mikroakışkan kanal genişliği 30 mikrondur.

Mikroakışkan cihazın imalatına başlamak için, çıplak bir silikon gofretle piranha çözeltisi kullanılarak 15 dakika boyunca temizlik yapın, ardından 10 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Daha sonra silikon gofreti 30 saniye boyunca hidrofluorik asit içinde bekletin ve yaklaşık 10 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın. Ardından, bir spin coater kullanarak, dakikada 3000 dönüş hızında 30 mikron yüksekliğe ulaşacak şekilde micro chem SU 8 20 25 fotoresisti gofret üzerine kaplayın.

Fazla solventi uzaklaştırmak için, SU 8 20 25 kaplanmış wafer'ı 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerine beş dakika boyunca yerleştirin. Bu adım için fırın kullanılması önerilmez. Ardından, fotomaskeyi wafer'ın üzerine yerleştirin ve SU 8 20 25 fotoresistin çapraz bağlanmasını sağlamak için bir maske hizalayıcıda UV ışığına maruz bırakın.

Çapraz bağlanma işleminden sonra, SU 8 20 25 fotorezistin polimerizasyonunu daha da hızlandırmak için gofret plakayı 95 °C'deki sıcak plakaya beş dakika daha yerleştirin. Ardından gofret plakayı, temel olarak P-G-M-E-A'dan oluşan SU 8 geliştirici çözeltiye dört dakika boyunca daldırın.

Bu işlem, çapraz bağlanmamış SU 8 20 25 fotoresist tabakasını uzaklaştıracaktır. Yeni geliştirilen gofretle 10 saniye boyunca %100 izopropil alkol ile durulayın, ardından basınçlı azot kullanarak veya solventin temiz bir çeker ocakta birkaç dakika boyunca gofret üzerinden buharlaşmasına izin vererek kurutun. Şimdi, bandı gofretin kenarlarına yerleştirmeye dikkat ederek, kurutulmuş gofreti Petri kabının merkezine bantlayın.

Son olarak, wafer üzerine 500 µL sigma coat pipetleyin. Petri kabını kapağıyla kapatın ve ardından wafer'ın tamamen kaplandığından emin olmak için kabı dairesel hareketlerle sallayın. Kapağı kaldırın ve tüm çözücü buharlaşana kadar wafer'ın birkaç dakika boyunca kurumasına izin verin.

PDMS polimeri ve kürleme maddesi ağırlıkça 10'a bir oranında karıştırıldıktan sonra, mevcut vakum sisteminin gücüne bağlı olarak birkaç dakika ile bir saat arasında vakumlu desikatör kullanılarak hava kabarcıkları giderilir. Tüm hava kabarcıkları alındıktan sonra, karışım gofret ve kap yüzeyi kaplanacak şekilde kaba dökülür. Böylece yaklaşık beş milimetre kalınlığında bir PDMS tabakası oluşturulur.

Ayrıca bir milimetre kalınlığında, yükseltisiz ince bir PDMS parçası oluşturun. Ardından karışımı 60 °C'lik bir fırında gece boyunca kürleyin. Ertesi gün, bir bıçak veya neşter kullanarak gofretin etrafından kesin ve birden fazla PDMS mikroakışkan cihazı çıkarın.

Ardından, ayrı cihazları izole etmek için tabakayı kesin. PDMS tabakasını mikroakışkan cihazdan biraz daha büyük olacak şekilde kesin. Şimdi, mikroakışkan cihazda giriş ve çıkış delikleri oluşturmak için pin mengenesi, Harris unicorn veya benzeri bir cihaz kullanın.

Ardından, mikroakışkan cihazın ve tabakanın yüzeylerini şeffaf bant kullanarak temizleyin. Daha sonra, mikroakışkan cihazın ve PDMS tabakasının yüzeylerini bir plazma temizleyici ile 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Oksijen plazması, PDMS'in açıkta kalan yüzeyinde, fiziksel temas sağlandığında bağ kuran reaktif türler oluşturur.

Ardından, 20 gauge küt uçlu iğne takılmış bir mililitrelik bir şırıngayı, PBS içerisindeki insan plazması kaynaklı 50 µg/mL Fibronectin ile doldurun ve ardından iğnenin üzerine bir parça boru yerleştirin. İki boru parçası arasında sürtünmeli bir geçme oluşturmak için ilk borunun içine daha ince bir boru parçası yerleştirin.

Ardından, daha ince olan tüp parçasının diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine takın. Kanalları tamamen fibronectin çözeltisiyle doldurmak ve kanalların nemli kalmasını sağlamak için çıkış portunda küçük bir 100 µL damla oluşturmak üzere şırıngaya basınç uygulayın. Şimdi, mikroakışkan cihazı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 40 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, PBS ile doldurulmuş yeni bir şırıngayı küt uçlu iğneye bağlayın. Mikroakışkan cihazı PBS ile yıkamak için basınç uygulayın. Endotelyal büyüme ortamı ve %8 dekstran içerisinde, mililitre başına 500.000 ile 2 milyon arasında insan göbek kordonu ven endotel hücresi (hve) hazırlayın.

Dekstran eklenmesi, hücrelerin mikroakışkan cihaz içerisinde başarılı bir şekilde yapışma ve kültürlenme olasılığını artırır. Küt uçlu iğne ve daha geniş bir tüple donatılmış temiz bir şırıngayı hücre süspansiyonu ile doldurun ve yaklaşık bir metre uzunluğunda daha uzun bir tüp parçası bağlayın. Bağlantı noktaları arasında sızıntıyı önlemek için tüplerin sıkıca oturduğundan emin olmak kritik önem taşır.

Sistemin performansını optimize etmek için, şırıngada veya boruların herhangi birinde hava kabarcığı bulunmadığından emin olarak boruları hücre solüsyonu ile doldurun. Bu aşamada, sisteme herhangi bir sızıntı girmesini veya hava kabarcığı oluşmasını önlemek kritik önem taşır. Solüsyon sızıntısı veya besiyerinde hava kabarcığı bulunması, endotel hücrelerinin başarılı bir şekilde yerleşmesini engelleyecektir.

Tüm hava kabarcıkları giderildiğinde ve boru hattının tamamı hücre süspansiyonu ile doldurulduğunda, şırıngayı pompaya yerleştirin ve diğer ucu mikroakışkan girişe bağlayın. Şırınga pompası, mikroakışkan cihazla aynı yüksekliğe ayarlanır. Hücrelerin ve besiyerinin cihazla temas etmeden önce yeterince ısınmasını sağlamak için uzun boru hattı inkübatör içinde dikkatlice sarılır.

Ardından hücre süspansiyonu, sistemimizde 37 °C ve %5 karbondioksit altında, iki saat boyunca dakikada 1,23 µL hacimsel akış hızında mikroakışkan cihaza infüze edilir. Dakikada 1,23 µL hacimsel akış hızı, en küçük kanallarda saniyede 1 mm'lik bir orta akım hızına karşılık gelir. Bu değer, tam kan kullanıldığında söz konusu kanallarda yaklaşık 1 dyne/cm²'lik bir duvar kayma gerilimine tekabül eder.

Hücre süspansiyonu infüzyonu tamamlandığında, aynı şırınga pompasını ve uzun boruyu, daha büyük bir şırınga ile iki ila sekiz gün boyunca dakikada 1.23 microliters hızında taze büyüme medyumu infüze etmek için kullanın. Hücre monokatmanı istenen konfluens seviyesine ulaştığında, deney için sisteme kan veya hücre süspansiyonu enjekte edin. Burada, mikro akışkan cihaz endotelizasyon öncesindeki haliyle gösterilmiştir.

Mikroakışkan cihaz, damar fizyolojisini taklit eden cihazın boyutunu, ölçeğini ve genel tasarımını göstermek için gıda boyası ile doldurulmuştur. Aydınlık alan mikroskopisi, mikroakışkan bir cihazın endotelleşmesini göstermektedir. Bu görüntü, tanımlanan protokol kullanılarak ekim yapıldıktan sonra 48 saatten daha kısa bir süre içinde elde edilmiştir; optimize edilmiş perfüzyon tekniği, endotel hücrelerinin mikroakışkan sistemin tüm iç yüzeyini konfluen bir şekilde kaplamasına olanak tanır.

Hücre ekiminden sonraki 24 ila 48 saat içerisinde. Bu konfokal görüntüde gösterildiği gibi, mikro kanallara sahip çip üzerindeki mikrovasküler tümör, orak hücreli anemiye bağlı mikrovasküler obstrüktif olayların çoğunun meydana geldiği yer olan postkapiller venlerin 30 mikron boyutuna yakındır. Bu deneyde, sağlıklı hastalardan alınan tam kan, oksijensiz koşullar altında çip üzerindeki bir mikrovasküler sisteme infüze edilir.

Bu film, endotelyal mikroakışkan sistemimizdeki tam kan akışının düzenli, pürüzsüz ve sürekli olduğunu ve mikrokanal tıkanıklığı olan bölgeler bulunmadığını göstermektedir. Burada, orak hücreli anemisi olan hastalardan alınan tam kan, bir çip üzerindeki mikro vaskülatür düzeneğine infüze edilmektedir. Deoksijene koşullarda, birçok kanalda tam tıkanmalar görülmekte ve kan akışında belirgin değişiklikler gözlemlenmektedir.

Bu prosedürü uygularken, hortum değişimi sırasında hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat etmek önemlidir. Tamamlanan cihaz floresan mikroskopi ile uyumludur ve geleneksel floresan analizlerine uyarlanabilir. Bu teknik, deneysel hematologların kontrollü bir biyofiziksel ve hemodinamik ortamda tek hücreler kullanarak deneyler yürütmesinin önünü açmaktadır.

Kabarcık oluşmamasına dikkat edin.