Mastitis Fare Model olarak LPS Intradüktal Enjeksiyon: Sinyal bir NF-KB Reporter Transgenik aracılığı ile görsel

Burada açıklanan lipopolisakkarid meme iltihabı simüle etmek için meme, genellikle bakteriyel enfeksiyon tarafından neden olduğu bir durum ile laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir tekniktir. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, içinde lipopolisakkarit enjeksiyonu sonuçlarını bir NF-KB lusiferaz muhabiri fare bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi.

Bu prosedürün genel amacı, meme bezinin mastitini veya iltihabını incelemek ve daha spesifik olarak iltihaplı bir emzirme bezi içindeki NF Kary aktivitesini görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, önce bir dişi NF Kappa b muhabiri transgenik olarak vahşi tip bir erkekle geçerek gerçekleştirilir. Yavruların doğumundan sekiz gün sonra, lipopolisakkarit, enjeksiyondan altı saat sonra enjeksiyon bölgesindeki tüm yaralara zarar vermeyen bir giriş enjeksiyon tekniği ile dişinin emzirme bezine verilir.

Fare, meme bezi içindeki lusiferaz aktivitesini tespit etmek için biyolüminesan görüntülemeye tabi tutulur. Sonuç olarak, sonuçlar, İntraduktal enjeksiyon yönteminin kullanılması ve ardından biyolüminesan görüntüleme yoluyla LPS ile tedavi edilen bezlerde önemli NF KB aktivitesi gösterebilir. Yaklaşımımızın diğer intraduktal enjeksiyon yöntemlerine göre en büyük avantajı, enjeksiyon bölgesinin herhangi bir şekilde zarar görmemesidir.

LPS enjeksiyonu ile ilişkili iltihabı incelemeyi planlıyorsanız, bu kesinlikle kritiktir, çünkü bölgeye veya meme ucuna herhangi bir hasar bu analizleri üst üste bindirir ve karıştırır. Bu prosedür için NGL Reporter transgeni için pozitif olan dişi fareler kullanılır. Bir. Dişiler en az altı haftalıktır.

Onları çiftleşmeden 15 gün sonra har ve üreme yoluyla FVB vahşi tip bir erkekle çiftleştirin. Dişileri hamilelik belirtileri, yani büyük çıkıntılı çevresi açısından düzenli olarak kontrol etmeye başlayın. Hamile dişileri kendi kafeslerine ayırın ve son dişi hamile kaldığında erkeği üreme kafesinden çıkarın.

Yeterli laktasyon için en az altı yavru yavru gereklidir. Böyle bir çöpün doğumundan sekiz gün sonra. Protokol ile devam edin.

Prosedürün en zorlu kısmı, giriş enjeksiyonunun kendisidir. Sabit ellere ve çok fazla pratiğe sahip olmak yardımcı olacaktır, ancak tuzaklar her zaman ortaya çıkabilir. Başarıyı sağlamak için enjeksiyon gününde birden fazla farenin hazır olmasına hazır olun.

E coli'den türetilmiş lipopolisakkariti PBS'de mikrolitre başına 0.1 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyrelterek başlayın. Bu LPS çözeltisinin 50 mikrolitresi meme bezine enjekte edilecektir. Kontrol enjeksiyonu için kullanılmak üzere tek başına ikinci bir PBS tüpü hazırlayın.

Diseksiyon kapsamının aşamasının yanında. Anestezi vermek için bir burun konisi aparatını sabitleyin. Gerektiğinde ekstra spot ışıkları kullanarak sahnenin parlak aydınlatmasını hazırlayın.

Diseksiyon kurulumu hazır olduğunda, flor makinesini ve hava akışını başlatın. Daha sonra 31 gauge insülin şırıngasını 50 mikrolitre LPS solüsyonu ile yükleyin ve şırıngayı pratik enjeksiyonlar için bir kenara koyun. Sonuçları görselleştirmek için PBS'de seyreltilmiş triam mavisi boya kullanın.

Ardından, solunumu yavaşladığında enjekte edilecek fareyi uyuşturun. Sahneye yerleştirin ve burun konisi yoluyla iso flor sağlayın. Prosedür boyunca tamamen anestezi uygulandığını doğrulamak için bir çimdikleme kullanın.

Farenin nefes alma düzenini izleyin. Sabit tutmak için flor izini sürekli olarak ayarlayın. Hayvanın ventral karnındaki kılları düzleştirmek ve meme uçlarını bulmak için küçük bir damla% 70 etanol kullanın.

Baskın olmayan elinde ince forseps ile alt karın bölgesinde sağ dört numaralı kasık meme bezinin meme ucunu bulun. Meme ucunu dikkatlice deriden uzaklaştırın. Forseps asla sıkıca sıkıştırılmamalıdır.

Baskın elde meme ucuna sadece hafif bir tutuş uygulanmalıdır. Önceden yüklenmiş şırıngayı görüş alanına getirin ve içeriğini enjekte etmek için yeniden konumlandırmaya gerek kalmayacak şekilde tutun. İğneyi dikkatlice meme ucunun ortasındaki küçük sünek açıklığa doğrultun.

İğnenin yaklaşık dörtte birini yeniden konumlandırmadan kanala sokun. Şırınganın içeriğini üç ila beş saniye boyunca enjekte edin. Ardından iğneyi meme ucundan dikkatlice çıkarın.

50 mikro PBS salınımlı ikinci bir şırınga yükleyin ve soldaki işlemi tekrarlayın. Dört numara, PBS kontrolünü kullanarak kasık meme bezi meme başı. Her iki enjeksiyon da tamamlandıktan sonra anesteziyi durdurun ve fareyi bir kurtarma kafesine taşıyın.

Dişi beş dakika içinde hareket etmelidir. Bir saat sonra, onu puflarıyla birlikte bir ev kafesine geri koyun. Fare altı saatlik enjeksiyonla görüntülenmelidir.

Bu süre zarfında, sıkıntı belirtileri görülürse fareyi izleyin. Deneyi durdurun ve fareleri görüntüleme tesisinde ötenazi yapın. Dişi flor kullanarak uyuşturmaya hazırlanın.

Anestezinin hem kutuya hem de görüntüleme odasına aktığından emin olun. Fareyi şeffaf anestezi kutusuna flor anestezisi altına yerleştirin. Solunum yavaşladığında, farenin tamamen uyuşturulduğunu doğrulamak için bir çimdikleme kullanın.

Daha sonraki retroorbital, 26 gauge iğneden 100 mikrolitre Lucifer substratı enjekte edin. Enjeksiyondan sonra fareyi hemen görüntüleme odasına aktarın ve Isof Lorraine'i veren burun konisini takın. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve her ayağınızı siyah opak bantla sahneye sabitleyin.

Hem beyaz ışıkta fotoğrafik bir görüntü hem de biyolüminesan aktivitenin bir görüntüsünü almak için IVIS yazılımına uygun ayarları girin. Görüntüler elde edildikten sonra pozlama süresi 10 saniye olmalıdır. Enjeksiyon sonrası için tarif edilenle aynı kurtarma protokolünü izleyin.

Fotoğrafik ve ışıldayan görüntüler otomatik olarak üst üste bindirilir ve ekranda görüntülenir. Farenin alt karnının her iki tarafına eşit büyüklükte ilgi alanı veya ROI daireleri yerleştirerek elde edilen görüntüleri analiz edin. Biri PBS enjekte edilen bezin üzerinde ve diğeri LPS enjekte edilen bezin üzerinde.

Okumayı fotonlar olarak ayarlayın. Her ROI'de tespit edilen lüminesansı gösteren bir sayı görüntülenmelidir, optimum görüntüyü görüntülemek için bu sayıyı istatistiksel analizde kullanın. Görüntülenen sinyalin eşiğini daha fazla ayarlayın.

Bu, toplam lüminesans okumasını değiştirmeyecek, ancak PBS enjekte edilen bez arka plan sinyalinden arındığında arka plan sinyalinin kaldırılmasına izin verecektir. LPS ile tedavi edilen bezdeki artmış sinyal, görüntü uygulamasında belirgin olmalıdır: Enjeksiyonlar, daha az süt üretiminin olduğu laktasyonun 21. gününde gerçekleştirildi ve bir enjeksiyonun başarısı, başarılı bir şekilde enjekte edilen hafıza bezlerinde trian mavisi ile kolayca görüntülenebildi Başarılı bir şekilde enjekte edilen hafıza bezlerinde boyama, başarısız bir enjeksiyonda sadece duktal ağaç çözelti ile dolduruldu. Meme başında veya çevresindeki dokuda sıvı birikmesi vardı.

LPS'nin sekizinci günde meme kanallarına başarılı bir şekilde enjekte edilmesi, beyindeki ve diğer abdominal organlardaki yapısal NF KB aktivitesine bağlı olarak bez içindeki NF KB aktivitesinin artmasına neden oldu. Herhangi bir manipülasyondan önce tutarlı bir temel sinyal vardı. Lusiferaz aktivitesi, LPS enjekte edilen bezde, dört fareden oluşan bir gruptan alınan PBS enjekte edilen bezden önemli ölçüde daha yüksekti.

LPS ile tedavi edilen bezler içinde lüminesansta istatistiksel olarak anlamlı bir artış ölçüldü. Bu yöntem, meme bezi iltihabı hakkında bilgi sağlayabilir. Kanser araştırmaları gibi diğer araştırma alanlarına da uygulanabilir.

Kanser hücrelerini veya kanserojenleri doğrudan meme kanalına enjekte edebilirsiniz.