Name: Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Keşfedin nano-fem tekniği ile transgenik nematodlarda histon proteinlerinin çekirdek içindeki yerleşimini. Bu yöntem, genetik olarak kodlanan floresan proteinler kullanarak immuno-EM sınırlamalarını aşar ve yüksek çözünürlüklü protein haritalaması sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz proof-of-prensibi deneyler, fiksasyon protokolleri, reaktifler ve teşvik paylaşmak için Richard Fetter için PALM mikroskop erişim için Harald Hess ve Eric Betzig ederim. Biz DNA yapıları için Michael Davidson, Geraldine Seydoux Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Hıristiyan Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema ve Marc Hammarlund ederim. Biz de Zeiss PAL-M, Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop bir beta sürümüne erişmesini sağlamak için Carl Zeiss Inc ederim.

<ol><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24(2010).</li>
<li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li>
<li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images%3A+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li>
<li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light%2C+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li>
<li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li>
<li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Carl Zeiss, Inc tarafından desteklenen

Burada plastik, elektron mikroskobu kullanarak ultrastrüktürdeki bölümlerde floresan proteinleri yerelleştirilmesine ve görüntü floresan proteinleri korumak için nasıl açıklar. Proteinler nanometre çözünürlükte PALM mikroskopi kullanılarak kırınım limitinin altına yerleştiği belirlendi. Belirli örnekler için bu protokolü uyarlamak için, aşağıdaki parametreler dikkate alınmalıdır: fluorofor, ölçme ve hizalama. Floresan protein ya da organik fluorofor seçimi ve uygulama modeli sistemi bağlıdır. Biz EGFP, YFP, Sitrin, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry ve Dendra 12 gibi floresan proteinleri çeşitli test ettik. Her bir fluorofor gelen fluoresans muhafaza tüm floresan protein anlatılan yöntem kullanılarak korunabilir düşündüren, benzer olmuştur. Bu ifade, çünkü C de tdEos seçti elegans, proteinler tdEos kaynaşmış zaman işlevsel kaldı ve çünkü onunfoto-aktivasyon özellikleri PALM mikroskopi için uygun idi. Ancak, tdEos birleştirilmesi veya başarısız ifadesi bazen 12 gözlenmiştir. Uygulamaya bağlı olarak, farklı bir florofor daha uygun olabilir. Pek çok durumda, bir foto-aktif fluoresan protein kullanmak için gerekli değildir. Basit korelatif floresans elektron mikroskobu fotoğrafı aktive floresan protein gerektirmez. GFP ya da organik boyalar kırınım sınırın üzerinde bölümlerde etiketlenmiş proteinleri floresan imaj için de kullanılabilir. Örneğin, bir resim, bir floresan mikroskobu kullanılarak bir nöropil akson ve görüntüleme ile bir elektron mikroskobu, belirli bir akson, flöresanlı bir mikroskop üzerinde floresan ile floresan sinyalini ilişkili olabilir. Böyle uyarılmış emisyon azalması mikroskopi (STED) 12, bireysel molekül dönüş (GSDIM) 13 tarafından takip zemin devlet tükenmesi mikroskopi ve gibi diğer süper-çözünürlük teknikleri,yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) 14, foto-aktive floresan proteinleri gerekmez. Ayrıca, organik boyalar 9,15,16 veya floresan probları 17 intrinsik özelliğini kullanın süper-çözünürlük görüntüleme teknikleri kolayca uygulanabilir. Her bir molekülün flüoresan uzamsal ve zamansal ayrılır çünkü avuç içinde, molekül sayısı belirlenebilir. Oksidasyon, undercounting, overcounting ve ekspresyonu: Ancak, miktar dört nedenden dolayı yanıltıcı olabilir. İlk olarak, floresan protein fraksiyonu doğallığından ya da numune işleme 5,12 esnasında oksidize edilebilir. Floresans sinyalinin ~ 90% Bizim protokolde fiksasyon ve gömme yoluyla korunmuş olmasına rağmen örnek kesitli olmuştur ve yüzey oksijen maruz sonra, floresan protein oksidasyonu oluşabilir. İkinci olarak, foto aktive olan protein aktivasyonu stokastik, ve bu nedenle birden fazla moleküller olabilir,Belirli bir kırınım sınırlı nokta 8 aktive. Birden çok moleküllerin floresans bir nokta olarak görünür, ve proteinlerin bu nedenle toplam sayısı undercounted edilecektir. Üçüncü olarak, benzer bir sorun overcounting yol açabilir. PALM yılında beyazlatma tarafından, her bir floresan protein lokalize ve ardından &quot;silinir&quot;. Ancak, floresan proteinleri 18 kalıcı beyazlatılmış olmadan karanlık devlet dönebilirsiniz. Böyle moleküller sonra birden çok kez sayılır. Dördüncü olarak, etiketlenmiş proteinler transgenler olarak ifade edilmiştir ve genellikle aşırı ekspresyonu ile sebep olabilir çoklu kopyalar, mevcut edilir. Bu nedenle, palmiye dan miktarının belirli bir konumda molekül sayısını tahmin ancak tam olarak belirlemek için değil de kullanılabilir. Bir elektron mikrografı ile PALM görüntünün hizalamasını da çünkü elektron ışını nedeniyle ışık ve elektron mikroskobu ve bozulma içinde çözünürlük farkı zor olabilir. Altın parçacıkları gibi sıkı loc hizmetelektron mikrograflarında indirgeme belirteçler alized. Ancak, altın parçacıklar fluoresecence foto-aktif değildir ve büyük bir kırınım-sınırlı bir nokta olarak görünür. Böylece, elektron mikrografı üzerinde bir floresan imaj yerleştirme bir tahminidir. Çarpıtmalarla ayrıca plastik bölümü ile elektronların etkileşimleri ortaya çıkabilir. Bu tür GMA gibi akrilik reçineler, elektron ışını altında daha az kararlı olan ve plastik boyutları değiştirilebilir. Bu koşullar altında, ince yapı ile floresan hizalayarak, referans işaretleri doğrusal olmayan transformasyon gerektirebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Yüksek basınçlı dondurucu </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact ve Wohlwend dan Leica veya HPF-01 HPM 100 de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Otomatik dondurma ikamesi ünitesi </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon ve Vutara ayrıca ticari PALM mikroskoplar satmak. </td></tr><tr><td> Taramalı elektron mikroskobu </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Diğer yüksek çözünürlüklü mikroskobu SEM kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Aseton </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum permanganat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albümin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranil asetat </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> Bu firma uranil asetat pH biraz daha yüksektir. </td></tr><tr><td> Glikol metakrilat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Düşük asit, TEM notu. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo şişeleri </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Cam şişeler </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar filmi </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM kapsül </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropilen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DİSK zımbalar </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Altın nanopartiküller </td><td> mikroküreler-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> 2x konsantre çözelti isteyin </td></tr></tbody></table>

nano-fem: foto-aktif yerelleştirme mikroskobu ve elektron mikroskop kullanarak protein yerelleştirme

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Proteinlerin dağıtım eşlenmesi, bir hücre içinde proteinlerin işlevine anlaşılması için gereklidir. Floresan mikroskobu yaygın Protein lokalizasyonu için kullanılan, ancak Subselüler bağlamda floresans görüntülerde genellikle yoktur edilir. Immuno-elektron mikroskopisi, diğer taraftan, proteinler lokalize olabilir, ancak en fazla antijen numune yüzeyine maruz değildir çünkü tekniğin uygun antikorlar, morfoloji ve zayıf korunmuş yokluğu yüzünden kısıtlıdır. Korelatif yaklaşımlar da immüno-floresans veya genetik tagged proteinler, önce bir bütün hücre floresan görüntü elde edebilirsiniz. Örnek sonra sabitlenir ve elektron mikroskobu için gömülü ve görüntülerin 1-3 ilişkilidir edilir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü fluoresans görüntü ve indirgeme belirteçlerin olmaması proteinin tam olarak lokalize engellemektedir. Alternatif olarak, floresan görüntüleme plastik olarak numune korunması sonrasında yapılabilir. IçindeBu yaklaşım, blok kesitli ve floresans görüntüler ve aynı bölümün elektron mikroskop 4-7 ilişkilidir. Bununla birlikte, görüntü içinde ilintili ışık kırınım sınırı bireysel moleküllerin yerleri gizler, floresans ve sık sık hücre sınırlarının ötesine uzanmaktadır. Nano-çözünürlüklü floresan elektron mikroskobu (nano-FEM) foto-aktive localisation mikroskobu (PALM) ve elektron mikroskopi kullanılarak görüntüleme aynı kesimler tarafından nano-ölçekte proteinleri yerelleştirilmesine için tasarlanmıştır. PALM görüntüleme bireysel floresan proteinleri tarafından kırınım sınırı aştı ve daha sonra her floresan nokta 8-10 Centroid haritalama. Biz beş adımda nano-FEM tekniği özetlemektedir. İlk olarak, örnek sabit ve etiketlenmiş proteinlerin floresan korumak koşullar kullanılarak yerleştirilmiştir. İkinci olarak, reçine bloklar monte edilmiştir ultra-ince bölümler (70-80 nm) olarak bölünmüştürBir kapak camına. Üçüncü olarak, floresans Zeiss PALM mikroskop kullanarak bu bölümlerde görüntülenmektedir. Dördüncü, elektron yoğun yapıları taramalı elektron mikroskobu kullanılarak bu aynı bölümlerde görüntülü. Beşinci olarak, floresans ve elektron mikroskop indirgeme belirteçleri olarak altın parçacıkları kullanılarak hizalanır. Özet olarak, fluoresan etiketli proteinlerin hücre altı lokalizasyonu yaklaşık bir hafta içinde nm çözünürlükte tespit edilebilir.

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Proteinlerin dağılımının haritalanması, proteinlerin bir hücre içindeki işlevini anlamak için gereklidir. Floresan mikroskobu, ... için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, korele floresan ve elektron mikroskobisi kullanarak proteinleri ve elektron mikrograflarını lokalize etmektir. Burada, nano FEM olarak bilinen bu yöntem, C. elegans'taki proteinleri lokalize etmek için kullanılır. İlk olarak, histon TD eos eksprese eden transgenik bir solucan plastiğe gömülür ve kesitlenir.Her bir kesit, hem foto-aktive lokalizasyon mikroskobisi (PALM) hem de taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenir. Her kesit için elde edilen iki mikrograf, Photoshop kullanılarak fidüsiyal işaretleyiciler aracılığıyla hizalanır. Korelatif görüntü, çekirdekteki histon moleküllerinin lokalizasyonunu göstermektedir.Bugün tarif edeceğimiz tekniğin temel avantajı, immüno-EM kullanmak yerine genetik olarak kodlanmış floroforlar kullanmamız ve böylece her proteinin bir floresan proteine bağlı olmasıdır. İmmüno-EM ile çalışırken, birçok antikor plastiklerle etkileşime giremez. Bu durum basitçe uyumsuzdur ve uyumlu olsa bile, antikorlar antigenlerin bulunduğu kesitin derinliklerine nüfuz edemezler.Floresan proteinler kullanılarak, her protein bir florofor ile işaretlenir. Bugün Shige Wbi bu tekniği uygulamalı olarak gösterecektir. Aşağıdaki prosedür, floresan protein TDE os ile işaretlenmiş histonlar eksprese eden transgenik nematodlar kullanılarak gösterilecektir.Bu gösterim için kriyokoruyucu olarak bakterileri kullanacağız, ancak deniz zarafetini dondurmak için %20 BSA da kullanabilirsiniz. Donma ikamesinden bir saat önce, otomatik donma ikamesini veya bir FS cihazını sıvı azotla doldurun. Ayrıca önceden, beraberindeki belgedeki talimatlara göre gerekli fiksatörleri hazırlayın, fiksatörleri bir mililitrelik alikotlar halinde kriyotüplerde saklayın ve kullanılana kadar sıvı azot içerisinde tutun.Bakteri çiminden hayvanları toplamak için bir boya fırçası kullanın ve bunları 100 mikronluk bir numune taşıyıcısını dolduracak şekilde aktarın. Hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için kabı hafifçe fazla doldurun. Hazır olduğunda, numune kabını dondurmak için yüksek basınçlı bir dondurucunun koluna yerleştirin. Ardından numuneyi hemen dondurma odasının yanındaki sıvı azot banyosuna aktarın.Ardından, bir pens ve bir forseps kullanarak örneği fiksatörler içeren bir kriyotüpe aktarın. Örneğin her an sıvı azot altında kaldığından emin olun. Bu işlemi her örnek için tekrarlayın, ardından tüm kriyotüpleri bir FS ünitesine aktarın.Tüm kriyotüpler bir FS ünitesine yerleştirildikten sonra programı başlatın. Dondurma ve işlemleme protokolü bu diyagramda gösterilmiştir. İlk -90 °C inkübasyon sırasında, vitreus buzun yerini asetondaki fiksatif alır.Ardından, numune sıcaklığı yükseldikçe, sıvı aseton içindeki sabitleyici yapıların korunması için numuneyi çapraz bağlar. Bir FS ünitesindeki sıcaklık -60 °C'ye ulaştığında, 20 mL %95 aseton içeren sintilasyon şişelerini soğumaları için FS'ye yerleştirin. Sıcaklık -50 °C'ye ulaştığında, sabitleyiciyi uzaklaştırmak için P 200 uçlu bir Pasteur pipeti kullanın ve her bir numuneye yaklaşık 1 mL önceden soğutulmuş %95 aseton ekleyin.Safra.Bu işlemi iki saat boyunca her 20 dakikada bir tekrarlayın. Ayrıca, -50 °C inkübasyonu sırasında, içinde 20 mL %0,1 urinal asetat içeren %95 aseton bulunan bir sintilasyon şişesini, -50 °C'ye kadar ön soğutma yapmak için bir FS haznesine yerleştirin. Ardından, son aseton yıkamasından sonra, membran kontrastını artırmak için numuneyi boyamak amacıyla her şişeye yaklaşık 1 mL urinal asetat çözeltisi ekleyin.Program duraklatılmışsa, yeniden başlatın. Sıcaklık -40 °C'ye ulaştığında, %95 etanol içeren sintilasyon tüplerini FS haznesine yerleştirin. Sıcaklık -30 °C'ye ulaştığında, iki saat boyunca her 20 dakikada bir, üriner asetatı %95 etanol ile değiştirmek için bir pastör pipeti kullanın.Reçinenin aseton varlığında polimerize olmayacağı nedeniyle bu adımda etanol kullanmak önemlidir. Protokolün bir sonraki bölümünde, örnekler eksi 30 °C'deyken plastiğe gömülür. FS'de, %95 etanolü önceden soğutulmuş %30 glikol metakrilat reçinesi veya %95 etanol içindeki GMA ile değiştirin; üç ila beş saat sonra %30 GMA'yı %70 GMA ile değiştirin; dört ila altı saat sonra %70 GMA'yı çıkarın ve örnekleri gece boyunca %97 GMA içinde inkübe edin.GMA konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması, medyumun dokulara nüfuz etmesini sağlar. GMA reçinesine %3 su eklendiği için %97 GMA'nın seyreltilmediğini unutmayın. Ertesi gün etanol ile, örnekleri bir Pasteur pipeti kullanarak A FS içindeki bir gömme kalıbına aktarın, örnekleri gömme kalıbına yerleştirin ve ardından %97 GMA'yı, minus 30 degrees celsius'ta altı saat boyunca üç kez taze hazırlanmış GMA ile değiştirin.Üçüncü değişimden sonra, örneği kriyokoruyucudan ayırmak için bakteri matrisine vurun. Havalandırma şişesinde %97 GMA'ya başlatıcı nn dimetil udin ekleyin. Eklenen başlatıcı miktarı, bir mililitre GMA başına 1,5 microliters'tır; GMA çözeltisini hemen her bir gömme kalıbına ekleyin ve hayvanları, aralarında eşit mesafe olacak şekilde kalıba yerleştirin.Sıcaklığın -20 °C'ye çıkması için programı yeniden başlatın. Reçine bir saat içinde hızlıca polimerleşse de, plastiğin tamamen polimerleştiğinden emin olmak için gece boyunca -20 °C'de kürlenmeye bırakın.Plastik kürlendikten sonra, numuneyi azot gazı doldurulmuş bir vakum torbasında -20 °C'de saklayın. GMA gömülü numunenin kesilmesi, fotoaktif lokalizasyon mikroskobisi veya PALM görüntüleme için ekli belgede açıklandığı şekilde gerçekleştirilmelidir. Mikroskop sistemi, EMCCD kamera -70 °C veya altına ayarlanacak şekilde kurulmalıdır.Bir pipet kullanarak, görüntülenmeyecek örneğe 100 nanometre altın partiküller içeren (10¹⁰ partikül/mL konsantrasyonunda) çözeltiden yaklaşık 50 µL uygulayın. Örneklerin üzerine siyah bir kapatma kılıfı yerleştirin ve çözeltinin lamel üzerinde 30 saniye boyunca beklemesine izin verin. Altın çözeltisini uzaklaştırmak için, çözeltiyi lamelin kenarına doğru itin ve bir Kimwipe ile emdirin.Ardından, dairesel bir lamel tutucuya vakum gresi sürün ve lameli yerleştirin. Lamelin alt kısmına imersiyon yağı uygulayın. Lameli doğrudan örneğin altına kaydırın.Numune tutucuyu mikroskop tablasındaki yuvaya yerleştirin ve objektifin üzerinde sıkıca merkezlenecek şekilde ayarlayın. Objektiflere dokunmamaya özellikle dikkat edin. Ardından, parlak alan aydınlatması kullanarak, 10 x objektif lensi ile kesitleri bulun.Ardından 100 x objektif lensine geçin ve numuneye odaklayın. Gerekirse, yoğunluğu %10 olarak ayarlanan 488 nanometre lazer ile floresan aydınlatmaya geçiş yapın. Örnek sıcaklığının dengelenmesi için beş dakika bekleyin. Daha sonra en parlak floresansın olduğu bölgeleri belirleyin ve buralara odaklayın.Lazerleri 561 nanometreye ayarlayın ve yoğunluğu %100'e çıkarın. Arka plan otofloresansını gidermek için örneği yaklaşık iki dakika boyunca beyazlatın. Beyazlatma sırasında odak değişirse, odağı ayarlayıp görüntüleri yakalamadan önce beş dakika bekleyin. Beyazlatma işlemi tamamlandığında, 405 nanometrelik lazeri etkinleştirin ve en düşük yoğunluğa ayarlayın.Görüntü toplamaya saniyede 20 kare hızında başlayın. Buradaki deney amacına ulaşmak için yeterli sayıda kare toplayın. Bir çekirdek içindeki 584 histon proteininin lokalizasyonunu belirlemek için 5.000 ila 6.000 kare alınır.5.000 kare toplandıktan sonra, tüm moleküller görüntüleme yazılımı tarafından tanımlanır ve haritalanır. Nihai floresan görüntüsü veya sözde "some turf" görüntüsü, kamerada tespit edilen tüm floresanların bir bileşimidir. Buna karşın, "palm" görüntüsü her bir floresan noktasının OID'sini haritalandırır ve yalnızca her bir proteinin nerede bulunduğunu gösterir.SEM görüntülemeden önce, kesitleri suyla hazırlanmış %2,5 üril asetat ile dört dakika boyunca boyayın. Üril asetatı filtre edilmiş milli QE su ile iyice yıkayarak temizleyin. Kesitler kuruduktan sonra, lamel oldukça koyu bir renk alana kadar sputter cihazı ile karbon kaplama yapın.Lam üzerindeki elektronların topraklanması için, lamın bir ucundaki kenarına ve diğer ucundaki metal destektenle iletken karbon bant uygulayın. Lamı SEM haznesine yerleştirin ve numuneyi mikroskopta konumlandırın. Numunenin düşük büyütmeli bir görüntüsünü alın, ardından ilgilenilen bölgeye yakınlaşarak yüksek büyütmeli görüntüler elde edin.Tüm bölümler görüntülenene kadar bu işlemi yeni bir bölümle tekrarlayın. Ardından, palm ve EM görüntüleri hizalanmalıdır. Bunun için öncelikle, elde edilen SEM görüntülerini Photoshop'ta açın.5.000 x 5.000 piksel boyutlarında ve 300 dpi çözünürlüğünde yeni bir pencere oluşturun. Düşük büyütmeli SEM görüntüsünü yeni pencereye kopyalayın. Görüntüyü tüm pencereyi dolduracak şekilde ölçeklendirmek için düzenle (edit) menüsü altında bulunan serbest dönüştürme (free transform) komutunu kullanın.Ardından, daha yüksek büyütmeli SEM görüntülerini kopyalayın ve gerektiği şekilde ölçeklendirip dönüştürün. Görüntü açılır menü çubuğundan görüntü döndürmeyi seçin ve toplam çim görüntüsünü yatay olarak çevirin. Toplam çim görüntüsünü kopyalayıp yeni bir katmana yapıştırın.Görüntüyü, düşük büyütmeli elektron mikrografı ile yaklaşık olarak aynı boyuta getirmek için düzenle (edit) menüsünde bulunan serbest dönüştürme (free transform) komutunu kullanın. Ardından, altın partiküllerinin floresansını, SEM'de görüntülenen karşılık gelen yapılarla eşleştirmek için görüntüyü gerektiği gibi döndürün. Sonrasında, palm görüntüsünü yeni bir katmana kopyalayın ve daha yüksek büyütmeli bir görüntü elde etmek için aynı dönüştürme işlemini uygulayın.İlgi bölgesine yakınlaşın ve bölgedeki avuç içi görüntüsünü kopyalayın. Görüntüyü, sunum için daha yüksek çözünürlüklü bir SEM görüntüsüne yapıştırın. Avuç içi görüntüsüne, avuç içi sinyallerinin değil, yalnızca siyah arka planın şeffaf hale geldiği bir gradyan şeffaflık uygulanmalıdır.Dönüştürülmüş avuç içi görüntüsünü yeni bir katmana kopyalayın. Seçim açılır menüsündeki renk aralığı (color range) özelliğini kullanarak, arka planı değil yalnızca avuç içi sinyallerini seçin. Ardından, referans olarak bir arka plan pikselini seçin ve ters çevir (invert) seçeneğini aktif hale getirin.İstenilen avuç içi sinyallerini kesin ve yeni bir katmana yapıştırın. Arka plan katmanına şeffaflık uygulayın ve bunu %10 olarak ayarlayın. Bu işlem, yoğunluktan ödün vermeden arka planı şeffaf hale getirerek avuç içi sinyallerinin görselleştirilmesini sağlar. Histon protein.His11 etiketli TD eos, nematod c elgan içerisinde stabil şekilde eksprese edildi ve transgenik hayvanlar bu videoda açıklanan protokol kullanılarak işlendi ve görüntülendi. PALM ve elektron mikrografları aynı kesitten elde edildi. Hem floresan hem de elektron mikrograflarında görünen altın nanopartiküller, daha sonra iki görüntüyü hizalamak için kullanıldı.Burada, mikrografın üst ucuna yakın bir bölgeye odaklanıyoruz. Burada görülebileceği gibi, çekirdek gibi hücresel detaylar yer almaktadır.Bir çekirdek, nükleer porlar ve endoplazmik retikulum gözlemlenebilir. Bununla birlikte, etiketli histon molekülleri münhasıran çekirdekte lokalize olmuştur, çekirdek dışında değil. Beklendiği üzere, korelatif PALM ve elektron mikroskobu böylece protein lokalizasyonuna en yüksek çözünürlükte olanak tanır. Bu prosedürü gerçekleştirdikten sonra, protein dağılımına sahip bu kesitler alınabilir ve hücrede proteinlerin nerede dağıldığını gösteren üç boyutlu bir yapı oluşturmak için dizi tomografisi kullanılarak üst üste dizilebilir.Osmiyum tetroksit kullanırken, bunun çok tehlikeli bir kimyasal olduğunu ve her zaman eldiven giymeniz gerektiğini unutmayın.

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Tek flüoroforlar FIONA'sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Mevcut protokol, yeni bir otonükleasyon bastırma mekanizmasına dayalı altın nanopartikül sentez tekniği kullanarak hücrelerdeki metallothionein etiketli proteinleri tespit etmek için klonlanabilir bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisini tanımlamaktadır.

İyi Korunmuş Ultrayapı ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerinin Doğrudan Sentezi

Keşfedin nano-fem tekniği ile transgenik nematodlarda histon proteinlerinin çekirdek içindeki yerleşimini. Bu yöntem, genetik olarak kodlanan floresan proteinler kullanarak immuno-EM sınırlamalarını aşar ve yüksek çözünürlüklü protein haritalaması sağlar.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Daha fazla video keşfet