Sıçan Cremaster'ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

CRE matris mikrosirkülasyonunun intravital mikroskopisi, çizgili kas dokusunun iskemisi ve reperfüzyon hasarı hakkında bilgi edinmek için kullanışlı bir yöntemdir. Adım adım bir protokol ile, hayvanın uzun süreler boyunca derin anestezide kalmasını sağlamak amacıyla, arter kanülasyonu aracılığıyla yeterli izleme altında, solunum kontrollü anesteziye nasıl başlanacağını anlatıyoruz. Jugular venin nasıl kanüle edileceğini gösteriyor ve ardından üstün optik çözünürlük için CRE matris hazırlığının ince, düz bir tabaka şeklinde nasıl yapılacağını açıklıyoruz.

Laboratuvarlarımızda başarıyla yapılandırılmış olan iskemi-reperfüzyon hasarında lökosit görüntüleme protokolünü sunmaktayız. Bu model, iskemi-reperfüzyon hasarı araştırmaları için oksidatif aktivasyonu analiz etmek amacıyla kullanılabilir.

İskemi-reperfüzyon hasarının, miyokard enfarktüsü ve intestinal iskemi gibi birçok patolojik durumun yanı sıra transplantasyon ve kardiyovasküler cerrahi sonrası süreçlerde rol oynadığı bilinmektedir. Daha önce iskemik olan dokunun hiperperfüzyonu, geri dönüşümsüz doku hasarının önlenmesi için gerekli olsa da, reaktif oksijen türlerinin üretimi, kompleman sisteminin aktivasyonu ve artan mikrovasküler geçirgenlikle birlikte, etkilenen dokuda aşırı inflamasyona yol açar. Lökositlerin aktivasyonu, reperfüzyon sırasında meydana gelen inflamatuar doku hasarının patolojik kaskadındaki temel aktörlerden biridir.

Burada, iskemi-reperfüzyon hasarındaki lökosit aktivasyonunu analiz etmek için uygun bir yöntem olarak postkapiller venüllelerin intravital mikroskobisini öneriyoruz. Ayrıca, okuyucunun yöntemi gerçekten kavramasını ve güvenle uygulamasını sağlayacak yaygın hataları örneklendiriyor ve faydalı ipuçları sunuyoruz. Etik kurul onayı alındıktan sonra, 120 ila 180 gram vücut ağırlığına sahip erkek Sprague Dawley sıçanlar kullanıldı; sıçan pleksiglas kutunun içine yerleştirildi ve izofloran buharlaştırıcı aracılığıyla hacimce yüzde 2 ila 3 izofloran verildi.

Uygun anestezi seviyesine ulaşıldığında, sıçanın ağırlığı ölçülür ve ventral servikal bölgesi tıraş edilir. Vücut sıcaklığını 37 °C'de sabit tutmak için sıçan, bir ısıtma pedi üzerine sırt üstü yatırılır ve silikon maske kullanılarak hacimce %2 oranında izofloran uygulanır. Aşağıdaki hazırlıkların bir cerrahi mikroskop kullanılarak yapılması en uygun yöntemdir.

SRA sternal çentiği bölgesinde iki santimetrelik yatay bir cilt insizyonu yapın. Tükürük bezlerini lateral olarak mobilize edin. Artık ventral boyun kaslarıyla karşı karşıyasınız.

Bunları orta hat boyunca dikkatlice ayırın ve trakeayı bulun. Trakeanın bir ila iki santimetresini açığa çıkarın ve onu yükseltmek için alt taraftan bir mikro pens yerleştirin. Şimdi, trakeanın ventral tarafının yaklaşık ortasından, daha önce bir hayvan ventilatörüne bağlanmış olan 14 gauge'lik bir tüpü trakeal tüp olarak trakeanın alt kısmına yerleştirin.

Solunum daha sonra dakikada 35 ila 45 soluk frekansında hacim kontrollü olarak ayarlanabilir. Karotis kanülasyonu için 4,5 ila 5 mL tidal hacim ve hacimce yüzde 1,5 ila 2 isofluran konsantrasyonu uygulanır. Sağ sternohyoid kası kütt diseksiyonla ayrılır.

Karotis arterini konumlandırmak için vagus sinirini karotis arterinden dikkatlice ayırın ve kalpten gelen kan akışını durdurmak için arteri Anki mikro forsepsle sabitleyin; karotis arterinin altına, kalbe göre daha distaldeki sütür sıkıca, proksimaldeki sütür ise karotis arterinin etrafına gevşekçe bağlanır. İkinci bir proksimal sütürün uygulanması, mikro makaslar kullanılarak iki ligatür arasında karotis arterine küçük bir kesi yapıldıktan sonra mikro forsepslerin çıkarılmasının ardından kanamayı önler. Basınç dönüştürücüsüne bağlı olan ve normal salin solüsyonu ile doldurulmuş bir polietilen kateter yerleştirin.

Mikro penseti çıkarın ve kateteri arterin içine daha fazla ilerletin. Bir kan gazı analizörü kullanarak aralıklı arteriyel kan gazı analizi yapın ve floresan boyaların veya ilgilenilen diğer ilaçların intravenöz uygulaması için kan pH'ını fizyolojik sınırlar içinde tutun. Cerrahi mikroskop ile sol gular ven bölgesine odaklanın; her iki elinizde penset varken, jugular veni açığa çıkarmak için ince fasyayı yırtın.

Kan akışını durdurmak için veni açılı bir mikro forseps üzerine sabitleyin. Forseps kullanarak, karotis kanülasyonundakiyle aynı şekilde, eşit uzunlukta iki adet sütür parçasını juguler venin altından geçirin; juguler vene küçük bir kesi yapın ve hücre hattı çözeltisi ile yıkanmış bir polietilen kateter yerleştirin. Kateteri kalbe doğru ilerletin ve kalbe en yakın olan bağlayıcıyı sıkın.

Ven ve kateterin çevresinde, ısıtma pedinin istenen sıcaklığına hızla ulaşan alüminyum bir evre dört kremasterik görüntüleme sistemi kullanıyoruz. İlk insizyon, skrotumun çok uzak ucunda cilt ve eksternal spermatik fasya üzerinde yapılır ve ardından ince makaslar kullanılarak subdermal boşluğun dikkatli dilatasyonu gerçekleştirilir. Doku açığa çıkar çıkmaz, önceden ısıtılmış salin solüsyonu ile nemlendirilir.

Trimester kaslarını çevre dokulardan ayırmak için, eksternal spermatik fasya ile CRE master kası arasındaki bağ dokusu dikkatlice çıkarılır. Disseksiyon sırasında uygulanan sürekli süperfüzyon, dokuyu nemlendirerek görünürlüğü ve uzak uçtaki CRE master S'nin çıkarılması gibi işlemleri kolaylaştırır; sac'ın distal ucunun ventral yönündeki ucunu sabit tutup hafifçe gererek insizyon proksimal yönde uzatılır. Mikro makaslar kullanılarak, insizyon hatları boyunca kanayan damarlar dikkatlice koterize edilir.

Termal koter kullanılarak, açık kremaster kası alüminyum kaide üzerine düz bir şekilde yerleştirilir; testisin altındaki küçük bir arter ve ven dahil olmak üzere, EPI'lere hala ince bağlarla bağlıdır. Damarları mühürlemek ve diskal doku ile kremasterik doku arasındaki bağlayıcı bağları kesmek için koter kullanın. İzole edilen testisi nazikçe inguinal kanala geri itin.

Dokunun dört noktadan dikildiği ilk fiksasyona ek olarak, ipleri dikkatlice yayarak kremaster dokusunu alüminyum sahne üzerine radyal olarak yayın. Süperfüzyon düzeneği için polietilen kateterin iki ucunu kremaster dokusunun yakınına yerleştirin. Bir sıvı haznesi oluşturmak için bir şırınga kullanarak kremaster kasının etrafına petrol jeli ile bir hat çizin.

Kare bir lamеl lamelini kremaster dokusunun üzerine yerleştirin ve kenarlarını vazelin hattına sıkıca tutturun. Kremaster dokusu artık mikroskobik görüntüleme için hazırdır. Temel intravital kurulum farklılık gösterebilir.

EP laminasyonu için 470 nanometre LED ışık kaynağı ile donatılmış bir intra vital epi floresan mikroskobu kullanıyoruz. Su daldırma objektif ile, yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera aracılığıyla yaklaşık 800 x büyütmeli kayıt gözlemi gerçekleştiriyoruz. Epi floresan görüntüleme için deney karanlık bir odada yürütülmelidir.

Lökosit etiketlemesi için, vücut ağırlığının kilogramı başına 0,4 miligram konsantrasyonda rumine six J'yi juguler kateter yoluyla intravenr olarak enjekte edin. Gözlem için postkapiller bir ven seçin. Damar çapı 20 ila 60 mikrometre arasında olmalı ve kan akışı yeterli düzeyde olmalıdır.

İskemi gerçekleşmeden önce, dokunun 30 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. Ardından, lökosit yuvarlanması ve yapışması için bazal değerleri belirlemek amacıyla 30 saniyelik bir kayıt gerçekleştirin. Uygulama pensi kullanarak, açıkta kalan kremasterik dokunun en proksimal ucuna nazikçe bir bemer damar klempi yerleştirin.

30 dakikalık iskemiden sonra damar klempsini kaldırın. Sonraki kayıtlar reperfüzyon süresi boyunca yapılabilir. Lökosit yuvarlanmasının nicelleştirilmesi için, tüm kayıtlarda tutarlı olan ve damarı dikey olarak kesen sanal bir çizgi tanımlayın.

30 saniye içinde hattı geçen yuvarlanan lökositlerin sayısını manuel olarak sayın. Adherent lökositlerin nicemlemesi için, tüm kayıtlarda tutarlı olan 200 mikrometrelik bir damar bölümü tanımlayın.

30 saniye boyunca sabit kalan, net bir şekilde görülebilen lökositlerin sayısını belirleyin. Temsili sonuçlar yazılı protokol içerisinde sunulmuştur. İskemi-reperfüzyon hasarı çeşitli organ sistemlerinde etkili olsa da, burada çizgili kas dokusunun reperfüzyon hasarında lökosit-endotel etkileşimini analiz etmek için bir yöntem tanımlıyoruz.

Bu nedenle, diğer organların iskemik doku hasarlarının da benzer inflamatuar mekanizmaları içerdiği varsayıldığı için, özellikle serbest flep cerrahisi için uygundur. Açıklanan yöntem, iskemi kaynaklı füzyon hasarındaki patolojik mekanizmalara dair temel bilgiler edinmek için kullanılabilir. Cremaster kasına iskemi uygulaması kolaylıkla gerçekleştirilebilir ve serbest flep cerrahisi gibi klinik olarak ilgili durumları mükemmel bir şekilde yansıtır.

Ayrıca, soğuk iskemi veya sıcak iskemi gibi modifikasyonlar ya da inflamasyonu etkileyen maddelerle yapılan kromosterik süperfüzyon kolayca uygulanabilir. Kayıttan saatler veya günler önce tedavi gerekliyse, intraoral enjeksiyon tercih edilen yöntem olabilir.