Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, korele floresan ve elektron mikroskobisi kullanarak proteinleri ve elektron mikrograflarını lokalize etmektir. Burada, nano FEM olarak bilinen bu yöntem, C. elegans'taki proteinleri lokalize etmek için kullanılır. İlk olarak, histon TD eos eksprese eden transgenik bir solucan plastiğe gömülür ve kesitlenir.

Her bir kesit, hem foto-aktive lokalizasyon mikroskobisi (PALM) hem de taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenir. Her kesit için elde edilen iki mikrograf, Photoshop kullanılarak fidüsiyal işaretleyiciler aracılığıyla hizalanır. Korelatif görüntü, çekirdekteki histon moleküllerinin lokalizasyonunu göstermektedir.

Bugün tarif edeceğimiz tekniğin temel avantajı, immüno-EM kullanmak yerine genetik olarak kodlanmış floroforlar kullanmamız ve böylece her proteinin bir floresan proteine bağlı olmasıdır. İmmüno-EM ile çalışırken, birçok antikor plastiklerle etkileşime giremez. Bu durum basitçe uyumsuzdur ve uyumlu olsa bile, antikorlar antigenlerin bulunduğu kesitin derinliklerine nüfuz edemezler.

Floresan proteinler kullanılarak, her protein bir florofor ile işaretlenir. Bugün Shige Wbi bu tekniği uygulamalı olarak gösterecektir. Aşağıdaki prosedür, floresan protein TDE os ile işaretlenmiş histonlar eksprese eden transgenik nematodlar kullanılarak gösterilecektir.

Bu gösterim için kriyokoruyucu olarak bakterileri kullanacağız, ancak deniz zarafetini dondurmak için %20 BSA da kullanabilirsiniz. Donma ikamesinden bir saat önce, otomatik donma ikamesini veya bir FS cihazını sıvı azotla doldurun. Ayrıca önceden, beraberindeki belgedeki talimatlara göre gerekli fiksatörleri hazırlayın, fiksatörleri bir mililitrelik alikotlar halinde kriyotüplerde saklayın ve kullanılana kadar sıvı azot içerisinde tutun.

Bakteri çiminden hayvanları toplamak için bir boya fırçası kullanın ve bunları 100 mikronluk bir numune taşıyıcısını dolduracak şekilde aktarın. Hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için kabı hafifçe fazla doldurun. Hazır olduğunda, numune kabını dondurmak için yüksek basınçlı bir dondurucunun koluna yerleştirin. Ardından numuneyi hemen dondurma odasının yanındaki sıvı azot banyosuna aktarın.

Ardından, bir pens ve bir forseps kullanarak örneği fiksatörler içeren bir kriyotüpe aktarın. Örneğin her an sıvı azot altında kaldığından emin olun. Bu işlemi her örnek için tekrarlayın, ardından tüm kriyotüpleri bir FS ünitesine aktarın.

Tüm kriyotüpler bir FS ünitesine yerleştirildikten sonra programı başlatın. Dondurma ve işlemleme protokolü bu diyagramda gösterilmiştir. İlk -90 °C inkübasyon sırasında, vitreus buzun yerini asetondaki fiksatif alır.

Ardından, numune sıcaklığı yükseldikçe, sıvı aseton içindeki sabitleyici yapıların korunması için numuneyi çapraz bağlar. Bir FS ünitesindeki sıcaklık -60 °C'ye ulaştığında, 20 mL %95 aseton içeren sintilasyon şişelerini soğumaları için FS'ye yerleştirin. Sıcaklık -50 °C'ye ulaştığında, sabitleyiciyi uzaklaştırmak için P 200 uçlu bir Pasteur pipeti kullanın ve her bir numuneye yaklaşık 1 mL önceden soğutulmuş %95 aseton ekleyin.Safra.

Bu işlemi iki saat boyunca her 20 dakikada bir tekrarlayın. Ayrıca, -50 °C inkübasyonu sırasında, içinde 20 mL %0,1 urinal asetat içeren %95 aseton bulunan bir sintilasyon şişesini, -50 °C'ye kadar ön soğutma yapmak için bir FS haznesine yerleştirin. Ardından, son aseton yıkamasından sonra, membran kontrastını artırmak için numuneyi boyamak amacıyla her şişeye yaklaşık 1 mL urinal asetat çözeltisi ekleyin.

Program duraklatılmışsa, yeniden başlatın. Sıcaklık -40 °C'ye ulaştığında, %95 etanol içeren sintilasyon tüplerini FS haznesine yerleştirin. Sıcaklık -30 °C'ye ulaştığında, iki saat boyunca her 20 dakikada bir, üriner asetatı %95 etanol ile değiştirmek için bir pastör pipeti kullanın.

Reçinenin aseton varlığında polimerize olmayacağı nedeniyle bu adımda etanol kullanmak önemlidir. Protokolün bir sonraki bölümünde, örnekler eksi 30 °C'deyken plastiğe gömülür. FS'de, %95 etanolü önceden soğutulmuş %30 glikol metakrilat reçinesi veya %95 etanol içindeki GMA ile değiştirin; üç ila beş saat sonra %30 GMA'yı %70 GMA ile değiştirin; dört ila altı saat sonra %70 GMA'yı çıkarın ve örnekleri gece boyunca %97 GMA içinde inkübe edin.

GMA konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması, medyumun dokulara nüfuz etmesini sağlar. GMA reçinesine %3 su eklendiği için %97 GMA'nın seyreltilmediğini unutmayın. Ertesi gün etanol ile, örnekleri bir Pasteur pipeti kullanarak A FS içindeki bir gömme kalıbına aktarın, örnekleri gömme kalıbına yerleştirin ve ardından %97 GMA'yı, minus 30 degrees celsius'ta altı saat boyunca üç kez taze hazırlanmış GMA ile değiştirin.

Üçüncü değişimden sonra, örneği kriyokoruyucudan ayırmak için bakteri matrisine vurun. Havalandırma şişesinde %97 GMA'ya başlatıcı nn dimetil udin ekleyin. Eklenen başlatıcı miktarı, bir mililitre GMA başına 1,5 microliters'tır; GMA çözeltisini hemen her bir gömme kalıbına ekleyin ve hayvanları, aralarında eşit mesafe olacak şekilde kalıba yerleştirin.

Sıcaklığın -20 °C'ye çıkması için programı yeniden başlatın. Reçine bir saat içinde hızlıca polimerleşse de, plastiğin tamamen polimerleştiğinden emin olmak için gece boyunca -20 °C'de kürlenmeye bırakın.

Plastik kürlendikten sonra, numuneyi azot gazı doldurulmuş bir vakum torbasında -20 °C'de saklayın. GMA gömülü numunenin kesilmesi, fotoaktif lokalizasyon mikroskobisi veya PALM görüntüleme için ekli belgede açıklandığı şekilde gerçekleştirilmelidir. Mikroskop sistemi, EMCCD kamera -70 °C veya altına ayarlanacak şekilde kurulmalıdır.

Bir pipet kullanarak, görüntülenmeyecek örneğe 100 nanometre altın partiküller içeren (10¹⁰ partikül/mL konsantrasyonunda) çözeltiden yaklaşık 50 µL uygulayın. Örneklerin üzerine siyah bir kapatma kılıfı yerleştirin ve çözeltinin lamel üzerinde 30 saniye boyunca beklemesine izin verin. Altın çözeltisini uzaklaştırmak için, çözeltiyi lamelin kenarına doğru itin ve bir Kimwipe ile emdirin.

Ardından, dairesel bir lamel tutucuya vakum gresi sürün ve lameli yerleştirin. Lamelin alt kısmına imersiyon yağı uygulayın. Lameli doğrudan örneğin altına kaydırın.

Numune tutucuyu mikroskop tablasındaki yuvaya yerleştirin ve objektifin üzerinde sıkıca merkezlenecek şekilde ayarlayın. Objektiflere dokunmamaya özellikle dikkat edin. Ardından, parlak alan aydınlatması kullanarak, 10 x objektif lensi ile kesitleri bulun.

Ardından 100 x objektif lensine geçin ve numuneye odaklayın. Gerekirse, yoğunluğu %10 olarak ayarlanan 488 nanometre lazer ile floresan aydınlatmaya geçiş yapın. Örnek sıcaklığının dengelenmesi için beş dakika bekleyin. Daha sonra en parlak floresansın olduğu bölgeleri belirleyin ve buralara odaklayın.

Lazerleri 561 nanometreye ayarlayın ve yoğunluğu %100'e çıkarın. Arka plan otofloresansını gidermek için örneği yaklaşık iki dakika boyunca beyazlatın. Beyazlatma sırasında odak değişirse, odağı ayarlayıp görüntüleri yakalamadan önce beş dakika bekleyin. Beyazlatma işlemi tamamlandığında, 405 nanometrelik lazeri etkinleştirin ve en düşük yoğunluğa ayarlayın.

Görüntü toplamaya saniyede 20 kare hızında başlayın. Buradaki deney amacına ulaşmak için yeterli sayıda kare toplayın. Bir çekirdek içindeki 584 histon proteininin lokalizasyonunu belirlemek için 5.000 ila 6.000 kare alınır.

5.000 kare toplandıktan sonra, tüm moleküller görüntüleme yazılımı tarafından tanımlanır ve haritalanır. Nihai floresan görüntüsü veya sözde "some turf" görüntüsü, kamerada tespit edilen tüm floresanların bir bileşimidir. Buna karşın, "palm" görüntüsü her bir floresan noktasının OID'sini haritalandırır ve yalnızca her bir proteinin nerede bulunduğunu gösterir.

SEM görüntülemeden önce, kesitleri suyla hazırlanmış %2,5 üril asetat ile dört dakika boyunca boyayın. Üril asetatı filtre edilmiş milli QE su ile iyice yıkayarak temizleyin. Kesitler kuruduktan sonra, lamel oldukça koyu bir renk alana kadar sputter cihazı ile karbon kaplama yapın.

Lam üzerindeki elektronların topraklanması için, lamın bir ucundaki kenarına ve diğer ucundaki metal destektenle iletken karbon bant uygulayın. Lamı SEM haznesine yerleştirin ve numuneyi mikroskopta konumlandırın. Numunenin düşük büyütmeli bir görüntüsünü alın, ardından ilgilenilen bölgeye yakınlaşarak yüksek büyütmeli görüntüler elde edin.

Tüm bölümler görüntülenene kadar bu işlemi yeni bir bölümle tekrarlayın. Ardından, palm ve EM görüntüleri hizalanmalıdır. Bunun için öncelikle, elde edilen SEM görüntülerini Photoshop'ta açın.

5.000 x 5.000 piksel boyutlarında ve 300 dpi çözünürlüğünde yeni bir pencere oluşturun. Düşük büyütmeli SEM görüntüsünü yeni pencereye kopyalayın. Görüntüyü tüm pencereyi dolduracak şekilde ölçeklendirmek için düzenle (edit) menüsü altında bulunan serbest dönüştürme (free transform) komutunu kullanın.

Ardından, daha yüksek büyütmeli SEM görüntülerini kopyalayın ve gerektiği şekilde ölçeklendirip dönüştürün. Görüntü açılır menü çubuğundan görüntü döndürmeyi seçin ve toplam çim görüntüsünü yatay olarak çevirin. Toplam çim görüntüsünü kopyalayıp yeni bir katmana yapıştırın.

Görüntüyü, düşük büyütmeli elektron mikrografı ile yaklaşık olarak aynı boyuta getirmek için düzenle (edit) menüsünde bulunan serbest dönüştürme (free transform) komutunu kullanın. Ardından, altın partiküllerinin floresansını, SEM'de görüntülenen karşılık gelen yapılarla eşleştirmek için görüntüyü gerektiği gibi döndürün. Sonrasında, palm görüntüsünü yeni bir katmana kopyalayın ve daha yüksek büyütmeli bir görüntü elde etmek için aynı dönüştürme işlemini uygulayın.

İlgi bölgesine yakınlaşın ve bölgedeki avuç içi görüntüsünü kopyalayın. Görüntüyü, sunum için daha yüksek çözünürlüklü bir SEM görüntüsüne yapıştırın. Avuç içi görüntüsüne, avuç içi sinyallerinin değil, yalnızca siyah arka planın şeffaf hale geldiği bir gradyan şeffaflık uygulanmalıdır.

Dönüştürülmüş avuç içi görüntüsünü yeni bir katmana kopyalayın. Seçim açılır menüsündeki renk aralığı (color range) özelliğini kullanarak, arka planı değil yalnızca avuç içi sinyallerini seçin. Ardından, referans olarak bir arka plan pikselini seçin ve ters çevir (invert) seçeneğini aktif hale getirin.

İstenilen avuç içi sinyallerini kesin ve yeni bir katmana yapıştırın. Arka plan katmanına şeffaflık uygulayın ve bunu %10 olarak ayarlayın. Bu işlem, yoğunluktan ödün vermeden arka planı şeffaf hale getirerek avuç içi sinyallerinin görselleştirilmesini sağlar. Histon protein.

His11 etiketli TD eos, nematod c elgan içerisinde stabil şekilde eksprese edildi ve transgenik hayvanlar bu videoda açıklanan protokol kullanılarak işlendi ve görüntülendi. PALM ve elektron mikrografları aynı kesitten elde edildi. Hem floresan hem de elektron mikrograflarında görünen altın nanopartiküller, daha sonra iki görüntüyü hizalamak için kullanıldı.

Burada, mikrografın üst ucuna yakın bir bölgeye odaklanıyoruz. Burada görülebileceği gibi, çekirdek gibi hücresel detaylar yer almaktadır.

Bir çekirdek, nükleer porlar ve endoplazmik retikulum gözlemlenebilir. Bununla birlikte, etiketli histon molekülleri münhasıran çekirdekte lokalize olmuştur, çekirdek dışında değil. Beklendiği üzere, korelatif PALM ve elektron mikroskobu böylece protein lokalizasyonuna en yüksek çözünürlükte olanak tanır. Bu prosedürü gerçekleştirdikten sonra, protein dağılımına sahip bu kesitler alınabilir ve hücrede proteinlerin nerede dağıldığını gösteren üç boyutlu bir yapı oluşturmak için dizi tomografisi kullanılarak üst üste dizilebilir.

Osmiyum tetroksit kullanırken, bunun çok tehlikeli bir kimyasal olduğunu ve her zaman eldiven giymeniz gerektiğini unutmayın.