Name: İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Öğrenin, tetraploid embriyo tamamlama yöntemiyle indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden yetişkin fare üretimini. Bu protokol, iPSC hatlarının tam pluripotensini doğrulamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

KKB Destek, MJB, JLH ve KLN Rejeneratif Tıp California Institute, Pew Charitable Ortaklıklarına Biyomedikal Scholars Program, Esther B. O&#39;Keeffe Aile Vakfı ve Shapiro Aile Vakfı tarafından sağlanmıştır. KKB bir Donald E. ve Delia B. Baxter Vakfı Fakülte Akademik olduğunu.

Bu yöntem, Boland ve ark. Nature bildirilen araştırmada kullanılmıştır. 461, 91-96 (2009). 1 1. Lentivirus hazırlanması Bu protokol bir Teto yanıt elemanı kontrolü altında Oct4 için Sox2, Klf4, ve c-myc encode doksisiklin-indüklenebilir lentiviral mekik vektörleri kullanmaktadır. Transgenlerin doksisiklin varlığında yeniden programlanması faktör ekspresyonuna sebep olur ters tetrasiklin trans aktive edici protein, rtTAM2.2 16 ile aktive edilir. Bu sistem, yeniden programlanması faktörlere sıkı kontrol, yüksek ifade için olanak sağlar. Burada kullanılan lentiviral vektörleri kendini etkisiz olduğu ve bu nedenle aşağıdaki genomik entegrasyon çoğaltamıyor. Lentiviruses ile çalışan ve BSL-2 (ABD) ve S2 (Avrupa) standartlarına uyumlu laboratuvarlarda yapılmalıdır Ancak, dikkatli olunmalıdır. <ol><li> En az bir kez tra önce HEK293T hücreleri ve geçit çözülmensfection. Hücreler 37 HEK orta yoğunlukta subconfluent tutulmalıdır ° C,% 5 nemlendirilmiş bir ortam içinde CO2. 1:06-01:10 bir split oranı ile rutin pasaj hücreler 2 günde. </li><li> Tohum ~ 8 x 10 6 25 ml HEK orta HEK293T cells/T150. Her bir lentivirüs hazırlanması için bir T150 kullanın. </li><li> Kalsiyum fosfat çökeltme ile ertesi gün hücrelerin transfekte HEK293T. (Not: Elimizdeki kalsiyum fosfat çökeltme rutin olarak% 80-90 transfeksiyon verimi ile sonuçlanır, ancak bu tür lipofektamin 2.000 katyonik lipid transfeksiyon reaktifler de kullanılabilir). Hazırlanması için her bir virüs için iki adet 15 ml&#39;lik konik bir tüp hazırlanır. &quot;A&quot; ve &quot;B&quot; tüpleri etiketleyin. Tüp A, her biri 10 ug: lentiviral mekik vektörünün kodlama yeniden programlanması faktörleri (ya da rtTAM2.2), viral paketleme vektörler, ve plasmid kodlama viral zarf proteini VSVg. Tüp A 186 ul 2 M CaCl2 ekleyin ve steril H 2 O ile 1.5 ml hacimleri getirir. Tüp B: 1.5 mL 2x HBS (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılır.) </li><li> Bir homojen çözelti kadar Tüp A içinde karışım pipet. A B çözeltisi damla damla çözeltisi ekleyin ve 2-3 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> HEK293T hücrelerinin büyümesini orta aspire ve 22 ml önceden ısıtılmış HEK penisilin olmadan orta ve streptomisin ile değiştirin. </li><li> Pipet kombine çözümler AB (kalsiyum fosfat çökelti) doğrudan hücre HEK293T ve hafif sallanan tarafından eşit şekilde dağıtmak. </li><li> Lentivirüs ile HEK-293T hücrelerin transfeksiyon sonra 24 saat, büyüme orta kaldırmak ve taze, önceden ısıtılmış HEK orta 25 ml ile değiştirin. Inkübatör transfekte Heks dönün. </li><li> 48 saat lentivirüs ile HEK-293T hücreleri transfeksiyondan sonra, transfekte edilmiş heks dan lentiviral parçacıkları içeren büyüme ortam toplamak. 5 dakika 4 ° C&#39;de 3.000 x g&#39;da santrifüjleme ile hasat çözelti viral partikül artıkları kaldırma </li><li> Ultrasantrifügasyon uçtan bir uca tarafından virüs Konsantreöf 4&#39;te 112,000 x g&#39;de 2 saat için bir% 20 sakroz yastığı (2 mi sucrose/25 ml viral süpernatant) ° C. Nazik sallama ile 15-30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 0.4 ml EMB orta viral pelet süspanse edin. -80 Tek kullanımlık alikotları (yani 50 ul) viral parçacıkların saklayın ° C </li></ol> 2. Yeniden programlanması için Fare Embriyonik Fibroblast hazırlanması (MEF) Not: Burada açıklanan protokol TEC tahlillerde kullanılmak için E 13.5 fare embriyonik fibroblastlardan iPSCs bir türetme ile ilgilidir. Diğer gruplar yetişkin donör hücre kaynaklarından tüm IPSC farelerde oluşturulan olmasına rağmen, biz diğer hücre türleri üzerinde bu yöntemi test değil ve donör hücre tipi bir faktör değildir emin olamaz. <ol><li> Fare zamanlamalı çiftleşmelerin ayarlayın. Embriyonik gün 13.5 (E13.5) üzerinde, hamile kadın ötenazi ve rahim boynuzları gelen embriyolar teşrih. Buz üzerinde 1x PBS içinde yer ve mağaza embriyolar (4 ° C kadar önceden soğutulmuş). </li><li> Extraembryonic dokular (yani kaldırkoryon, amniyon ve plasenta). Embriyo başını kesmek ve kuyruk kaldırmak (opsiyonel - genotipleme için gerekirse) ve bacaklarda. Iç organları, kullanarak forseps veya bir kepçe biçimli bir mala boaltınız ve bir neşter veya keskin makas bıçağı ile kalan karkas kıyma. </li><li> 5 ml önceden soğutulmuş 1x PBS kıyılmış karkas yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire. 37 5 ml% 0.25 tripsin-EDTA ve inkübe pelet Askıya ° C dinç 20-30 dk sallayarak. </li><li> EMB ortam (37 ° C&#39;de ön-ısıtılmış), 5 dakika boyunca 200 x g ile santrifüj karışımı 5 ml ilave edilir. </li><li> Önceden ısıtılmış MEF ortamda süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet aspire. </li><li> % 0.1 jelatin ile önceden kaplanmış bir 6-kuyulu plakanın kuyularının 2-3 Plak ayrışmış MEFS. Bu pasaj 1 olarak kabul edilir. </li><li> 1:04-01:05 her 48 saat dilusyondaki Passage MEFS. Geçit 3&#39;te MEFS lentiviral transdüksiyon için hazırız. </li></ol> 3. IPSC Hatları türetilmesi <ol><li> Lentiviral transdüksiyon önceki gün; tohum ~ 3 x 10% 0,1 jelatin ile önceden kaplanmış bir 6-plaka çok iyi birine 5 ilköğretim MEFS. </li><li> 1. Gün: Birincil MEFS lentiviral transdüksiyon için 80-90% konfluent olmalıdır. 37 gece boyunca MEFS ile doğrudan MEF ortam ve inkübe lentiviral parçacıklar ekleme ° C&#39;de nemlendirilmiş bir ortam içinde% 5 CO2. </li><li> Ertesi gün (2 gün) orta aspirat ve viral parçacıkların kaldırılması için 1x PBS 3 ml ile iki kez yıkayın. </li><li> 0.5 ml önceden ısıtılmış ara sıra sallama ile 3-5 dakika için 37 hücreleri ile inkübe ° C ila% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için öğütmek. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için ışık mikroskobu ile hücrelerin gözlemleyin. </li><li> 5 ml MEF medya içeren 15 ml konik tüp içine Transferi MEFS. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin. MEF orta süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe aspire. </li><li> Eşit bir 6 kuyu p iki kuyu arasındaki hücre süspansiyonu bölünmüş% 0.1 jelatin ile önceden kaplanmış geç. </li><li> Ileri ve geri plakası Kaya, yan yana, ve bir kez iyi boyunca hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için dairesel bir hareket. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe, nemlendirilmiş bir ortam içinde% 5 CO2. </li><li> 3. Gün: Tekrar% 0.1 jelatin ile 6 plaka önceden kaplanmış 3 kuyu iyi birinden eşit hücreleri bölme hariç 4-9 adımları yineleyin. Bu birincil fibroblastlar transduced 6 kuyu verecektir. </li><li> Gün 4: 10 ug / ml 5/6 kuyu için bir konsantrasyonda Ekleme doksisiklin (DOX). Bir iyi bir kontrol olarak hizmet için arıtılmamış kalmalıdır. </li><li> Dox ile tedavi 5 kuyu 1.9 mM 3&#39;te VPA ekleyin. VPA MEFS proliferasyon hızını azaltır. Subconfluent kültürleri 2-5 gün içinde senesce eğilimindedir, oysa MEFS yoğun kültürleri VPA uzun süreli maruz tolere. Bu nedenle, MEFS VPA ilave edilir% 100 birbirine karışan olmalıdır. Not: Bu bilinen bir epigenetik değiştirici, ve sh olmuştur çünkü bizim reprogramming deneylerde VPA kullanımıtam pluripotent IPSC hatları oluşturmak bakımından etkileri ve VPA etki mekanizması bilinmemekle birlikte, IPSC kuşak 17 etkinliğini arttırmak için kendi. </li><li> 5. Gün:, orta aspire önce olduğu gibi hücrelerin yıkayın ve Trypsinize. Taze dox ve VPA ile takviye ES hücre ortamında önceden kaplanmış 10 cm tabaklar 2 ile% 0.1 jelatin ve diğer koşulların her biri ile önceden kaplanmış 15 cm2 doku kültürü çanağı dox / VPA ile tedavi edilen geçiş hücreleri. </li><li> Taze Ortodoks ve VPA ile takviye ESC orta her gün hücrelerin yenileyin. ESC benzeri koloniler dox / VPA tedavisi ~ 7 gün sonra ve dox yalnız tedavisinde ~ 10 gün sonra ortaya çıkmaya başlar gerekir. Resim koloniler dox tedavi yokluğunda yer almalıdır. </li><li> Sonra koloniler, iyi tanımlanmış sınır parlak bir refraktif sahip ve 30-50 hücreler içeren, elle 0 20 ul içeren bir U-alt 96 plaka bir jel yükleme pipet ve transferi ile koloniler izole.25% Tripsin-EDTA. Tek hücrelere Trypsinize ve yalnız dox / VPA veya dox içeren 150 ul ESC ortamda düz dipli 96 plaka besleyiciler aktarmak. </li><li> Klonal ESC ortamda besleyiciler üzerinde izole IPSC hatları genişletmeye devam edin. Bunların yanı sıra (post-transdüksiyon gün 23) gün sonra 19 Ortodoks ve VPA çıkarın. Kendini yenileme veya ESC denetimleri benzer proliferasyon oranlarını korumak yok IPSC çizgiler atın. </li></ol> Bu TEC gerçekleştirmeye çalışmadan önce EKH ilişkili olarak IPSC çizgiler karakterize etmek için yararlı olabilir. Biz 1) endojen pluripotency immünsitokimya, 2 belirteçleri (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog)) kromozom sayımı ile karyotip analizi ve 3) embriyoid vücudun oluşumu ifadesi bizim çizgiler karakterize etmiş. Bir de lentiviral özgü RT-qPCR proviral transgenlerin iPSCs ifade olmadığını teyit etmek için yapabilir. Ancak, biz sadece morfoloji, immun ve karyotyp kullanarak tam pluripotent iPSCs belirlediking. Deneylerde, biz genellikle potansiyel anormal karyotip ile birkaç satır pluripotency belirteçler eksprese hatlarının çoğunda ESC benzeri morfolojisi ve büyüme özellikleri sonuçlarına göre IPSC hatları seçimi tespit ederken. 4. Blastosist Enjeksiyon için iPSCs hazırlanması PSC hattı kanal adedi ile bu hat 19 bağlı olabilir, ancak onun pluripotency 18 etkilediği gösterilmiştir. Biz yetişkin tüm IPSC fareler üretmek için pasajlardan 8-14 iPSCs kullandık. <ol><li> Çözülme iPSCs ve ESC orta besleyiciler üzerinde plaka. Passage enjeksiyon kullanmadan önce besleyiciler ile ilgili en az bir kez hücreler. </li><li> % 70-80 oranında konfluent iPSCs ihtiva eden bir 6-plaka arasında iyi bir enjeksiyon için hücrelerin yeterli sayıda daha fazla sağlayacaktır. Büyüme ortamı aspire ve ~ 3 ml 1 x PBS (Ca2 + / Mg2 + içermeyen) her hücreleri yıkayın. </li><li> 0.5 ml önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA ekleyinAra sıra sallanan ile 10 dakika süreyle 37 ° C de ve hücreler inkübe. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için öğütmek. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için ışık mikroskobu ile hücrelerin gözlemleyin. IPSCs koloniler / hücre agrega enjeksiyon pipeti yapışmasına neden olacak gibi tek bir hücre süspansiyonu olması gerekiyor. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu ben elde sonra, kuyu için 1.0 ml ESC medya ekleyin ve 37 ° C inkübatör için plaka döner. ~ 15 dakika inkübe veya besleyiciler çoğunluğu uymak başladı kadar. </li><li> Yavaşça zayıf yapışık besleyiciler çıkarmak için özen iPSCs içeren orta kaldırmak. </li><li> 5 ml ESC ortam ihtiva eden bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içinde iPSCs yerleştirin. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve bir mikropipet ile ES hücre orta kalan çıkarın. 0.2-0.5 ml önceden soğutulmuş FHM ortam içinde pelet ve nazikçe tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak için tüp dokunun. Kadar ve tetraploid b içine enjeksiyon sırasında buz üzerinde saklayın hücrelerilastocysts. </li></ol> 5. Tetraploid Blastosistler Üretimi Bu bölümde yapılan işlemler başka 5,6,20 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Burada BTX Elektro Hücre Manipülatörü ECM 2001 için optimize bizim teknik, anahat. <ol><li> PMS ve HCG emişli 23-28 gün yaşlı dişi farelerde (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) embriyo donör fare ayarlayın. Daha sonra HCG 47 saat arasında 02:00 ve 5 IU PMS 5 IU Yönet. HCG enjeksiyonundan sonra, C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 damızlık erkek ile dişi fareler kurdu. Vajinal fişleri için ertesi gün kontrol edin. </li><li> Ötenazi dişi farelerde takılı ve yumurta kanalları toplamak. Hyaluronidaz ile FHM Fallop borularının yerleştirilmesi ve yavaşça ampulae yırtarak 1 hücreli embriyolar toplayın. Kümülüs kitleler 5-7 dk için FHM / Hyaluronidaz içinde bekletin. </li><li> Bir ağız pipet kullanarak 1-hücreli embriyo toplayın ve KSOM koymadan önce FHM medya damla yoluyla yıkayın-AA kültürü. Kültür 37 ° C&#39;de,% 5 lik bir gecede mineral yağ altında CO 2 ve 2 hücreli embriyolar elektrofüzyon gününde embriyolar seçmek tüm diğer atın. </li><li> 10 cm Petri kabındaki BTX Microslide yerleştirin. Çözüm slayt, ama çok elektrot direkleri tamamen batık değil o batığın kadar oda sıcaklığında elektrofüzyon medya dökün. </li><li> ECM 2001 ve BTX Artırıcı 400 açın. Microslide en elektroduna ECM&#39;nin kabloları bağlayın ve slayt istenmeyen hareketi önlemek için Petri kabı tarafına kabloları sabitleyin. </li><li> BTX arttırıcı bir okuma almak ve uygulanan AC / DC akım gerilim Unutulmaması gereken bir el çarkı çalıştırın. AC akım embriyoların elektrotlar arasında hizalamak hızını kontrol edecek, DC akım blastomer kaynaştırmak, ve darbe zamanı DC darbe uzunluğu ayarlanır. İyi bir başlangıç ​​noktası AC 3V DC 100V, ve zaman 0.05 msn olduğunu. Optimal DC 90-150 volt aralığı içinde değişmektedir. </li&gt; <li> Bir ağız pipet kullanarak, KSOM-AA kültürü 30-40 iki hücreli embriyo sürer ve elektrofüzyon orta birkaç damla ile yıkayın. Ağız pipet içine microslide yemeğin taze elektrofüzyon medya çizin ve yıkama embriyolar alır. Microslide üzerindeki elektrotlar arasında 1 mm boşluk koyun. Onlar boşluğun ortasında aşağı ve birbirleri ile temas halinde olmadığını hizalanmış olduğunu dikkatli olun. </li><li> Manüel darbe düğmesine basarak AC akım uygulayın. Blastomer temas düzlemi elektrotlar paralel olana kadar embriyo, AC alanına dönecektir. Embriyolar birkaç saniye içinde hizalı değilse, AC ayarını artırın. </li><li> Embriyolar hizalı sonra, DC darbe uygulamak için tekrar manuel darbe düğmesine basın. </li><li> Pipet içinde elektrofüzyon orta ile microslide gelen embriyolar toplamak. KSOM-AA birkaç damla yoluyla embriyolar yıkayın ve 37 KSOM-AA kültür koyun ° C,% 5 CO2. Blastomer füzyon shokültür içinde en az 30 dakika içinde tamamlanır uLd. </li><li> Tekrar 2-hücreli embriyo kalan için 7-11 adımları yineleyin. Sonraki füzyon grupların ardından, izlemek ve erimiş blastomer ile embriyolar seçin. Başarıyla erimiş embriyolar 1-hücreli aşamasında olduğu görünecektir. Kültür içinde 30 dakika sonra lize ve 2 hücreli embriyolar atın. Füzyon oranının altında% 80 ise, 5V ve 0.01 msn artışlarla gerilimi ve / veya süresini artırın. Lizis% 20 üstünde ise, DC gerilim ve / veya zaman buna göre azalır. Bizim deneylerde optimum ayarları AC 4V, DC 146V ve 0.07 msn idi. Bu ayarlar sürekli% 90 veya az veya hiç lizis ile yüksek füzyon oranı vermiştir. </li><li> 37 mineral yağ altında KSOM-AA microdrops kültür sigortalı embriyolar ° C,% 5 CO 2 ile devam edin. Sen inkübasyondan 48 saat sonra tetraploid (4n) blastokist oluşturmak için erimiş embriyoların% 85-95 beklemesin. </li></ol> 6. Tetraploid Blastosistler içine iPSCs Mikroenjeksiyon Biz Nikon TE-2000U kullanımıinverted mikroskop blastosist enjeksiyon için DIC optik ve Narishige mikromanipülatörler ile donatılmıştır. Her tetraploid blastosist önceki vallahi yayında 5,20,21 ortaya konmuştur fare blastokist içine ESC enjeksiyon için bir standart protokolü kullanarak 10-12 iPSCs ile enjekte edilir <ol><li> Konkav bir mikroskop slaydı merkezinde FHM bir 20 ul düşüş yerleştirin ve mineral yağ, 150 ul ile kapağı. </li><li> FHM damla içine tutarak pipet ve mikroenjeksiyon iğne indirin. Hem iğneler için 2-3 dk kısmen FHM ile dolmasını sağlayın. </li><li> FHM ve mikroskop lamı üzerine FHM damla transfer damla yoluyla 20-30 tetraploid blastokist yıkayın. </li><li> Damla içine Ağız pipet IPSC karışımı. Bu, hücre ya da çok konsantre toplanır önceden eğer FHM bir damla hücre karışımı seyreltik için gerekli olabilir. </li><li> Enjeksiyon iğnesi ile 100-200 hücre seçin. </li><li> Saat 9 varsaymak içinde iç hücre kütlesi ile blastosist tutuniyon. Saat 3 hizasında zona pellucida ve trofoblast nüfuz ederek blastocoel içine hücreleri enjekte. Blastosist başına 16-18 hücreleri enjekte edilir. </li><li> KSOM-AA kültürüne IPSC tamamlanmaktadır blastokist dönün. </li></ol> 7. Alıcı Mice Uterus Kornalar içine tamamlanmaktadır Tetraploid blastokist transferi Tamamlanmaktadır tetraploid blastokist cerrahi kısaca özetlemek olacaktır standart tekniği 20 kullanılarak, araştırmacının enstitü kurallarına göre dişi alıcı farelerin rahim boynuzları aktarılır. Pro-östrus aşamada dişi CD-1 fare seçin ve Vasektomi erkek ile çiftleşme için onları kurmak. Ertesi sabah vajinal fişleri kontrol edin. Dişiler fişi (2.5 DPC) tespit edildikten iki gün sonra uterin embriyo transferi için hazırız. Alıcının kadın Vasektomi erkek ile evlendirilen önce bir gün, olmayan Vasektomi erkek ile ek CD-1 kadın kurmaksezaryen tarafından alınan tüm-IPSC fareler için koruyucu anne olarak kullanılır. 8. IPSC türetilmiş Pups arasında Sezaryen ve Hızlandırılması Implantasyon sonrası birden rezorpsiyonlarının TC embriyo transferi genellikle sonuçları, IPSC veya ESC hattı yüksek gelişim potansiyeline sahip olsa bile. Sonuç olarak, bir alıcı için fazla 4 uygun yavrusu (genellikle 1-2) beklenebilir. Bu küçük yavrular genellikle alıcılar tarafından ihmal edilir. Yenidoğan bakım düzeyi ve hayatta kalma oranını arttırmak için, sezaryen gerçekleştirmek ve standart protokoller 20 göre teşvik. Sezeryan gerçekleştirmek için, 7-08:00 (alıcı 18.5 DPC), 16 gün embriyo transferi sonrası alıcı fareler ötenazi ve rahim boynuzları gelen yavrular teşrih. CD-1 annelere teslim ibrelerin aynı gün canlı yavrular Foster.

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
<li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li>
<li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li>
<li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

TEC yöntemleri kullanılarak IPSC hatları oluşturma farelerin bir IPSC hattının pluripotency için sıkı bir fonksiyonel test sağlar. Bu deney yöntemleri farklı yeniden programlama göreli etkinliğini değerlendirmek için in vitro olarak belirli hücre tipleri üretmek için en yararlı olabilir IPSC hatları belirlemek için yararlı olabilir. IPSCs elde edilen Fareler sıkı bir şekilde uzun süreli kararlılık ve IPSC-türevi dokuların tümör gelişimini test etmek için de kullanılabilir. Bu protokol, tam pluripotent IPSC çizgileri veya IPSC fareler oluşturmak için ya da yeniden programlama farklı yöntemler göreceli yarar karşılaştırmak isteyen araştırmacı için yararlı olacaktır. Tam pluripotent iPSCs üretimi ve kimlik kontrol mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır ve bazı IPSC hatları bu yöntemi kullanarak TEC test geçmek olmaz üretilen mümkündür kalır. Birçok faktör genetik kökenden, lentiviral titresi, lentiviral i modellerini içeren deneyler arasında değişebilirnsertion, donör nüfusun hücre döngüsü parametreleri, TEC prosedürün çeşitli adımlar ve iPSCs değişken eğilimleri de laboratuvarlar arası farklılıklar genetik veya epigenetik sapmaları beslememiz. Iyi başarı sağlamak için, her virüs yeterince saptanabilen gen ekspresyonu en az% 80 ve ideal olarak% 100 üretmek için konsantre olmasını sağlamak için kontrol MEFS viral dilüsyonları sınayarak IPSC derivasyon deneylerde lentiviral gen ifadesinin uygun düzeylerde kurmaya özen MEFS. Bu MEFS toksisite sınırlayıcı ve kuyular kalabalık olmadan kolonileri üretirken bize farklı lentiviruses birden fazla kopyası olan satırları tanımlamak için izin verir. Birden diğer protokolleri tam pluripotency giden çoklu yolların 1,8-13,15 var olabileceğini düşündüren birden çok yöntem ve donör hücre kaynakları kullanılarak, gelişim potansiyeli olan iPSCs üretmek için gösterilmiştir unutulmamalıdır. Şu anda, ancak, herhangi bir kesin biyolojik tam pluripotent IPSCtanımlanan ve bu nedenle TEC analizinin IPSC doğrultusunda bir organizmadaki tüm hücre soylarının üretebilir olsun altın standart test kalır.

<table><tbody><tr><td>DMEM (yüksek glukoz)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ES hücreleri için uygun FBS</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>%0,1 Jelatin</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Temel Olmayan Amino Asitler</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (murine LIF)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Valproik Asit</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>%0,25 Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ücretsiz</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Süperovülasyon için gebe kısrak serum gonadotropini, liyofilize, 2.000 IU</td><td>Harbor-UCLA Araştırma Enstitüsü</td><td>Metin sağlanmadığı için çeviri yapılamamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni giriniz.</td><td></td></tr><tr><td>İnsan koryonik gonadotropini</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Hiyalüronidaz içeren FHM besiyeri</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-1/2 AA medyumu</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo transferi için su, test edilmiş embriyo</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağı, embriyo testli</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA), embriyo testli</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Işınlanmamış fare embriyonik fibroblastları</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;Lütfen çevrilecek içeriği sağlayın.&quot;&gt;&lt;güçlü&gt;Bu protokolde kullanılan besiyerleri ve tamponlar&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Lütfen çevirmek istediğiniz kaynak metni (jove_content) sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm profesyonel akademik standartlara ve teknik kriterlere uygun olarak İngilizce'den Türkçe'ye çevireceğim.&quot;&gt;HEK293T büyüme ortamı. %90 DMEM, %10 FBS, 100 U/ml penisilin ve 10 mg/ml streptomisin. Transfeksiyon gününde kullanılan HEK ortamından penisilin ve streptomisini çıkarın. HEK ortamı 4°C'de saklanabilir. &amp;deg;1 aya kadar C'de.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm bilimsel standartlara ve çeviri yönergelerine sadık kalarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM Dekstroz. pH değeri 7,1 +/- 0,1'e ayarlanır. pH kritiktir! Steril filtreleyin ve 4°C'de saklayın. &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Lütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm profesyonel çeviri kriterlerine (akademik dil, bilimsel terminolojiye sadakat ve doğal Türkçe bilimsel yazım standartları) uygun olarak çeviriyi gerçekleştireceğim.&quot;&gt;Fare embriyonik fibroblast (MEF) büyüme medyumu (besleyici hücrelerle kullanım için de uygundur). %70 DMEM, %20 Medium 199, %10 FBS, 100 U/ml penisilin ve 10 mg/ml streptomisin. 4°C'de saklayın. &amp;deg;1 aya kadar C'de.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Lütfen çevrilecek İngilizce kaynak metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirttiğiniz profesyonel bilimsel standartlara ve akademik Türkçe diline uygun olarak çevirisini gerçekleştireceğim.&quot;&gt;ESC büyüme ortamı. %85 DMEM, %15 ES hücresi onaylı FBS, 1x Glutamax, 0,1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 0,1 mM &amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol, 1.000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penisilin ve 10 mg/ml streptomisin. ESC medyumu 4°C'de saklanabilir &amp;deg;üç haftaya kadar C'de.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Lütfen çevrilecek içeriği sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara, teknik terminolojiye ve bilimsel yazım kurallarına sadık kalarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.&quot;&gt;Elektrofüzyon besiyeri. 0,3 M Mannitol, 0,1 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ve embriyo testli suda %3 BSA. 4°C'de saklayın. &amp;deg;3 aya kadar C'de.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

İsteyerek pluripotent kök hücrelerinin elde edilen fare Üretimi

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Somatik hücrelerden indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi temel araştırma için değerli araçlar oluşturmak için bir araç sağlar ve aynı zamanda rejeneratif tedaviler için hasta eşleşen hücreleri kaynağı üretebilir. iPSCs çoklu protokolleri kullanılarak oluşturulan ve birden çok hücre kaynaklardan elde edilebilir. Bir kere üretilen iPSCs pluripotency belirteçleri için immun, embriyoid organları ve teratomlar, embriyonik kök hücreler (EKH) ve germline katkısı 2 olan veya olmayan kimerik fare üretimi ile gen ekspresyon karşılaştırmalar üç germ yaprağının üretimi de dahil olmak üzere testler çeşitli kullanılarak test edilmiştir . Önemlisi, bu testleri geçmek IPSC hatları hala farklı farklılaşmış hücre tipleri 2 üretme kapasitesi değişir. Bu zor IPSC derivasyon protokolleri, donör hücre kaynakları veya seçimi yöntemleri farklı uygulamalar için en yararlı olan kurmak için yaptı. En sıkı testBir kök hücre hattı, bir organizmanın yaşamını sürdürmesi için gerekli tüm dokularda oluşturmak için yeterli gelişim potansiyeline sahip olup olmadığı (adlandırılır tam pluripotency) tetraploid embriyo tamamlayamamakta (TEC) 3-5 olduğunu. Teknik olarak, TEC blastosit 6, in vitro olarak yetiştirilebilir tetraploid (4n) tek-hücreli embriyo oluşturmak için iki hücreli embriyoların elektrofüzyon içerir. Diploid (2n) pluripotent kök hücreler (örn EKH veya iPSCs) ardından tetraploid blastokist blastocoel boşluğuna enjekte ve (bkz. Şekil 1) gebelik için bir alıcı kadın aktarılır. Diploid hücreler enjekte kök hücre hattı tamamen türetilmiş bir fetüs sonuçlanan, embriyonun düzgün teşkil ise tamamlanmaktadır embriyonun tetraploid bileşeni, extraembryonic dokular (plasenta, yolk kesesi) neredeyse sadece katkıda bulunur. Son zamanlarda, biz tekrarlanabilir erişkin farelerde üreten IPSC hatlarının türetme bildirdiTEC 1 ile. Bu IPSC hatları EKH 3,4,7 karşılaştırılabilir ve çoğu diğer IPSC hatları 8-12 rapor daha yüksektir 5-13%, verimlilikleri ile canlı yavru doğurur. Bu raporlar doğrudan reprogramming TEC testlerinde yavrular üretme gelişim potansiyeli ve verimliliği EKH neticesinde tamamen pluripotent iPSCs üretebilir olduğunu göstermektedir. Şu anda, tam pluripotent iPSCs ve daha az güçlü hatları 13-15 arasında ayıran ne olduğu açık değildir. Ne de yeniden programlama yöntemleri yüksek verimlilik ile bu satırları üretecek ortadadır. Burada IPSC hatları pluripotency karşılaştırmak veya farklı reprogramming yöntemleri denklik kurmak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir tam pluripotent iPSCs ve &quot;all-IPSC&quot; fareler, üreten bir metot tanımlamıştır.

3. adım olan "MEF'lerden iPSC türetilmesi" aşamasında, doksisiklin/VPA eklemesinden 4-5 gün sonra morfolojik heterojenlik ve immatür iPSC koloni oluşumu, 7-10 gün arasında ise matür koloniler gözlemlenmelidir (Şekil 2). 5. adımdaki tek hücreli tetraploid embriyoların üretimi oldukça verimlidir (Şekil 3). İşlem görmüş iki hücreli embriyoların %95'ine kadarının başarıyla birleşerek tetraploid tek hücreli embriyolar oluşturduğunu rutin olarak gözlemliyoruz. iPSC'lerin tetraploid blastokistlere enjekte edilmesi için izlenen protokol (6. Adım, Şekil 4), kimera fareler üretmek için ESC'lerin diploid blastokistlere enjekte edilmesi protokolüne benzerdir ve deneyimli bir mikroenjeksiyon uzmanı tarafından gerçekleştirilebilir. Doğan canlı yavru sayısı kullanılan hücre hattına bağlıdır (Tablo 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">MEF ön-programlama verimliliği 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">TEC ile iPSC fare üretim verimliliği</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>İsim</td>
			<td>Açıklama</td>
			<td>Enjekte edilen blastokistler</td>
			<td>Canlı Yenidoğan</td>
			<td>Canlı Erişkin</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Temsili Sonuçlar.
<img alt="Tetraploid blastokist komplementasyon diyagramı; diploid, E13 embriyolardan iPSC fare oluşturulması." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. Deneysel tasarım şeması. Sol üst: Tetraploid blastokistlerin üretimi. Albino farelerden elde edilen döllenmiş iki hücreli embriyolar, tetraploid tek hücreli embriyolar oluşturmak için elektrofüzyona tabi tutulur ve bunlar blastokist aşamasına kadar in vitro kültüre edilir. Sol alt: Yeniden programlama. Fare embriyonik fibroblastları; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc ve ters tetrasiklin transaktive edici protein rtTAM2.2'yi kodlayan lentiviral partiküllerle transdüse edilir. Doksisiklin ilavesi, transgen ekspresyonuna ve iPSC'lere yeniden programlamanın başlamasına yol açar. Sağ: iPSC farelerin üretimi. Pigmente farelerden türetilen iPSC'ler, tetraploid blastokistlerin blastosel kısmına enjekte edilir ve ardından cerrahi olarak yalancı gebeliğe sahip alıcı farelere implante edilir. Yeni doğan iPSC fareler sezaryen ile alınır ve başka fareler tarafından büyütülür (çapraz emzirme). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Şeklin daha büyük halini görmek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="Hücre yeniden programlama süreci; mikroskopi görüntüleri; 10x, 20x büyütmede MEF'lerin iPSC'lere dönüşümü." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. Yeniden programlama ile ilişkili morfolojik değişiklikler. Soldan sağa: Bir yeniden programlama deneyi sırasında fibroblastlardan iPSC kolonilerine morfolojik ilerlemenin örnekleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="Embriyo gelişim evreleri: 2-hücreli (2n), blastomer füzyonu, 1-hücreli (4n); mikroskopi görüntüleri." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. Tetraploid embriyoların üretimi. Diploid iki hücreli embriyolara, blastomer füzyonu ve tek hücreli tetraploid embriyoların oluşumuyla sonuçlanan bir elektrik darbesi uygulanır.
<img alt="Blastokiste iPSC enjeksiyonu, iPSC yeni doğan ve 3 haftalık fare ile sonuçlanmıştır; hücre çalışma sonuçları." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 4"> 
Şekil 4. iPSC farelerin üretimi. Sol: iPSC'ler tetraploid bir blastokistin blastosel boşluğuna enjekte edilir. Orta: Yeni doğan iPSC fareler, pigmente gözleri ile ayırt edilir. Sağ: Doğumdan üç hafta sonraki iPSC fare.

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol tanımlamak<sup&gt; 1</sup&gt;.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Somatik hücrelerdenle indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSCler) üretimi, temel araştırmalar için değerli araçlar oluşturmanın bir yolunu sunar ve ayrıca...

Bu prosedürün genel amacı, tetraploid embriyo komplementasyonu yoluylalele indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) yetişkin fareler üretmektir. Bu işlem, öncelikle OCT four, SOX two, KLA four ve cmic taşıyan lentivirüsler kullanılarak fare embriyonik fibroblastlarından iPSC'ler elde edilip medyumun valproik asit (VPA) ile desteklenmesiyle gerçekleştirilir.iPSC'ler oluşturulduktan sonra, immün boyama, kromozom sayımı ve embriyo gövdesi oluşumu ile karakterize edilirler. Bir sonraki adım, füzyon ve in vitro kültür yoluyla alıcı tetraploid blastosistler üretmektir. Ardından, iPSC'ler tetraploid blastosistlere enjekte edilir ve tamamlanmış blastosistler, gestasyon için alıcı dişilere transfer edilir.Son aşamada, tam dönem hayvanlar sezaryenle alınarak taşıyıcı annelere aktarılır. Böylece doğum sonrası gelişim izlenebilir. Nihayetinde, canlı tam dönem hayvanların üretilip üretilmediği belirlenir.Söz konusu IPSC hattının tam plüripotent olduğu kabul edilmektedir. Bu tekniğin, iPSC oluşturmaya yönelik diğer yöntemlere göre temel avantajı, yöntemimizin tekrarlanabilir şekilde tam plüripotent IPS hücre hatları oluşturmasıdır. Bu yöntemlerle üretilen IPS hücre hatları, kendi IPS hücrelerinin plüripotensini karşılaştırmak veya diğer yeniden programlama yöntemlerinin eşdeğerliğini belirlemek isteyen diğer araştırmacılar için faydalı olabilir. Bu yöntemler, in vitro diferansiyasyon analizleri gibi spesifik alt uygulamalar için tam plüripotent IPS hücre hatları oluşturmak isteyen araştırmacılar için yararlı olacaktır.Dahası, tüm iPSC farelerinin üretimi gerçekleştirilmiştir. Telo komplementasyonun kullanımı, çeşitli hücre hatlarının genetik ve epigenetik stabilitesini belirlemek için yararlı bir araç olabilir. Tetraploid embriyo komplementasyonunda yer alan mikro manipülasyonlar teknik olarak zorlayıcıdır.Bir kişinin iPSC tarafından geliştirilen tekniklerde yetkin hale gelmesi birkaç ay sürebilir; bu teknik, geleneksel ESC gen hedefleme deneylerinde kullanılanlara benzer kültür koşulları gerektirir. HEC 2 9 3 T hücrelerinin lentivirüs ile transfeksiyondan 24 saat sonra, büyüme besiyerini uzaklaştırın ve yerine 25 mililitre taze, önceden ısıtılmış besiyeri ekleyin.Transfekte edilmiş hücreleri ortamıyla birlikte 24 saatliğine inkübatöre geri koyun; HEC 2 9 3 T hücrelerinin lentivirüs ile transfeksiyonundan 48 saat sonra, transfekte hücrelerden lentiviral partiküller içeren büyüme ortamını toplayın. Virüs içeren ortamdaki partikül kalıntılarını, 4 °C'de, 3000 Gs hızında beş dakika santrifüj ederek uzaklaştırın. Ardından, virüsü 4 °C'de, 112, 000 Gs hızında iki saat boyunca %20 sükroz yastığı üzerinden ultrasantrifüj ile konsantre edin.Viral peletini bozmadan, sıvıyı dekontaminasyon için dikkatlice bir atık kabına boşaltın. Viral peletini 0.4 milliliters fare embriyonik fibroblast ortamında yeniden süspanse edin ve tüpü kapatın. Ardından, tüpü dört degrees Celsius'ta 15 ila 30 dakika boyunca hafifçe sallayın.Viral partikülleri ve tek kullanımlık alikotları -80 °C'de saklayın. iPSC hatları, fare embriyonik fibroblastlarından veya MET hücrelerinden türetilmiştir. iPSC kolonileri parlak, kırınım özellikli, belirgin bir sınıra sahip olduğunda ve 30 ila 50 hücre içerdiğinde, manuel olarak seçilmeye ve bağımsız iPSC hatları olarak genişletilmeye hazır hale gelirler.Tekil kolonileri bir jel yükleme pipet ucuyla seçin ve her koloniyi, 20 µL %0,25 trypsin EDTA içeren U tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna doğrudan aktarın; seçilen kolonileri ve tripsini yaklaşık sekiz dakika boyunca 37 °C'de veya koloniler tek hücrelere ayrılana kadar inkübe edin. Ayrışma sürecini ışık mikroskobu ile izleyin. Hafif ajitasyon gerekebilir.Dissosiye hücre süspansiyonunu, bir besleyici tabaka ve doksisiklin ile VPA ile desteklenmiş 150 µL ESC ortamı içeren bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Her kuyucukta iPSC kolonileri yeniden ortaya çıktığında, tetraploid blastosis yardımlı tek hücreli embriyolar oluşturma prosedürünü başlatmak için standart ESC türetme ve hücre kültürü prosedürlerini kullanarak analiz ve hücre bankalaması amacıyla daha büyük kuyucuklara bölün. Dişi farelerden toplanan tek hücreli embriyolar, 37 °C'de, %5 CO2 içeren KSOM ortamında gece boyunca iki hücreli embriyolara kadar kültüre edilir. Ertesi gün, 10 cm'lik bir Petri kabına bir BTX mikro slayt yerleştirin.Slaytı çözelti içinde bırakacak kadar ancak elektrot kutuplarının tamamen suya gömülmeyeceği miktarda oda sıcaklığında elektrofüzyon besiyeri dökün. BTX elektro hücre manipülatörü ECM 2001 ve BTX enhancer 400 cihazlarını açın. ECM kablolarını mikro slayt elektroduna bağlayın ve slaytın istenmeyen hareketlerini önlemek için kabloları petri kabının kenarına sabitleyin.BTX güçlendirici üzerinden bir okuma yapmak için tek bir manuel pals uygulayın ve uygulanan DC akımlarının voltajını not edin. AC akımı, embriyoların elektrotlar arasında hizalanma hızını kontrol edecektir. DC akımı blastomerleri füzyona uğratacak ve pals süresi DC palsinin uzunluğunu belirleyecektir.İyi bir başlangıç noktası AC üç volt, DC 100 volt ve 0,05 milisaniye süredir. Optimal DC, 90 ila 150 volt aralığında değişir. Ağız pipeti kullanılarak.KSOM kültüründen 30 ila 42 hücreli embriyoları alın ve bunları bir damla elektrofüzyon ortamına transfer edin. Birkaç damla elektrofüzyon ortamı üzerinden geçirerek yıkayın. Ardından, mikro slayt kabındaki taze elektrofüzyon ortamını ağız pipetiyle çekin.Yıkanmış embriyoları alın ve mikro slayt üzerindeki elektrotlar arasındaki bir milimetrelik boşluğa yerleştirin. Embriyoların boşluğun ortasında hizalandığından ve birbirleriyle temas etmediklerinden emin olun. Manuel başlatma düğmesine basarak AC akım uygulayın.Embriyolar, blastomer temas düzlemi elektrotlara paralel olana kadar AC alanında dönecektir. Eğer embriyolar birkaç saniye içinde hizalanmazsa, AC ayarını artırın. Embriyolar hizalandıktan sonra, pipetteki elektrofüzyon ortamı ile DC palsini uygulamak için manuel başlatma düğmesine tekrar basın.Embriyoları mikro lamdan toplayın, birkaç damla KSOM medyumu aracılığıyla yıkayın ve ardından embriyoları mineral yağı altında, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında KSOM içinde kültüre edin. Blastomer füzyonu 30 dakikadan kısa sürede tamamlanmalıdır. Kültür sırasında, blastomerleri başarıyla kaynaşmış embriyoları izleyin ve seçin.Füzyon geçirmiş embriyolar tek hücreli aşamada görünecektir; liz olmuş ve iki hücreli embriyoları kültüre alındıktan 30 dakika sonra ayıklayın, füzyon geçirmiş embriyoları mineral yağı altında, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren KSOM mikro damlacıklarda kültüre etmeye devam edin. Blast enjeksiyonu için IPC'leri hazırlamak amacıyla, daha önce bankalanmış IPC'leri çözün ve ESC ortamındaki feeder hücreler üzerine ekleyin; hücreleri feeder üzerinde en az bir kez pasajlayın. Enjeksiyon için kullanmadan önce çözme işlemini gerçekleştirin.%70 ila %80 konfluense ulaşmış IPC'ler içeren altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğu, enjeksiyon için fazlasıyla yeterli hücre sağlayacaktır; büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri 3 ml kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Hücrelere önceden ısıtılmış 0,5 ml %0,05 tripsin EDTA ekleyin ve ara ara sallayarak 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. 3,0 ml ESC ortamı ekleyin ve tek hücre süspansiyonu elde etmek için tekrarlayın. Tek hücre süspansiyonundan emin olmak için hücreleri ışık mikroskobuyla inceleyin; koloniler veya hücre agregatları enjeksiyon pipetini tıkayacaktır. Tek hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, kuyucuğa 1 ml ESC ortamı ekleyin ve plakayı 37 °C'deki inkübatöre geri yerleştirin.Yaklaşık 15 dakika veya feeder hücrelerin çoğunluğu yapışmaya başlayana kadar inkübe edin, ardından IPC'leri içeren medyumu nazikçe uzaklaştırın. Bu sırada, yeni yapışmış olan feeder hücrelerini yerinden oynatmamaya dikkat edin. IPC'leri, beş mililitre ESC medyumu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve 200 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı aspire edin ve ESC ortamının geri kalanını bir mikro pipet ile uzaklaştırın. Pelleti yerinden oynatmak için tüpü hafifçe vurun ve hücreleri 0,2 ile 0,5 mililitre önceden soğutulmuş FHM ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri, tetraploid blastokistlere enjekte edilene kadar ve enjeksiyon sırasında buz üzerinde saklayın. Blastokist enjeksiyon protokolü için lütfen bu makaleye eşlik eden metne ve bir kısmı burada ekranda gösterilen, daha önce yayınlanmış bir JoVE makalesine başvurun.Bir yeniden programlama deneyi sürecinde, fibroblasttan iPSC kolonilerine doğru gerçekleşen morfolojik ilerlemenin örnekleri bu görüntülerde gösterilmektedir. Morfolojik heterojenlik ve kısmen yeniden programlanmış iPSC kolonisi oluşumu, B ile EESC panellerinde gösterildiği gibi, doksisiklin VPA eklenmesinden dört ila beş gün sonra itibaren gözlemlenmelidir. Panel F'de gösterildiği gibi, iPSC kolonileri yedi ila 10 gün arasında ortaya çıkmalıdır. Diploid iki hücreli embriyoların elektrofüzyonu ile tek hücreli telomerik embriyoların üretimi oldukça verimlidir.İşlem görmüş iki hücreli embriyoların %95'ine kadarının başarılı bir şekilde kaynaştırılarak tetraploid tek hücreli embriyolar oluşturduğunun gözlemlenmesi rutin bir durumdur. Bu deneyde iPSC'lerin tetraploid blastositlere enjekte edilmesi için kullanılan protokol, diploid kimera oluşumunu kolayca dışlamak amacıyla diploid blastositlere ES hücrelerinin enjekte edilerek kimera farelerin üretildiği protokole benzerdir; iPSC'ler ve tetraploid embriyoları üretmek için kullanılan fare suşlarının pigmentasyonu, mümkün olduğunca dikkatle seçilir. Bu örnekte, tetraploid embriyolar albino bir suştan üretilmiş ve iPSC'ler pigmente bir suştan oluşturulmuştur.Böylece, yeni doğan IPSC fareleri pigmente gözler ve yetişkinlikte tek tip pigmente bir tüy rengi sergilerken, diploid kyras karışık albino ve pigmente renklendirme sergileyecektir. Doğan canlı yavruların sayısı, bu tabloda gösterildiği gibi hücre hattına bağlıdır. Ortalama iyi bir IPSC hattı için deneyciler, enjekte edilen blastosistlerin %1 ile %10 arasının canlı yeni doğan yavrular vermesini beklemelidir.Bu videoyu izledikten sonra, tamamen pluripotent iPS hücrelerinin nasıl türetileceği ve gelişimsel potansiyellerinin nasıl doğrulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Tetraploid komplementasyon deneyi kullanılarak, MES türetiminden yeni doğan iPSC'ye kadar olan bu tekniğe hakim olunduğunda, fareler iki ila üç ay içinde tamamlanabilir. iPS hücrelerinin geliştirilmesi ve sürdürülmesi, yüksek düzeyde hücre kültürü tekniği gerektirir.ESL kültürü ile ilgili ön deneyim esastır. Lentivirüsle çalışmayı, özellikle de konsantre lentivirüsün son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Kişi, her zaman kurumunuz tarafından zorunlu kılınan kişisel koruyucu ekipmanları giymeli ve bu prosedürün ardından virüsle temas etmiş her şeyi en az 20 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyu ile tedavi ettiğinden emin olmalıdır.Tüm IPSC fareleri ve dokuları fizyolojik, patolojik ve davranışsal fenotipler açısından analiz edilebilir.

generation-of-mice-derived-from-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

Öğrenin, tetraploid embriyo tamamlama yöntemiyle indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden yetişkin fare üretimini. Bu protokol, iPSC hatlarının tam pluripotensini doğrulamak için kullanılır.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Daha fazla video keşfet