İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden veya tetraploid embriyo tamamlaması ile I PSC'lerden yetişkin fareler üretmektir. Bu, ilk varışla gerçekleştirilir. Lentivirüsler kullanan, OCT dört, SOX iki, KLA dört ve cmic taşıyan ve ortamı valproik asit veya VPA ile destekleyen fare embriyonik fibroblastlarından elde edilen PSC'ler.

IPC'ler üretildikten sonra, immün boyama, kromozom sayımı ve embriyo gövdesi oluşumu ile karakterize edilirler. Bir sonraki adım, füzyon ve in vitro kültür yoluyla alıcı tetraploid blast desteği oluşturmaktır. Daha sonra, IPSC tetraploid blast assist içine enjekte edilir ve tamamlayıcı blast assist gebelik için alıcı dişilere nakledilir.

Son adımda, tam zamanında doğan hayvanlar sezaryen ile ve taşıyıcı annelere teslim edilir. Böylece doğum sonrası gelişim izlenebilir. Sonuçta, eğer yaşayabilirse, tam vadeli hayvanlar üretilir.

Tahlil IPSC hattı tamamen pluripotent olarak kabul edilir. Bu tekniğin diğer I PSC üretme yöntemlerine göre ana avantajı, yöntemimizin tekrarlanabilir bir şekilde tamamen pluripotent IPS hücre hatları üretmesidir, bu yöntemler tarafından üretilen IPS hücre hatları, IPS hücrelerinin pluripotentliğini karşılaştırmak veya diğer yeniden programlama Yöntemlerinin eşdeğerliğini belirlemek isteyen diğer araştırmacılar için yararlı olabilir. Bu yöntemler, in vitro farklılaşma deneyleri gibi belirli aşağı akış uygulamaları için tamamen pluripotent IPS hücre hatları oluşturmak isteyen araştırmacılar için faydalı olacaktır.

Tüm IPSC farelerinin neslini ilerletin. Telo tamamlamasının kullanılması, çeşitli hücre hatlarının genetik ve epigenetik stabilitesini belirlemek için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. Tetraploid embriyo tamamlamada yer alan mikrom manipülasyonları teknik olarak zordur.

Birinin yetkin hale gelmesi birkaç ay sürebilir IPSC'nin bu teknikle geliştirildiği teknikler, geleneksel ESL gen hedefleme deneylerinde kullanılanlarla benzer kültür koşulları gerektirir. HEC 2 9 3 T hücrelerinin lentivirus ile transfeksiyonundan 24 saat sonra. Büyüme ortamını çıkarın ve 25 mililitre taze ön ısıtma teknolojisi ile değiştirin.

HEC 2 9 3 T hücrelerinin lentivirüslü transfeksiyonundan 48 saat sonra, 24 saat boyunca inkübatöre orta dönüşlü TRANSFEKTE edilmiş hex, transfekte edilmiş hücrelerden lentiviral partiküller içeren büyüme ortamını toplar. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3000 Gs'de santrifüjleme ile virüs içeren ortamdan partikül kalıntılarını çıkarın. Daha sonra, virüsü dört santigrat derecede 112.000 G'de iki saat boyunca% 20'lik bir sükroz yastığı boyunca ultrasantrifüjleme yoluyla konsantre edin.

Viral peleti bozmadan dekontaminasyon için dikkatlice bir atık kabına boşaltın. Viral peleti 0.4 mililitre fare embriyonik fibroblast ortamında yeniden süspanse edin ve tüpü kapatın. Daha sonra 15 ila 30 dakika boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayın.

Viral partikülleri ve tek kullanımlık alikotları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çizgiler fare embriyonik fibroblastlarından veya metamfetamin hücrelerinden türetilir. IPSC kolonileri parlak, kırılmalı, iyi tanımlanmış bir sınıra sahip olduklarında ve 30 ila 50 hücre içerdiklerinde, bağımsız IPSC hatları olarak manuel olarak toplanmaya ve genişletilmeye hazırdırlar.

Jel yüklemeli bir pipet ucu ile tek kolonileri seçin ve her bir koloniyi doğrudan 20 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA içeren U tabanlı 96 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğuna aktarın, toplanan kolonileri ve tripsini 37 santigrat derecede yaklaşık sekiz dakika inkübe edin veya koloniler tek hücrelere ayrışana kadar. Işık mikroskobu ile ayrışma ilerlemesini izleyin. Nazik tasyon gerekli olabilir.

Ayrışmış hücre süspansiyonunu, doksisiklin ve VPA ile desteklenmiş bir besleyici tabaka ve 150 mikrolitre ESC ortamı içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarın, IPSC kolonileri her bir kuyucukta yeniden ortaya çıktığında, standart ESC türetme ve hücre kültürü prosedürlerini kullanarak analiz ve hücre bankacılığı için daha büyük kuyucuklara bölün, tetraploid blast yardımı oluşturma prosedürünü başlatmak için. Dişi farelerden toplanan bir hücreli embriyolar, ertesi gün 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit olan KSOM'da gece boyunca iki hücreli embriyoya kültürlenir. 10 santimetrelik bir Petri kabına bir BTX mikro slaytı yerleştirin.

Slaytı çözeltiye batırmak için yeterli oda sıcaklığında elektro füzyon ortamı dökün, ancak elektrotun kutupları tamamen suya batırılacak kadar fazla değil. BTX elektro hücre manipülatörü ECM 2001 ve BTX arttırıcı 400'ü açın. ECM kablolarını mikro slayt elektroduna bağlayın ve sürgünün istenmeyen hareketini önlemek için kabloları petri kabının yan tarafına sabitleyin.

BTX arttırıcıda bir okuma almak için bir manuel darbe çalıştırın ve uygulanan bir DC akımlarının voltajını not edin. AC akımı, embriyoların elektrotlar arasında hizalanma hızını kontrol edecektir. DC akımı, küfürleri kaynaştıracak ve darbe süresi, DC darbesinin uzunluğunu ayarlayacaktır.

İyi bir başlangıç noktası AC üç volt DC 100 volt ve çarpı 0.05 milisaniyedir. Optimum DC, 90 ila 150 volt arasında değişir. Ağız pipeti kullanarak.

KSOM kültüründen 30 ila 42 hücreli embriyo alın ve bunları bir damla elektrofüzyona aktarın. Orta: birkaç damla elektro füzyon ortamı ile yıkayın. Ardından, mikro sürgülü plakadan ağız pipetine taze elektro füzyon ortamı çekin.

Yıkanmış embriyoları alın ve mikro slayt üzerindeki elektrotlar arasındaki bir milimetre boşluğa yerleştirin. Embriyoların boşluğun ortasına doğru hizalanmasına ve birbirleriyle temas halinde olmamasına dikkat edin. Manuel başlat düğmesine basarak AC akımı uygulayın.

Embriyolar, blasier temas düzlemi elektrotlara paralel olana kadar AC alanında dönecektir. Embriyolar birkaç saniye içinde hizalanmazsa, AC ayarını artırın. Embriyolar hizalandıktan sonra, pipette elektro füzyon ortamı ile DC darbesini uygulamak için manuel başlat düğmesine tekrar basın.

Embriyoları mikro slayttan toplayın, embriyoları birkaç damla KSOM ortamından yıkayın ve daha sonra embriyoları KSOM'da 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte mineral yağ altında kültürleyin. Püskürtücü füzyonu 30 dakikadan daha kısa sürede tamamlanmalıdır. Kültürde, kaynaşmış blastomerli embriyoları başarıyla izleyin ve seçin.

Kaynaşmış embriyolar, kültürde 30 dakika sonra bir hücre aşamasında atılmış ve iki hücreli embriyo gibi görünecektir, kaynaşmış embriyoları 37 santigrat derecede mineral yağ altında mikro KSOM damlalarında kültürlemeye devam edecektir. IPC'leri blast enjeksiyonu için hazırlamak için% 5 karbondioksit, daha önce bankalanmış IPC'leri çözün ve bunları besleyicilerde hücrelere en az bir kez ESC ortam geçişinde besleyicilere yerleştirin. Enjeksiyon için kullanmadan önce çözüldükten sonra.

% 70 ila 80 birleşik IPC'ler içeren altı oyuklu bir plakanın bir oyu, enjeksiyon aspirat büyüme ortamı için yeterli sayıda hücreden fazlasını sağlayacak ve hücreleri 0.5 mililitre ön ısıtmada kalsiyum veya magnezyum içermeyen üç mililitre PBS ile yıkayacak,% 0.05 tripsin EDTA hücrelere ve 3.0 mililitre ESC ortamında ara sıra sallanarak 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve tek bir tane elde etmek için yineleyin hücre süspansiyonu. Tek bir hücre süspansiyonunun, kolonilerin veya hücre agregatlarının enjeksiyon pipetini tıkadığından emin olmak için hücreleri ışık mikroskobu ile gözlemleyin. Tek hücreli bir süspansiyon elde edildikten sonra, kuyucuğa bir mililitre ESC ortamı ekleyin ve plakayı 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

Yaklaşık 15 dakika veya besleyici hücrelerin çoğu yapışmaya başlayana kadar inkübe edin, IPC'leri içeren ortamı nazikçe çıkarın. Haftalık yapışık besleyici hücreleri yerinden çıkarmamaya dikkat edin. IPC'leri beş dakika boyunca 200 Gs'de beş mililitre ESC orta santrifüj içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Süpernatanı aspire edin ve ESC ortamının geri kalanını bir mikro pipetle çıkarın. Peleti çıkarmak için tüpe dokunun ve hücreleri 0,2 ila 0,5 mililitre önceden soğutulmuş FHM ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri tetraploid içine enjeksiyon yapana kadar ve enjeksiyon sırasında buz üzerinde saklayın Blast assist enjeksiyonu protokolü için, lütfen bu makaleye eşlik eden el yazmasına ve daha önce yayınlanmış bir strove makalesine bakın, bir alıntısı burada ekranda gösteriliyor.

Bir yeniden programlama deneyi sırasında fibroblasttan IPSC kolonilerine morfolojik ilerlemenin örnekleri bu görüntülerde gösterilmiştir. Morfolojik heterojenlik ve kısmen yeniden programlanmış IPSC koloni oluşumu, panel B'den EESC'ye gösterildiği gibi, doksisiklin VPA baskısından dört ila beş gün sonra başlayarak gözlenmelidir. IPSC gibi, koloniler Panel F'de gösterildiği gibi yedi ila 10 gün arasında görünmelidir.Diploid iki hücreli embriyoların elektro füzyonu ile tek hücreli telo embriyolarının üretimi oldukça verimlidir.

Tetraploid tek hücreli embriyolar üretmek için başarılı bir şekilde kaynaşmış tedavi edilen iki hücreli embriyoların %95'ine kadarını gözlemlemek rutindir. Bu deneyde IPSC'yi tetraploid blast assist'e enjekte etmek için kullanılan protokol, diploid kimera oluşumunu kolayca ekarte etmek için kimerik fareler oluşturmak için E SES'in diploid blast assist'e enjeksiyonu protokolüne benzer, IPS'leri ve tetraploid embriyoları oluşturmak için kullanılan fare suşlarının pigmentasyonu mümkün olduğunda dikkatlice seçilir. Bu örnekte, tetraploid embriyolar bir albino suşundan üretilir ve IPSC pigmentli bir suştan üretilir.

Bu nedenle, yenidoğan IPSC fareleri yetişkinlikte pigmentli gözler ve homojen pigmentli bir kaplama rengi sergilerken, diploid kyras karışık albino ve pigmentli renklendirme gösterecektir. Doğan canlı yavruların sayısı, bu tabloda gösterildiği gibi hücre hattına bağlıdır. Ortalama iyi bir IPSC hattı için, deneyciler, enjekte edilen blast yardımının %1 ila %10'u arasında canlı yenidoğan yavruları vermesini beklemelidir.

Bu videoyu izledikten sonra, tamamen pluripotent IPS hücrelerinin nasıl türetileceğini ve ayrıca gelişimsel potansiyellerini nasıl doğrulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Tetraploid tamamlama testini kullanma MES'in türetilmesinden yenidoğan IPSC'ye kadar bu tekniğe hakim olduktan sonra, fareler iki ila üç ay arasında tamamlanabilir. I PSC'lerin geliştirilmesi ve bakımı, yüksek düzeyde hücre kültürü tekniği gerektirir.

ESL kültürü ile ilgili önceki deneyim çok önemlidir. Lentivirus ile çalışmayı unutmayın, özellikle konsantre lentivirüs son derece tehlikeli olabilir. Bu işlemi takiben kurumunuzun gerektirdiği kişisel koruyucu ekipmanları her zaman giymeli ve virüsle temas eden her şeyi en az 20 dakika boyunca %10 çamaşır suyu ile tedavi ettiğinizden emin olmalısınız.

Tüm IPSC fareleri ve dokuları fizyolojik, patolojik ve davranışsal fenotipler için analiz edilebilir.