Name: Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Öğrenin, lipidik kübik ve sünger fazlarda yetiştirilen membran protein kristallerinin hasat ve kriyosoğutma yöntemlerini. Bu teknikler, makromoleküler X-ışını kristalografisi ile yapı tayini için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmaya katkıda ve en Yapısal Caffrey Membran ve Fonksiyonel Biyoloji Grup, geçmiş ve şimdiki üyeleri hem birçok kim vardır. Tüm için, ve özellikle Jingquan Tan ve Joseph Lyons, bizim en içten teşekkürlerimizi ve şükranlarımızı. Bu eser Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM75915, P50GM073210 ve U54GM094599) ve FP7 COST ve Marie Curie Eylemleri (CM0902 ve PIEF-GA-2009 hibeleri ile kısmen desteklenmiştir -235612).

1. Laboratuvar Kurulumu Öncesi hasat <ol><li> Hasat için hazırlık olarak, sıvı nitrojen ile kuru köpük Dewar girip hasat gerçekleşecek mikroskop yanına yerleştirin. </li><li> Batmak depolama disk, köpük Dewar içinde sıvı azot içinde, sonuna kadar açın ve tamamen soğumasını bekleyin. </li><li> Bir manyetik çubuk (şekil 5) üzerinde hasat edilmesi kristal uygun bir boyutta bir mikro monte edin. Bu taraftan birini bolus birkaç kristalleri toplamak için gerekli olduğu durumlar için hitap mikro-bağlar ile yüklenmiş yedek manyetik çubuklar bir dizi olması önemlidir. Yedek değneklerini her zaman mevcut olmalıdır. </li><li> Bir mikropipet, ipuçları ve hasat mikroskop yanına kristal büyümesi için kullanılır çökelti çözeltisi yerleştirin. Bu mezofaz kapsayacak şekilde ve iyice açıldığında kurumasını önlemek için gerekli olabilir. </li><li> Bankta bir defter ve kalem ile kapatın ve / veya mübilgisayarı açın. Bunlar, dondurucu soğutuldu, hasat edilmiş ve depolama yerleştirilir olarak kristallerin kalitesi, görünüm, yer, depolama disk numarasını vs ile ilgili gözlemler kaydetmek için kullanılır. </li><li> Asistan kişi açıkça takip edilecek protokol, çeşitli adımlar yer alacak hangi sırayla ve genel süreç içinde kendi rolünü anlamak gerekir hasat ile yardımcı varsa. </li></ol> Yerinde malzeme ve ekipman her ile bir sonraki görevi için: 2. Kristaller Contain Tabaklar ve Wells tanımlayın <ol><li> Harvestable kristalleri bulmak için en basit ve doğrudan bir yöntem ile normal ve çapraz polarize ışık ile bir mikroskop kullanılarak el ile kuyu kontrol etmektir. Mikroskop aydınlatıcı ışık yoğunluğunu ayarlama kristalleri bulmak yardımcı olabilir. </li><li> Alternatif olarak, plakaları, normal otomatik olarak tarandı ve olan bir görüntüleyici Polarize geçtid ışık kristaller aramak için de kullanılabilir. </li><li> Gözle değerlendirin bilgisayar monitörü dijital görüntüler kaydedildi. </li><li> Açıkçası boyutu, kalitesi ve dizüstü Mezofaz veya bir bilgisayarda kristalleri yere hasat ve kayıt yorum yapmak için kristaller olan kuyuları işaretlemek. </li><li> Görüntüleyici gelen hasat için kristalleri içeren plakayı çıkarın. </li></ol> 3. Kübik Mezofaz ile iyi açılması. Metod 1 Kristaller mezo yöntem ile büyür ki içinde cam levhalar sandviç plakaların (Şekil 2). Mezofaz ve orada kristaller erişmek için, bu da açmak için gereklidir. Bu iyi mühürler sonra kaldırılabileceğini üst coverglass kesmek için bir cam kesici alet kullanılarak yapılır. Kesme ve iyi bir kristalizasyon yerinden coverglass kaldırmak için birkaç yaklaşım vardır. Kullanmak için bir tip o tarafından diktef mezofaz olan kristal büyüyen bulunur. Bu, çok viskoz ve yapışkan kübik faz (Şekil 3A) veya daha fazla akışkan varyant, sünger faz (Şekil 3B) olabilir. Bu video yazıda kuyular açmak ve bu hosting malzemelerin hem kristalleri nasıl hasat göstermektedir. <ol><li> Bir ışık mikroskobu sahnede cam sandviç kristalizasyon plakası yerleştirin. </li><li> Boşluk yukarıda ve sadece iyi çevresi dışında bulunan iki konsantrik daireler ile hafifçe bir cam kesici takım skoru coverglass kullanma. Yeni bir kesme aleti ile, puanlama az uygulanan basınç gerektirir. Puan için gerekli basınç bile fractionally artıran yeni bir biri ile aracı yerine, bu genellikle 10 kuyu açtıktan sonra oluşur. </li><li> Iç coverglass serbest amacıyla iki attı çevreleri arasında boşluk içinde cam bölünmesi. Bu cam kırıkları ve toz bir sürü oluşturur. Bir nemlendirilmiş onları temizleyinkağıt havlu. </li><li> Ince uçlu cımbız ve uzak eğerek onunla ve iyi kapalı kavrayıp tarafından azat coverglass çıkarın. Bu durumda, kübik faz sıkışmış kalır ve iyi bir taban plakası üzerinde yerinde. </li><li> Şimdi kristal hasat kullanıma hazır kübik Mezofaz daha net bir görünüm elde etmek için yakınlaştırma. </li></ol> 4. Kübik Mezofaz bir Şey açılması. Metod 2 <ol><li> Iyi bir tarafında ve kendisi de üzerinden genişletmek coverglass içinde düz paralel çizgiler aracı skoru kesme cam kullanılması. Bu kolay cımbız erişim ve coverglass kaldırılması sağlar. </li></ol> Bu özel gösterimde coverglass yapışkan ayırıcı yüzey coverglass serbest içinde çatlaklar. Bu süreçte, coverglass pozisyonda geçer ve çöktürücü kübik faz ayrılır. Coverglass kaldırıldığı zaman çöktürücü bazı onunla birlikte gider. Biz bir maruz b ile solHerhangi Çevre Çöktürücü olmadan Mezofaz arasında Olus. Derhal, kuruma ve kristaller zarar verebilir bir faz değişim geçirmekte gelen Mezofaz önlemek için bir mikropipet kullanarak bolus üstüne 1 ul taze çökeltici ekleyin. Bolus artık kristal hasadı kullanılmak üzere hazırdır. 5. Sünger Faz bir Şey açılması. Başarısız Sünger fazı nedeniyle akış kabiliyetini ile çalışmak daha bağışlayıcı. Iyi kılcallık çevresi temas sünger aşamasında olduğunu akışı sonuçlar Mezofaz dışarı çıkartalım ve kristaller kaybedersiniz. Bu olay bir örneği, bu video klip de gösterilmiştir. <ol><li> Sünger aşamasında Yakınlaştır ve sünger aşamasında kristalleri bulmak için normal ve çapraz polarize ışık arasında ileri ve geri geçiş. </li><li> Iyi skoru açılması ve Bölüm 3&#39;te açıklandığı gibi coverglass kesmek için hazırlık. Bu süreçte, coverglass çatlaklar. Girişimiyi çatlak yönünde çöktürücü kaymalar açmak için yıkamada ve sonunda boşluk ile temas eder. Çöktürücü sünger fazı ve kaybolur kristaller yükünün bazı gider ile. </li></ol> Bu özel sekans olarak, mikroskop üzerinde tamamen çapraz polarize olmayan ve kristaller iyi ve içeriği görünür durumda kalmasını aynı zamanda parlak nesnelerin olarak görülebilir. 6. Sünger Faz bir Şey açılması. Başarılı olarak <ol><li> Sünger aşamasında Yakınlaştır ve hem normal hem de çapraz polarize ışık bir kristal tanımlamak. </li><li> Puan, Bölüm 4.1 &#39;de olduğu gibi, iyi kapsayan coverglass bir bölümünü kesip çıkarın. Eksik olarak çapraz polarize ışık kristal takip etmek için kullanılmaktadır. </li><li> Sadece çökelti çözeltisi dokunana kadar coverglass açıklıktan ve kuyuya kuru doku kağıt parçası tanıtın. Dikkatli çözümü uzakta Wickly neredeyse hepsi gitti ve sonra dokuyu kadar. Bu coverglass altında geri çekilmesi için, bir yerde hala kristal ile, kalan çökeltinin sünger fazı neden olur. </li><li> Puan, kesme ve Bölüm 4.1 &#39;de olduğu gibi bir cımbız coverglass geri kalanı ile kaldırın. Bu durumda, sünger faz böler; bazı coverglass için iyi ve bazı çubuklar kalır. Kristal coverglass üzerinde bolus yer almaktadır. Çok az Çöktürücü mevcut olmadığından, sünger faz kuruma olasılığı nedeniyle bir faz geçişi geçmesi başlar. Bu, bolus merkezine doğru göç eder çift kırılma bir halka olarak görülebilir. Hemen geçişi durdurmak için bolus uygulamasına çökeltici ekleyin. Bolus artık kristal hasat kullanıma hazırdır. </li></ol> 7. Kübik Faz Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller <ol><li> Açık kuyuda kübik faz bolus kristalleri bulmak için normal ve çapraz polarize ışık arasında ileri ve geri gidin. Ten fazla dört çift kırınım kristaller onun video dizisi Çapraz polarize ışık ile kübik faz bolus olarak görülebilir. </li><li> Kullanın cryo-loop (Şekil 5) hasat derhal Dewar sıvı nitrojen içine, kristaller için taze maruz Mezofaz soruşturmayla kristalleri balık ve sonra onları atılmak için, cryo-loop bulunan monte. İdeal olarak, hasat ve ek soğutma birini sürekli ve hızlı hareket halinde gerçekleşmesi gerekir. Mümkün olduğunca az kalarak Mezofaz kristal ile hasat edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, kriyo-Koruyucu in mezo-yetiştirilen kristalleri ile gerekli değildir. </li><li> Hemen kristal başarıyla hasat olduğunu düşündüren artık orada olduğunu doğrulamak için hasat için kullanılan Mezofaz bolus incelemek hasat sonrası kriyo-döngü içinde kristal aramak mümkün olmadığından. </li></ol> 8. Sünger Faz Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller <ol><li> Açık kuyuda sünger faz bolus kristalleri bulmak için normal ve çapraz polarize ışık arasında ileri ve geri gidin. Bu video dizisi birçok çift kırınım kristaller çarpı polarize ışık altında bolus olarak görülebilir. </li><li> Kullanım bir kriyo-döngü (Şekil 5) hasat hemen Dewar içinde sıvı azot içine, sünger fazdan kristal çıkarmaya ve bunları atılmak için, ya da cryoloop yer alan monte edilmiştir. Kübik aşamasından hasat olduğu gibi, ideal, kriyo-soğutma işlemi kristal gerçek hasat olay arasında geçen ve sıvı nitrojen içine dalan mümkün olduğunca az zaman ile hasat hemen gerçekleşmesi gerekir. Mümkün olduğunca az kalarak sünger faz kristal ile hasat edilmelidir. Belirtildiği gibi, kriyo-Koruyucu in mezo-yetiştirilen kristalleri ile gerekli değildir. </li></ol> 9. Dewars Kristaller saklanması <ol><li> Sıvı ni içine monte döngü dalmışlardırTrogen köpük Dewar içinde depolama pak holding yuvalarından birine yerleştirin. Bütün manipülasyonlar döngü ile yapılır, manyetik çubuk ve pakı üst sıvı azot içinde batık. </li><li> Dizüstü bilgisayar ve / veya bilgisayarda konumu ve ayrıntıları hasat ve cryo sogutmali kristal kaydedin. </li><li> Köpük Dewar içinde pakı tam veya günün bir depolama veya taşıma Dewar bir rafa pak yuvasına disk aktarımı tamamlandığında için hasat olduğunda sıvı nitrojen dolu. Kristaller kırınım veri toplama için sinkrotron tesisine ulaşım Dewars sevk edilebilir. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Hasat ve kriyo-soğutma egzersizleri amaçları, kriyo-döngüler içine barındırma Mezofaz bir kristal aktarmak ilmekledi kristal sırlamak ve bir Dewar sıvı azot depolama yerleştirmek için burada gösterilmiştir. Hasat ve c nerede ideal bir durumdurryo-soğutma kristal kırınım kalite süreç içinde korunur şekilde yapılır. Mümkün olduğunca az Mezofaz kristal ile hasat edilmelidir. Bu kristal bulmak ve vitrifikasyon amacıyla kriyo-soğutma hızlandırılır ve kırınım veri toplama sırasında Mezofaz arka plan dağılım müdahale en aza indirmek için, X-ışını çok daha az zorlu bunu merkezleme yapmaktır. Kristal görülemez ve kriyo-soğutmalı örneklerin bazı örnekler Şekil 6 &#39;da gösterilmiştir. Kristal gözle görülemez Nerede veri toplama 27 kiriş kristal bulmak ve merkezi ona amacıyla kırınımı rastering başvurmak genellikle gerekli değildir. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Içinde ve üzerinde iki tabakalı lipid gösteren bir biyolojik zar şematik are proteinler çeşitli yer alır. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. A tam yüklü ve mühürlü 96-cam sandviç kristalizasyon tabağı. Her iyi 50 nl kübik faz ve 1 ul çökelti çözeltisi içerir. Anlaşılır olması için, kübik faz Sudan Red ile boyanmış ve çökelti çözeltisi Metilen Blue içerir olmuştur. Referans 5 Gönderen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Lipidik Mezofaz büyüyen membran proteinlerinin Kristalleri. A. H. bacteriorhodopsin bir kristal ile kübik faz E. B12 vitamini reseptörü / taşıyıcı, BtuB bir kristal içeren halobium. B. sünger fazı, coli. Referans 25 Gönderen. Kübik ve sünger fazları Görünüş zıt oylandıRances olarak paneller A karşılaştırarak açıktır ve A orijinal şekline oldukça viskoz ve bozulmaz kübik faz B.. Bu akmaz. Bu, pürüzlendirilmiş bir görünüme sahip mezofaz bolus kenarlarında özellikle belirgindir. Sözleşme ile, sünger faz önemli ölçüde daha az viskoz ve akış yapar. Böylece, sünger faz orijinal şeklini korumak için başarısız olur ve kenarları tipik olarak pürüzsüz. Jeffamine içerir uyaran, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiol, propoxylate bütandiol ve heksandiol, pentaeritritol, kübik gelen sünger faz 4,26 için bir geçiş neden olabilir. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Akış mezo-yetiştirilen membran protein kristalleri üretimi, hasat ve kriyo-soğutma (A) yer alan adımları özetlemektedir. Kesik, kırmızı çevrili Sadece bu adımlarıçizgi, ve (B) &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, bu Jüpiter madde olarak ele alınmıştır. A Referans is from 3 Panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Boş kriyo-döngü bir manyetik çubuk üzerinde yerinde düzenlenen bir pim üzerine monte edilmiş. Pimi (A) ve mikro-mount Genişletilmiş manzarası (B) hasat ve kriyo-soğutma için bu önemli aracı gösterilmektedir. B mikro montaj sonunda boş döngü çapı 30 mikron. Yaygın diğer döngü türleri test değil sahip olsa da, biz MiTeGen kübik ve sünger aşamalarında hem de gösterilen çalışma döngüsü olduğunu bulmak. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Kriyo-döngüler gibi bir sinkrotron beamline üzerine bir in-line mikroskop altında incelendi. A, B membran proteinlerinin Şekil 6. Hasat ve kriyo-soğutmalı kristalleri. Hasat kristalleri örnekleri (caa3 sitokrom oksidaz 34 (A), diaçilgliserol kinaz, DgkA (B)) kristalleri (mavi ok) Avlanan kristal bir kriyo-döngü cryo sogutmali Mezofaz görünmez olduğu bir cryo-loop. C. Örnek cryo sogutmali Mezofaz aracılığıyla görünür olduğu yere. Döngü ucu kırmızı ok ile tanımlanır. Kalarak cryo sogutmali Mezofaz mavi ok ile tanımlanır.

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2%2FD3+selective+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li>
<li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li>
<li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li>
<li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li>
<li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li>
<li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li>
<li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li>
<li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal++structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta%282%29+adrenoceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li>
<li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li>
<li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+nociceptin%2Forphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li>
<li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid%27s+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li>
<li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein%2Fwater+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Ii%22%5BJournal%5D)">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li>
<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712(2010).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000(2012).</li>
<li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa%283%29-type+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video yazıda lipidik Mezofaz yetiştirilen kristaller hasat ve kırınım veri toplama kullanılmak üzere hazırlık ve sonuçta yapı tayini için kriyo-soğutmalı nasıl gösterdi. Hosting Mezofaz viskoz ve yapışkan kübik faz veya daha fazla sıvı sünger faz 4 olabilir. Cam sandviç plakaların nasıl açılır ve kristallerin çok fazla hasat edilir nasıl mezofaz türüne bağlıdır. Bu vaktinden uğraşıyor iki birinin olduğunu bilmek önemlidir. Barındırma lipid ve ikinci çöktürücü ve kimlik bu açıdan önemli olan ve kristalleşme de mezofaz bolus fiziki görünüş de (Şekil 3) birbirinden ayırmak için kullanılabilir. Her iki Mezofaz türlerinden Hasat bu makalede izah edildi. Cam sandviç plakaları bir lipidik Mezofaz gelen küçük kristaller Hasat zamanı, beceri, exper gerektiren zahmetli bir süreçtirience, sabır ve istikrarlı bir el. Tüm malzeme ve teçhizat önceden hazır olduğundan böylece hasat için zaman uygun miktarda bir kenara bırakarak ve laboratuar kurmak için önemlidir. Hasat ile yardımcı olmak için bir ikinci kişi gerekli değil ama tavsiye edilir. Bu kişi hasat yapıyor bireysel ön işaretli tabak tedarik yanı sıra depolama disk içine hasat kristalleri ile cryo sogutmali monte döngüler yerleştirilmesi için yardımcı olabilir. Ayrıca, asistan kırınım veri toplama sırasında önemli kanıtlamak olabilir hasat sırasında yapılan kristalleri üzerinde gözlemler belgeleyen önemli bir destek rolü oynayabilir. Asistan yokluğunda, ses ile aktive ses-kayıt cihazı dokümantasyon için avantaj için kullanılan olabilir. Bu makalede açıklanan protokol sonrasında Görüntüleyicisi kalk ve kristal hasadı ile çalışan yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bu işlem kolay değildir ve bu olduğunu takdir için önemli olan practice değerli membran protein kristalleri hasat içine başlatmadan önce gereklidir. Özellikle değerli değildir protein kristalleri ile test plakaları ilk denemeleri bu nedenle tavsiye edilir. Bu cam kesme değerli bir deneyim ile acemi sağlayacak, cam parçaları kaldırarak Mezofaz yerinden coverglass yukarı kaldırarak, kristaller görmek ve hasat sırasında onları izlemek için mikroskopta polarize özelliğini kullanarak, ve nihayet mesophases farklı türleri ele ve onlardan hasat. Ve uzatma kristaller hasat edilebilir hangi ile kolaylığı, Mezofaz dokusu kristalleşme sırasında zaman ile değişimi yapar. Daha az değerli kristaller ile ama daha değerli olanları aynı koşullar altında yetiştirilen verdiğiniz kişiler ile hasat uygulama için bu nedenle önemlidir. Bu, mezo veya lipidik kübik faz yöntemi 28 ile lizozim ve thaumatin kristallerinin büyümesini mümkün olduğunu ve bu consid olmalıdırmalzemeler ve yöntem ile elde yakınlık yoluyla uzanırlar. Bir de onun kaprislerine öğrenmek için ilk protein içermeyen Mezofaz çalışan düşünmelisiniz. Burada gösterilen prosedürler tüm rahat bir 20 ° C veya oralarda yapıldı. Bu, daha düşük sıcaklıklarda mezo yöntemi ile kristallerin büyümesi mümkündür. Bu nedenle, bir yarı kararlı durum faz içinde barındıran lipid olarak monoolein 4 ° C&#39;de 1,2,29,30 de kullanılabilir. Alternatif bir düşük sıcaklıkta kristalleşme 31 için rasyonel bir şekilde tasarlanmış 7,9 MAG kullanmaktır. Biz belli membran proteini hedefleri ile rutin düşük sıcaklık crysallogenesis yapın. Bu durumda, kristal büyüme ve hasat bir gömme 4 ° C&#39;de soğutma yapılır. Bu koşullar altında çalışmak sıcak ve rahat kıyafetleri ihtiyacı olan değil, en az olan kendi zorlukları vardır. Makromoleküler crys kullanarak yapı tayini genel sürecinde sonraki adımtallography kristaller hasat ve bu makalede gösterildiği gibi ek soğutmalı üzerine kırınım veri toplamaktır. mezo-yetiştirilen yılında kristaller genellikle küçük. Bununla birlikte, kullanışlı kırınım veri toplama 20 mikron 9 olduğu bir maksimum boyuta sahip olan kristalleri ile mümkün olmuştur. Bu amaç için, mikro-ışın sinkrotron X-ışını kullanılan ve bu seri 32,33 ayrı bir Jüpiter madde amacı, bir edilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Bileşenleri </td></tr><tr><td> Eğimli Cımbız </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Tek pipet uçları </td><td> Gilson </td><td> Çeşitli </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Köpük Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Cam ve metal çöp konteynerleri </td><td> Daniels Sağlık </td><td> DD479OL </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Hasat döngüler </td><td> MiTeGen </td><td> Çeşitli </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Mikroskop Hasat </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Çeşitli </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Manyetik itmedüğmesine numune yükleme değnek </td><td> Hampton Araştırma / Moleküler Boyutları </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Orijinal Puck (sadece ALS tarzı robotlar ile kullanım için) </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-035 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Pipetleme cihazlar </td><td> Gilson </td><td> Çeşitli </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Çöktürücü çözümleri </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-030 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Kanca kolu ve kilitleme çubuğu ile Puck rafa Kargo Cane (orijinal ALS-stili) </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-029 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Koruyucu gözlük </td><td&gt; Çeşitli </td><td> NA </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Örnek Pin Bazlar - Manyetik (non-bakır) </td><td> Kristal Konumlandırma Sistemleri </td><td> CP-111-015 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Nakliye Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Araç </td></tr><tr><td> Dokular </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Harcanabilir </td></tr><tr><td> Tungsten-karbür cam kesici (TCT Scriber) </td><td> Silverline Araçlar (Yeovil, UK) </td><td> 633657 </td><td> Araç </td></tr></tbody></table>

makromoleküler kristalografi tarafından yapı tayini için lipidik mesophases yetiştirilen membran proteinlerinin hasat ve cryo-soğutma kristaller

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Proteinler mekanistik bir seviyede nasıl işlediğini anlamak için önemli bir rota ideal atomik çözünürlükte, mevcut hedef proteinin yapısına sahip olmaktır. Halen orada integral membran proteinleri (Şekil 1), ve bunların oluşturdukları kompleksler uygulanan gibi bilgileri yakalamak için tek bir yol olduğunu ve bu yöntem makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX) &#39;dir. MX kırınım kalite kristaller zar proteinlerinin durumunda, ihtiyaç bulunmaktadır yapmak için, kolayca oluşturmaz. Lipidik mesophases, özellikle kübik ve sünger fazlar 1-5 kullanımını gerektirir membran proteinleri kristalize için bir yöntem (bu G protein-kenetli reseptör alanında 6-21 içinde olmuştur başarıları nedeniyle geç de dikkat kazanmıştır <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Bununla birlikte, bu yöntem, bundan sonra mezo veya lipidik kübik faz yöntemi olarak adlandırılan, kendi teknik ile birliktezorluklar. Bu nedeniyle sık sık mikro kristalleri kristaller olarak büyümesi olan lipidik mezofaz genel olarak viskoz ve yapışkan doğası, kısmen ortaya çıkar. Kristaller işleme 22,23 hasat sırasında sonuç olarak zor ve özellikle çok olur. Problemler kriyo-soğutma ve nihai X, hasat için, kristaller burada kristalleri (Şekil 2) 24,25 büyüdüğü içinde cam sandviç plakaların mezofaz bolus ortaya çıkarmak için açılmış olmasını gerektirir ki hasat önce gelen basamakta da ortaya çıkar, ve -ışını kırınım veri toplama. Kristaller hasat edilmelidir hangi kübik ve sünger Mezofaz türevleri (Şekil 3) derinden farklı rheologies 4,26 var. Kübik faz kalın bir diş macunu benzer yapışkan ve yapışkan. Buna karşılık, sünger fazlı akış için ayrı bir eğilim ile daha akışkandır. Açılış kristalizasyon kuyuları containi için Buna göre, farklı yaklaşımlarkübik ve sünger faz içinde gelişen kristaller ng gerçekten farklı yöntemler iki mezofaz tür kristal hasadı için gerekli olmasından dolayı, çağrılır. Rafine ve uygulanan Membran Yapısal ve İşlevsel Biyoloji (MS &amp; FB) Grubu ve bu Jove makale (Şekil 4) ayrıntılı olarak açıklanmıştır oylandı sadece yapmak için protokoller. Örnekler kristaller başarıyla hasat ve kriyo-soğutulur durumlarda verilir. Ayrıca problemler kristaller onarılamaz kaybına neden olduğu durumlarda ortaya çıkan örnekler verilmiştir ve bu sorunların önlenebilir açıklanmıştır. Bu makalede Görüntüleyicisi hasat için, cam sandviç kristalizasyon kuyu açılması ve kübik ve sünger aşamalarında büyüyen membran proteinlerinin kriyo-soğutma kristalleri için adım adım yönergeler sağlanmaktadır.

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

Proteinlerin mekanizmacı düzeyde nasıl çalıştığını anlamanın önemli bir yolu, hedef proteinin yapısının, ideal olarak ... çözünürlükte mevcut olmasıdır.

Merhaba, Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu'na hoş geldiniz. Benim adım Martin Caffery. Bu, in meso veya lipidik kübik faz yöntemi kullanılarak yapı tayini için membran proteinlerinin kristalleştirilmesi üzerine hazırlanan JoVE makale serisinin bir diğer parçasıdır.1 7 1 2 sayılı ilk makalede, protein yüklü kübik fazın nasıl hazırlandığını ve viskoz ve yapışkan meso fazın kristalizasyon denemeleri için cam sandviç kristalizasyon plakalarına manuel olarak nasıl dağıtıldığını gösterdik. Bu video makale, in meso yöntemiyle büyütülen kristallerin hasat edilme ve kriyosoğutma yöntemini açıklayacaktır. In meso yöntemiyle büyütülen kristallerin hasat edilmesi ve kriyosoğutulması için gerekli olan malzeme ve ekipmanlar burada gösterilmektedir.Bunlar arasında, kristaller hakkındaki bilgileri ve gelecekte başvurmak üzere hasat detaylarını kaydetmek için bir laboratuvar defteri, koruyucu gözlükler, cam ve metal atık konteynırları, kristallerin hasat edileceği cam sandviç kristalizasyon plakası bulunur. Kristal içeren kuyucuklar belirgin şekilde işaretlenir, kristalizasyon kuyucuklarını açmak için bir cam kesme aleti, peçete ve bir su şişesi, kavisli pensler, çöktürücü ekran çözeltisi, bir mikropipet ve uçlar, kristalleri hasat etmek için kriyoluplar, bir manyetik çubuk, kristalleri içeren kriyosoğutmalı lupları saklamak için bir pok, kriyosoğutma için sıvı azotla doldurulmuş bir köpük kutu, kristal pensleri, bir taşıma veya saklama kutusu ve bir hasat mikroskobu yer alır.Hasat hazırlığı için, köpük haznesi sıvı azotla doldurulmalı ve hasadın gerçekleştirileceği mikroskobun yanına önceden yerleştirilmelidir. Açık ucu yukarı bakan saklama kapsülü, haznedeki sıvı azotun içine daldırılmalı ve soğumaya bırakılmalıdır; hasat edilecek kristalle uyumlu boyuttaki bir kriyodöngü, tüm malzeme ve ekipmanlar hazır haldeyken manyetik çubuk üzerindeki bir mikro tutucuya sabitlenmelidir. Bir sonraki görevimiz, kristal içeren plakaları ve kuyucukları belirlemektir.Bunu iki yoldan biriyle yapabiliriz. En basit ve en doğrudan yöntem, kuyucukları normal ve polarize ışık altında bir mikroskop kullanarak elle incelemektir. İkinci yöntem ise plakaların normal ve polarize ışıkla otomatik olarak tarandığı bir görüntüleme cihazı kullanımını içerir.Dijital görüntüler görüntüleyici tarafından kaydedilir ve bir bilgisayar monitöründe değerlendirilir. Hasat edilecek kristallerin bulunduğu kuyucuklar net bir şekilde etiketlenmelidir. Görüntüdeki kristallerin boyutu, kalitesi ve konumu hakkındaki notlar laboratuvar defterine veya bilgisayara kaydedilmelidir.Bu, hasat aşamasında yardımcı olacaktır. Burada, hasat edilecek kristalleri içeren bir plaka görüntüleyiciden çıkarılır ve kuyucuk açılır; son-mezo yöntemiyle kristallerin büyütüldüğü plakalar, burada gösterilen tipteki cam sandviç plakalardır. Mezo ve içindeki kristallere erişebilmek için kuyucuğun açılması gereklidir.Bu işlem, kuyucuğu mühürleyen üst örtü camını kesmek için bir cam kesme aleti kullanılarak yapılır ve ardından cam çıkarılabilir. Bunu gerçekleştirmek için birkaç farklı yaklaşım mevcuttur. Hangi yöntemin kullanılacağı, kristalin büyüdüğü ortamın türüne göre belirlenir.Bu, oldukça viskoz ve yapışkan kübik faz veya kübik fazın daha akışkan bir varyantı olan sünger faz olabilir. Bu video makalesinde, her iki konakçı materyalden kuyucukların nasıl açılacağını ve kristallerin nasıl hasat edileceğini gösteriyoruz. Bu video sekansında, viskoz kübik faz içeren bir kuyucuktaki örtü camının çizilmesinin iki yolunu gösteriyoruz.Çizme ve kesme işlemi, bir ışık mikroskobu ile incelenerek detaylı bir şekilde gösterilmektedir. İlk olarak tek bir kristalleşme kuyucuğunu inceleyerek farklı kısımlarını tanımlayarak başlıyoruz. İlk kırmızı ok, kristalleri içeren mease bolusunu göstermektedir.Bu arada, bu özel sekansta kristaller görünmemektedir. İkinci ok, mease'yi çevreleyen çöktürücü çözeltiyi göstermektedir. Üçüncü ok ise kuyucuğun çevresini göstermektedir.Dördüncü ok, lamelin üzerine yerleştirildiği çift çubuklu ara parçaya işaret etmektedir. Cam kesici kullanılarak lamel, kuyucuk çevresinin hemen dışına yerleştirilmiş iki eş merkezli daire şeklinde hafifçe çizilir. Ardından, çizilmiş iki daire arasındaki boşlukta kalan camı kırmak için cam kesici kullanılır.İç lamın serbest bırakılması amacıyla yapılan bu işlem, nemli bir kağıt havlu ile temizlenebilen çok sayıda cam kırığı ve toz oluşturur. Serbest kalan lam, dairesel kenarı boyunca ara parçanın üzerine oturur. Lam, ince uçlu bir cımbızla tutulup kuyucuktan dışarıya doğru eğilerek çıkarılır.Bu durumda, kübik faz kuyucuğun tabanında sabit kalır. Presipitanın bir kısmı lamel ile birlikte uzaklaştırılır, ancak presipitanın hatırı sayılır bir kısmı mease bolusunun çevresinde kalmaya devam eder. Yakınlaştırdığımızda, kristal hasadı için kullanıma hazır olan kübik mease'nin daha net bir görüntüsünü elde ederiz.Bir sonraki sekansta, viskoz kübik faz içeren bir kristalizasyon kuyusunu açmanın ikinci bir yolunu gösteriyoruz. Bu durumda, örtü camı üzerinde, kuyunun bir yanından başlayıp kuyunun üzerine doğru uzanan ek düz çizikler ve kadeh şeklinde çizgiler oluşturulur. Bu işlem, örtü camına cımbızla erişimi ve camın çıkarılmasını kolaylaştırır.Bu özel gösterimde, lamel çatlar ve lameli yapışkan boşluktan veya yüzeyden kurtarma işlemi sırasında lamelin kendisi hareket ederek çöktürücü madde kübik fazdan ayrılır. Lamel kaldırıldığında, çöktürücü maddenin bir kısmı lamel ile birlikte kalkar. Ekran görüntüsü, işlemin uzaklaştırılmış bir görünümünü göstermektedir.Şu an, mease'nin kurumasını ve kristallerin zarar görmesine neden olabilecek bir faz değişimini önleyecek herhangi bir çevreleyici çöktürücü madde bulunmayan, açıkta kalmış bir mease bolusu ile karşı karşıyayız. Mikro pipet kullanılarak bolusun üzerine taze çöktürücü eklenir. Bolus artık kristal toplama işleminde kullanılmaya hazırdır.Sünger fazının akışkanlık özelliği nedeniyle çalışması biraz daha hassastır. Eğer bu akış sonucunda sünger fazı kuyucuk çevresine temas ederse, faz dışarı çekilecek ve kristaller kaybolacaktır. Bunun gerçekleştiği bir örnek bir sonraki video klipte gösterilmiştir.Sünger fazına yakınlaştırma ile başlar ve ardından normal ışık ile çapraz polarize ışık arasında geçişler yapılır. Normal ışık altında fark edilmesi zor olan kristaller, çapraz polarizörler arasında siyah bir arka plan üzerindeki parlak yansımalar şeklinde net bir şekilde görülür. Kuyucuğun açılmasına hazırlık olarak, lamel yukarıda açıklandığı şekilde çizilir ve kesilir.Ancak bu işlem sırasında, lamine camın olmaması gereken bir yerden çatlaklar oluşur. Kuyu açma işlemine devam etmek amacıyla bazı manipülasyonlar gerçekleştirilir, fakat çöktürücü madde çatlak yönünde kayar ve sonunda ara parçayla temas eder; şans eseri çöktürücü ile birlikte sünger fazının bir kısmı ve doğal olarak içindeki yük de gider. Bu özel dizideki kristaller için, mikroskoptaki polarizörler tamamen çaprazlanmamıştır ve kuyu ile içeriği görünür kalırken kristaller aynı zamanda parlak nesneler olarak görülebilmektedir.Bir sonraki klipte, öncelikle fazla çöktürücünün uzaklaştırılmasıyla sorunun nasıl çözüldüğünü gösteriyoruz. Sünger fazına yakınlaşarak başlayıp hem normal ışık altında hem de çapraz polarizörler arasında bir kristal tanımlıyoruz; kapatma camının bir bölümü oyulup kesiliyor ve ardından kuyucuğun üzerinden dikkatlice kaldırılıyor. Kristali takip etmek için bir kez daha çapraz polarize ışık kullanılıyor ve kristal belirgin bir şekilde parlıyor.Kuru bir parça kağıt mendil, lameldeki açıklıktan geçirilerek çöktürücü çözeltiye değene kadar kuyucuğa yerleştirilir. Çözelti, neredeyse tamamı gidene ve sünger fazı emiciye doğru hareket etmeye başlayana kadar dikkatlice çekilir. Mendilin çıkarılması, kalan çöktürücünün ve kristalleri hala yerinde olan sünger fazının lamel altına geri çekilmesine neden olur.Netlik sağlamak amacıyla, bu son sekansın ağır çekim tekrarı burada gösterilmiştir. Lamel camının geri kalanı oyulur ve kesilir. Daha önce açıklandığı gibi, lamel camı şimdi pensle kaldırılır.Ek görsel, işlemin uzaklaştırılmış bir görünümünü göstermektedir. Bu özel durumda, sünger fazı kalıntıların bir kısmını kuyucukta bırakırken bir kısmının lam üzerine yapıştığını görülmektedir. Çapraz polarizörlerle bakıldığında, kristalin lam üzerindeki bolus içinde olduğu anlaşılmaktadır.Kristal, sünger fazında net bir şekilde görülmektedir ancak mevcut çöktürücü miktarı çok az olduğu için muhtemelen kuruma nedeniyle bir faz geçişi gerçekleştirmeye başlar. Bu durum, bolusun merkezine doğru ilerleyen biyolojik saçaklardan oluşan bir halka şeklinde görülebilir. Bolusa çöktürücü ekleyerek, kristallerin hasat edilmesi olan bir sonraki adıma hazırlık amacıyla bu süreç durdurulabilir ve geri döndürülebilir.Kuyu açılıp konakçı Misa fazı açığa çıkarıldıktan sonra, sürecin bir sonraki adımı kristalleri toplamaktır. İlerleyen kliplerde, kübik fazdan ve sünger fazdan kristal toplama örneklerini gösteriyoruz. Yeni açılmış kuyuktaki mea fazı, uygun kristalleri belirlemek için mikroskop altında incelenir.Normal ve polarize ışık arasında gidip gelmek bu sürece büyük ölçüde yardımcı olabilir. Kurumayı yavaşlatmak veya durdurmak için bolusa eklenmek üzere çöktürücü çözeltiler el altında bulundurulmalıdır. Ardından, yeni açığa çıkmış vizkoz fazda kristallerin aranması, kristallerin seçilip alınması ve hasat edilir edilmez kriyodöngü ile birlikte hemen sıvı azota daldırılması için monte edilmiş bir kriyodöngü kullanılır.Aşağıda, bu hasat dizisinde öncelikle viskoz ve yapışkan kübik fazdan hasat yapılışını dört Biore kenarına kadar gösteriyoruz ve polarize ışık altında kübik faz bolusunda kristaller görülebilmektedir. Kriyolup sağdan gelerek kristali mümkün olduğunca az yapışkan materyal ile alır, hemen kriyosoğutulur ve lup, sıvı azot altındaki saklama diskine yerleştirilir. Hasat işlemi bu klipte üç kez tekrarlanmaktadır.Polarizör, kristalin konumunu kontrol etmek için her seferinde kullanılır. Hasat işleminden sonra kriyo loop içerisinde kristalin aranması mümkün olmadığından, kristalin artık orada olmadığını doğrulamak ve böylece başarıyla hasat edildiğini anlamak için kristalin alındığı mesa fazının kontrol edilmesi faydalıdır. Bir sonraki sekansta, kübik fazda olduğu gibi, kristalle birlikte mümkün olduğunca az miktarda sünger fazının alınması gerektiği belirtilerek, daha akışkan olan sünger fazından hasat işlemi gösterilmektedir.Kristali çevreleyen kriyojenik döngüde ne kadar çok sıvı olursa, kristali gözle tespit etmek o kadar zor olacaktır. Kırınım veri toplama sırasında, daha fazla arka plan saçılmasına neden olarak ölçüme katkıda bulunacaktır. Bir sonraki sekansta, hemen gerçekleştirilmesi gereken kriyojenik soğutma işlemini gösteriyoruz.Kristal, toplama işlemi ile sıvı azota daldırma işlemi arasında mümkün olan en kısa süre geçecek şekilde hasat edilir. Monte edilmiş loop sıvı azota daldırıldıktan sonra, kapıdaki saklama diskindeki tutucu yuvalardan birine (bu örnekte bir numaralı konuma) yerleştirilir ve manyetik çubuktan serbest bırakılır. Bu aşamada, hasat edilen ve kriyojenik olarak soğutulan kristallerin konumu ve ayrıntıları deftere ve/veya bilgisayara kaydedilmelidir.Köpük çekmecesinde bulunan puck dolduğunda veya günün toplama işlemi tamamlandığında, puck'ı sıvı azot ile doldurulmuş bir saklama veya taşıma J'sindeki raflı bir puck tutucuya aktarın. Sonraki iki görüntü, cryo looplar içinde toplanmış cryo soğutmalı kristallerdir. Yukarıdaki protokole uygun olarak, kristaller loop içerisindeki meza fazında net bir şekilde görülebilir.Ancak bu durumda kristal görünür değildir ve kırınım ışınımı ile konumlandırılması gerekir. Makromoleküler kristalografi kullanılarak yapılan yapı belirleme sürecinin bir sonraki adımı, bu makalede gösterildiği şekilde elde edilen kristallerden difraksiyon verilerinin toplanmasıdır. Bu işlem genellikle senkrotron X ışınları kullanılarak gerçekleştirilir ve bu serideki ayrı bir JoVE makalesinin konusunu oluşturmaktadır.

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri...

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.

Nötron Makromoleküler Kristalografi için Kristal Büyümesinin Optimizasyonu

Bu makalenin amacı, izleyiciye, büyük, tek protein kristallerini büyütmek için küçük hacimli, buhar-difüzyon protokollerini seri kristalografi için büyük hacimli bir toplu mikro-kristalizasyon yöntemine nasıl dönüştürecekleri konusunda sağlam bir anlayış kazandırmaktır.

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Sunulan protokol, 96 kuyucuklu yüksek verimli bir diyaliz plakası kullanarak protein kristalleşme koşullarını ve kristal büyümesini taramak için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır. Mikrokristallerin büyük ölçekli büyümesi için diyalizör tüplerinin kullanımı, seri kristalografi ve MicroED uygulamaları için de gösterilmiştir.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Öğrenin, lipidik kübik ve sünger fazlarda yetiştirilen membran protein kristallerinin hasat ve kriyosoğutma yöntemlerini. Bu teknikler, makromoleküler X-ışını kristalografisi ile yapı tayini için kritik öneme sahiptir.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller (Video) | JoVE Journal

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

Daha fazla video keşfet