Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama

Bu prosedürün amacı, bakteriyel genler ve yolaklar arasındaki fonksiyonel ilişkileri incelemektir. Bu işlem, öncelikle konjugasyona girecek veya çiftleştirilecek olan tekil mutant suşlar olan ceia coli dizilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tekil mutantların plaklar üzerinde bir dizi formatında konjugasyonuna tabi tutulmasıdır.

Ardından, çift mutantlar seçilir. Son adım, çift mutant plaklarının görüntülenmesi ve suş uygunluğunu belirlemek için çift mutant kolonilerinin nicelendirilmesidir. Nihayetinde, genetik etkileşim skorlarını hesaplamak ve fonksiyonel olarak etkileşen genleri, yolakları ve süreçleri tanımlamak için koloni boyutu verileri analiz edilir.

Bu tekniğin rastgele mutajenez gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda bireysel çift mutant suşun oluşturulabilmesidir. Dahası, gen boyutundan, temel gereklilikten veya tek gen mutant fitness değerinden bağımsız olarak, birçok gen arasındaki etkileşimler aynı anda değerlendirilebilir. Bu yöntem, gen fonksiyonları ve yolaklar ile süreçler arasındaki fonksiyonel çapraz etkileşimlerle ilgili olanlar gibi sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin doğurguları, çoğu fonksiyonel açıdan merkezi gen ve süreç hakkındaki bilgilerin yanı sıra hangi bakteriyel gen, yolak ve süreç kombinasyonlarının bozulduğunda bakteriyel fitness'ı artıracağı veya azaltacağının anlaşılmasının, en etkili müdahale stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacağı nedeniyle bakteriyel enfeksiyonların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu protokole başlamak için, yazılı prosedürde açıklandığı üzere, hedef açık okuma çerçevesini PKD 3 plazmidinden gelen bir kloramfenikol direnç belirteci ile değiştirmek amacıyla iki aşamalı iç içe (nested) PCR amplifikasyonu uygulanır.

Beklenen ürünü doğrulayın ve elde edilen fragmanı üreticinin protokolünü takip ederek PCR ile saflaştırın. PCR ürününü 30 µL steril distile su içerisinde elüe ettikten sonra, yaklaşık 50 mg/µL konsantrasyona seyrelitin. Saflaştırılmış ürün, transformasyondan önce -20 °C'de saklanır.

Ardından, donör konstrüksiyonu için yüksek frekanslı rekombinasyon veya HFR Cavalli kompetan hücrelerini hazırlayın. İlk olarak, 250 mililitrelik bir flask içerisinde, 70 mililitrelik taze LB besiyerine, 35 µL 50 mg/mL Ampisilin ekleyerek HFR Cavalli suşunun bir mililitre doymuş gece kültürü ile inokülasyon yapın.

Yaklaşık 0.5 ile 0.6 arasında bir optik yoğunluk elde edilene kadar kültürü, 220 RPM'de hafifçe çalkalayarak 32 °C'de inkübe edin. Ardından, Lambda Red Rekombinasyon sisteminin ısı indüksiyonu için kültürü 42 °C'deki bir benmariye aktarın ve indüksiyonu durdurmak için 160 RPM'de çalkalayarak 15 dakika bekletin. Kültürü, 160 RPM'de 10 ila 20 dakika boyunca soğutulmuş buzlu su banyosuna aktarın.

Hücrelerin transformasyona kadar soğuk tutulduğundan emin olun. Yazılı protokolde açıklandığı gibi santrifüjle yıkama ve hasat işlemleri yapıldıktan sonra, süpernatantı dökün ve peleti 500 µL buz gibi soğuk, %10 gliserol içeren Eloqua içinde yeniden süspande edin. Hücreleri 50 µL'lik hacimler halinde önceden soğutulmuş bireysel 1,5 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın ve derhal transformasyon işlemine geçin.

Kompetan hücrelere 100 nanogram saflaştırılmış gen silme kaseti ekleyin. Tüpü hafifçe sallayın ve süspansiyonun buz üzerinde beş dakika beklemesine izin verin. Ardından süspansiyonu önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine aktarın ve hücre karışımına hemen elektroporasyon uygulayın.

Bir mililitre oda sıcaklığında SOC medyumu ekleyin ve elektropore edilmiş hücreleri medyumla birlikte 15 mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın. Hücreleri 32 °C'de, 220 RPM orbital çalkalamayla bir saat boyunca inkube edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri 4.400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, yaklaşık 850 µL süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini kalan sıvı içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri, 17 µg/mL kloramfenikol içeren LB plaklarına yayın ve 32 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, mutant onaylaması için iki münferit transformantı LB kloramfenikol plaklarına çizin; suşların kanamisin dirençli olmadığını doğrulamak için aynı transformantları LB kanamisin plaklarına da çizin.

Ardından, DNA, yazılı protokolde açıklandığı şekilde üç farklı nakavt doğrulama primer seti ile amplifiye edilir. İlk primer seti, hedeflenen bölgenin 200 baz çifti yukarısında yer alan 20 nükleotidlik bir yan ileri primer ve kloramfenikol direnç kasetine tamamlayıcı bir geri primerden oluşur. Bu amplifikasyonun 445 nükleotidlik bir amplikon üretmesi beklenmektedir.

İkinci set, kloramfenikol direnç kaset dizisine bağlanan bir ileri primer ve silinen genin 3' ucunun 200 baz çifti aşağısına bağlanacak şekilde tasarlanmış bir geri flanke onay primerini içerir. Bu amplifikasyon reaksiyonunun 309 nükleotidlik bir amplikon üretmesi beklenmektedir. Üçüncü PCR, hem yukarı akış hem de aşağı akış flanke primerlerini içerir.

Bu reaksiyon, seçilen suyun; bir gen lokusunun kasetle değiştirildiği ve diğerinin duplication (iki katlama) yoluyla çoğaltıldığı, ancak bunun dışındaki vahşi tip gen kopyasının hala mevcut olduğu bir marrow diploid olmadığının teyidi için gereklidir. Bu amplifikasyonun 1.4 KB'lık bir ürün üretmesi beklenmektedir. E. coli ke io tekli esensiyel olmayan gen delesyon mutan koleksiyonu, robotik olarak 24 384'e replica plat şeklinde aktarılmıştır.

Her kuyucuğunda 80 µL sıvı LB besiyeri bulunan bir mikroplaka hazırlayın. Pozitif kontrol olarak kullanılan, plaka normalizasyonuna ve otomatik koloni sayımına yardımcı olan kenar kontrol suşunu yerleştirmek için besiyerini mL başına 50 µg kanマイcin ile destekleyin. Her plakanın en dıştaki kuyucuklarındaki inoküle edilmiş besiyerini uzaklaştırıp yeni plakalara aktararak en dıştaki kuyucukları boş bırakın.

Benzer şekilde, her plak içinde farklı bir konumdan herhangi iki suşu çıkarıp bu suşları yeni bir plağa aktararak negatif kontrol noktaları oluşturun. Ardından, kenar kontrol kuyucukları ve negatif kontrol kuyucukları da dahil olmak üzere boş kuyucukları, mililitre başına 17 mikrogram kloramphenicol içeren LV medyumu ile doldurun. Bu negatif kontrol noktalarının alıcı ve dolayısıyla çift mutant plaklarında boş olması beklenmektedir.

Bunlar, görüntüleme numaralandırması veya plakların sabitlenmesi sırasında herhangi bir işlem veya plak taşıma hatası oluşmadığından emin olmaya yarar. Yazılı prosedürde açıklandığı şekilde kenar pozitif suşları hazırlandıktan sonra, dizi suşları ve kenar pozitif suşu 32 °C'de, 190 RPM orbital çalkalamayla gece boyunca büyütülür; ertesi gün, kenar kuyucukları gece boyu büyütülen kültürden yaklaşık 80 µL ile doldurulur. Hazırlanan plaklar, bir sonraki bölümde açıklandığı şekilde çiftleştirme için kullanılabilir.

Alternatif olarak, uzun süreli saklama için, alıcı plakaların her kuyucuğuna %15 gliserol eklenir ve besiyeri ile gliserol karıştırılır. Plakalar daha sonra -80 °C'de saklanır. Çiftleşme prosedürüne, kloramphenicol direnç kaseti ile işaretlenmiş sorgulanan gen delesyonunu taşıyan HFR donör suşu, 17 µg/mL kloramphenicol içeren zengin LB sıvı besiyerinde 32 °C'de gece boyunca büyütülerek başlanır.

Sipariş edilen TH alıcı mutant koleksiyonu, mililitre başına 50 mikrogram kanamisin eklenmiş katı LB plaklarına 3 84 koloni yoğunluğunda aktarıldı. Paralel olarak, donör sorgu mutant suşu aynı sayıdaki LB plaklarına 3 84 koloni yoğunluğunda pinlendi.

Mililitrede 17 mikrogram kloramfenikol ile desteklenmiştir. Suşların konjugasyonunu sağlamak için plakaları 32 °C'de gece boyunca inkübe edin. 3x84 kolonluk gece boyu bekletilmiş donör plakalarındaki donörleri katı LB plakalarına aktarın.

Ardından, taze olarak ekilmiş donörlerin üzerine, tek bir 384 kolonili gece boyu bekletilmiş alıcı plakadaki suşları ekleyin. Konjugasyon plakalarını 32 °C'de 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, her bir 384 yoğunluklu konjugasyon plakasını, kloramfenikol içeren tek bir katı LB plakasına ekleyin.

Ve tüm konjugasyon plakaları pinlenene kadar mycin bu işlemi tekrarlayabilir mi? Yeni pinlenmiş birinci seçim plakalarını 32 °C'de 16 ila 36 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir birinci seçim plakasını, her bir birinci seçim kolonisinin dört koloni ile temsil edildiği 1536 SPOT formatındaki ikinci bir çift ilaç seçim plakasına yeniden pinleyin.

İkinci seçilim plakasında, plakaları 16 ila 36 saat boyunca inkübe edin. 32 °C'de, mutantların büyüme uygunluğunu nicel olarak ölçmek ve gen çiftleri arasındaki etkileşimleri analiz etmek için final çift mutant seçilim plakalarının fotoğraflarını çekin. Aynı yolak üzerindeki genler yakından ilişkili GI paternleri sergilediğinden, fonksiyonel olarak ilişkili genler, S skor profillerinin genel benzerliğine göre kümelenerek gruplandırılabilir.

GI profil benzerliği, iki genin mutasyonu üzerine fenotiplerin tutarlılığını temsil eder ve iki genin aynı veya örtüşen yolakta etki edip etmediğini göstermelidir. Burada, fiziksel olarak etkileşime giren proteinleri kodlayan gen çiftlerinin GI profilleri ile rastgele seçilmiş gen çiftlerinin GI profilleri arasındaki korelasyon katsayılarının dağılımı gösterilmiştir. Sperm boşaltımı için gerekli olan heterotrimerik bir kompleks oluşturan iki taşıyıcı için korele genetik profillerin saçılım grafiği örneği, maya ecoline geni sergileyen şekilde gösterilmiştir.

Yüksek korelasyonlu GI profilleriyle olan hafifletici etkileşimler, fiziksel olarak ilişkili olan veya ortak bir biyokimyasal yolakta uyumlu şekilde hareket eden yolakları kodlama eğilimindedir. Burada, temel bir süreçte birlikte yer alan ve fonksiyonel olarak yedekli olan ISC ve SUF demir kükürt biyosentez yolaklarının bileşenlerinin, kapsamlı ağırlaştırıcı etkileşimlerle birbirine bağlanan ayrı kümeler oluşturduğu temsili bir örnek gösterilmiştir. Belirli yolak kombinasyonları arasındaki etkileşimlerdeki herhangi bir anlamlı zenginleşmeyi bulmak için istatistiksel bir ölçüt; GI ağlarının fiziksel etkileşimler ve genomik bağlam gibi diğer fonksiyonel ilişkilendirme verileriyle entegrasyonu kullanılabilir.

İlişkiler, bakterilerdeki temel biyolojik sistemleri tanımlayan daha yüksek mertebeli fonksiyonel modüllerin organizasyonunu ortaya çıkarabilir. Kümeleme analizi, açıklanmış genlerin fonksiyonlarını tahmin etmek için GI ağlarına da uygulanabilir. Kümeleme algoritmaları farklılık gösterdiğinden.

Bununla birlikte, kümeleme yoluyla belirlenen varsayımsal fonksiyonel atamaların bağımsız deneysel doğrulaması gereklidir. Bu prosedür uygulanırken, tüm gerekli pozitif ve negatif kontrollerin dahil edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Belirli gen fonksiyonlarının yanı sıra genler ve yolaklar arasındaki fonksiyonel ilişkilerin doğası hakkındaki ek soruları yanıtlamak için proteomik, biyokimyasal takip deneyleri ve kimyasal genomik gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çift mutant suşların nasıl oluşturulacağı, alıcı dizilerin nasıl bir araya getirileceği ve E. coli'deki genler ile süreçler arasındaki fonksiyonel ilişkileri araştırmak için ESGA taramalarının nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.