Name: Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama Escherichia Coli Sentetik Genetik Diziler kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Öğrenin, Escherichia coli'de eSGA teknolojisiyle bakteriyel genler arasındaki fonksiyonel ilişkileri ve genetik etkileşim ağlarını haritalamayı. Bu yöntem, gen fonksiyonları ve yolaklar arası çapraz etkileşimleri anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Genom Kanada, Ontario Genomik Enstitüsü ve JG ve AE AG Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüsü&#39;nün fonları tarafından desteklenmiştir Vanier Kanada Lisansüstü Bursu bir alıcı olduğunu.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz GI sorgulayarak bir patika düzeyde bakteriyel gen fonksiyonlarını araştırmak için robotik eSGA tarama kullanmak için adım adım protokol ana hatlarıyla. Bu yaklaşım, E. tek tek genler hem de tüm biyolojik sistemlerde incelemek için kullanılabilir coli. Dikkatle tüm uygun kontroller dahil olmak üzere yukarıda anlatılan deneysel adımlar, yürütme ve titizlikle analiz ve bağımsız GI veri fonksiyonel yeni keşifler yapma eSGA başarısı için önemli yönleri vardır doğrulayarak. ESGA, E. GI çalışmak ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. Antibiyotikler&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Biyomarket</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Luria-Bertani besiyeri&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LB tozu</td><td>Biyomarket</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Biyomarket</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Bakteriyel Suşlar ve Plazmidler&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hfr Cavalli suşu &amp;#955;&lt;sub&gt;kırmızı&lt;/sub&gt; sistem (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;ve ark.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Genetik Stok Merkezi, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; F- alıcı koleksiyonu</td><td>Japonya Ulusal BiyoKaynak Projesi (National BioResource Project - NBRP)&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipomorfik &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;F- SPA-etiketli suşlar</td><td>Açık biyosistemler; Babu &lt;em&gt;ve ark.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Primerlar&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pKD3 tabanlı tuzsuz sabit primerler</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Tuzdan arındırılmış özel primerler</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>Tuzdan arındırılmış özel primerler</td><td></td><td></td><td>F2 ve R2: pKD3 dizisine dayalı 20 nt sabit bölgeler ve 45 nt özel homoloji bölgeleri&lt;br/&gt; F2 sabit bölgesi:&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; R2 sabit bölgesi:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
S1 ve S2: SPA-Cm kasetinin amplifikasyonu için primerleme amacıyla kullanılan 27 nt'lik sabit bölgeler ve 45 nt'lik özel homoloji bölgeleri&lt;br/&gt; S1 sabit bölgesi:&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'&#039;&lt;br/&gt; S2 sabit bölgesi:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F ve KOCO-C: Esansiyel olmayan gen delesyon bölgesinden veya esansiyel genden 200 bp uzaklıkta olan 20 nt primerler&lt;br/&gt; gen SPA-etiketi ekleme bölgesi</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. PCR ve Elektroforez Reaktifleri&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraz</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10X PCR tamponu</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP'ler</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Biyomarket</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Yükleme boyası</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Biyomarket</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE tamponu</td><td>Biyomarket</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris Bazı</td><td>Biyomarket</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNA merdiveni</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. DNA İzolasyon ve Saflaştırma Kitleri&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Genomik DNA izolasyon ve saflaştırma kiti</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Midi kiti</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. PCR, Transformasyon ve Replika-pinleme için Ekipmanlar&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroz jel elektroforezi</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 cm elektroporasyon küveti</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C su banyolu çalkalayıcı</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;Çalkalayıcı</td><td>New Brunswick Scientific, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C plaka inkübatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDA masaüstü robotu</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96, 384 ve 1.536 pin yoğunluklu padler</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 veya 384 adet uzun pin</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. Görüntüleme Ekipmanları&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kamera standı</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera, 10 megapiksel</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işıklı kutular, Testrite 16&quot; x 24&quot; birimler</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. Pedlerin veya Plakaların Geri Dönüşümü &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>%10'luk çamaşır suyu</td><td>Herhangi bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Herhangi bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril distile su</td><td>Herhangi bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış kabini</td><td>Herhangi bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraviyole lamba</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. Laboratuvar Gereçleri&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50 ml polipropilen tüpler</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikro santrifüj tüpleri</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml erlenmayerleri</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml steril kültür tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik tüpler</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Dikdörtgen Plakalar</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu ve 384 kuyucuklu mikrotitre plakaları</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Çok kuyucuklu plakaların mühürlenmesi için plaka silindiri</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>plakalar</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan plaka sızdırmazlık şeritleri</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C dondurucusu</td><td>Herhangi Bir Tedarikçi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel fonksiyonel ağlar ve tanımında haritalama<em&gt; escherichia coli</em&gt; sentetik genetik diziler kullanarak

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Fenotipleri fiziksel (protein-protein gibi) ve fonksiyonel (örneğin, gen-geni ya da gen) etkileşimleri (GI) 1 karmaşık bir dizi ile belirlenmiştir. Fiziksel etkileşim bakteriyel protein kompleksleri olarak ilişkili oldukları işaret olsa da, onlar mutlaka yolunun düzey fonksiyonel relationships1 açıklamayız. İki silinmiş veya inaktif genleri taşıyan çift mutantların büyüme ölçülür ve karşılık gelen tek mutantlar ile karşılaştırıldığında hangi GI ekranlar, lokusları arasında epistatik bağımlılıkları aydınlatmak ve dolayısıyla yeni fonksiyonel ilişkiler 2 sorgulamak ve keşfetmek için bir araç sağlayabilir. Büyük ölçekli GI haritaları maya 3-7 gibi ökaryotik organizmalar için bildirilen, ancak GI bilgi bakteriyel genomlar işlevsel açıklama engellemektedir prokaryotlar 8 için seyrek kalır edilmiştir. Bu amaçla, ve diğerleri, yüksek verim kantitatif bakteri GI tarama yöntemleri, 9, 10 geliştirdik </&gt; sup. Burada, kantitatif E. gerçekleştirmek için gereken önemli adımları sunmak sistemik oluşturmak ve bir koloni dizisi biçiminde çift mutantlar çok sayıda spor ölçmek için doğal bakteriyel konjugasyon ve homolog rekombinasyon kullanarak coli bir genom-ölçekli 9 Sentetik Genetik Array (eSGA) tarama prosedürü,. Kısaca, bir robot aktarmak için kullanılır , konjugasyon yoluyla, kloramfenikol (Cm) - İşaretli F-alıcı suşlar - mühendislik Hfr gelen mutant alleli (rekombinasyon Yüksek frekans) kanamisin sıralı bir dizi (Kan) içine &#39;donör suşları&#39; olarak işaretlenmiş. Genellikle, biz kayıp fonksiyon-gerekli olmayan gen delesyonlar taşıyan tek mutantlar (&#39;Keio&#39; koleksiyonu 11 gibi) ve temel gen mutasyonları hypomorphic (azaltılmış protein ekspresyonu, istikrar, ya da etkinlik 9, 12, 13 görüşmekte yani allelleri) kullanın non-esansiyel ve esansiyel genler, res fonksiyonel dernekleri sorgulamakpectively. Homolog yeniden birleşme ve bunu takip eden genetik değiş tokuş aracılı sonra, elde edilen çift mutant hem de antibiyotik içeren katı ortam üzerinde seçilir. Akıbet sonra, plakaları dijital görüntülü ve koloni boyutları nicel bir in-house otomatik görüntü işleme sistemi 14 kullanılarak puanlanır. Yaktığımız bir çift mutant büyüme oranı beklenen 9 daha da belirgin olarak daha iyi veya daha kötü olduğu zaman ortaya çıkar. Ağırlaştırıcı (veya negatif) yaktığımız çoğu aynı temel süreç 2 çarpacak telafi yollarının gelen genlerin çiftleri kaybı fonksiyon-mutasyonlar arasındaki sonuçlanabilir. Burada, tek bir gen kaybı ya da tek bir mutasyona uğramış uygun bir şekilde, arabelleğe. Ancak, her iki yollarının kaybı zararlı olduğunu ve sentetik öldürücülüğü veya hastalık (yani yavaş büyüme) ile sonuçlanır. Tersine, hafifletilmesi (veya pozitif) etkileşimleri aynı yolu ya da karmaşık protein 2 genleri arasında meydana gelebilecektek başına ya da gen silinmesi sık sık yoldan veya daha fazla ilave pertürbasyonlar, böylece büyüme aktivitesini azaltır, ve olmayan bu tür karmaşık ve normal fonksiyonunu karıştırmayı için yeterlidir. Genel olarak, sistematik olarak tanımlanması ve GI ağları analiz diğer yaklaşımlar tarafından cevapsız yolağı düzeyde bilgi 9 varılabilir hangi genlerin, çok sayıda arasındaki fonksiyonel ilişkilerin tarafsız, global haritalar sağlayabilir.

GI'lar, genler arasındaki fonksiyonel ilişkileri ortaya çıkarır. Benzer şekilde, aynı yolaktaki genler benzer GI örüntüleri sergilediği ve GI profil benzerliği fenotiplerin uyumluluğunu temsil ettiği için, GI profillerini kümeleyerek fonksiyonel olarak ilişkili genleri yolaklara gruplandırabiliriz. GI ve GI korelasyon ağlarının fiziksel etkileşim bilgileriyle veya genomik bağlam (GC) ilişkileri gibi diğer ilişkilendirme verileriyle entegrasyonu, bakterilerdeki temel biyolojik sistemleri (ve sistemler arası etkileşimi) ta...

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen denir<em&gt; Escherichia coli</em&gt;.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Fenotipler, bir dizi karmaşık fiziksel (örn. protein-protein) ve fonksiyonel (örn. gen-gen veya genetik) etkileşimler (GI) tarafından belirlenir1. ...

Bu prosedürün amacı, bakteriyel genler ve yolaklar arasındaki fonksiyonel ilişkileri incelemektir. Bu işlem, öncelikle konjugasyona girecek veya çiftleştirilecek olan tekil mutant suşlar olan ceia coli dizilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tekil mutantların plaklar üzerinde bir dizi formatında konjugasyonuna tabi tutulmasıdır.Ardından, çift mutantlar seçilir. Son adım, çift mutant plaklarının görüntülenmesi ve suş uygunluğunu belirlemek için çift mutant kolonilerinin nicelendirilmesidir. Nihayetinde, genetik etkileşim skorlarını hesaplamak ve fonksiyonel olarak etkileşen genleri, yolakları ve süreçleri tanımlamak için koloni boyutu verileri analiz edilir.Bu tekniğin rastgele mutajenez gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda bireysel çift mutant suşun oluşturulabilmesidir. Dahası, gen boyutundan, temel gereklilikten veya tek gen mutant fitness değerinden bağımsız olarak, birçok gen arasındaki etkileşimler aynı anda değerlendirilebilir. Bu yöntem, gen fonksiyonları ve yolaklar ile süreçler arasındaki fonksiyonel çapraz etkileşimlerle ilgili olanlar gibi sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin doğurg

mapping-bacterial-functional-networks-pathways-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç...

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Burada, varsayılan faj genlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için fenomik yaklaşımlar sunuyoruz. Teknikler, katabolik metabolizmaya etkileri ölçebilen yerleşik metabolomik yöntemine ek olarak, konakçı anabolik metabolizmayı izleyebilen gelişmiş bir tahlil, Çoklu Fenotip Test Plakaları (MAP'ler) içerir.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Bu yazıda mühendislik hücreleri ve sentetik kontrol ve programlanabilir malzeme yüzeylerini işlemek için E. coli mühendislik enable işlevselleştirilmiş yüzeylerin geliştirilmesi için bir dizi protokol sunar.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Masaüstü cihazları kullanan tüm genom dizileme (WGS) stratejilerinin fizibilitesi, laboratuvar ortamında halk sağlığı ile ilgili her mikrobun genom sorgulamasını basitleştirmiştir. Bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlaması tanımlanmıştır ve analiz için bir biyoinformatik boru hattı da sunulmuştur.

Oreochromis spp. Çiftliklerinden Türetilen Patojenik Bir Escherichia coli Suşunun Karakterizasyonu Tüm Genom Dizilimini Kullanarak

Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.

Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler

Öğrenin, Escherichia coli'de eSGA teknolojisiyle bakteriyel genler arasındaki fonksiyonel ilişkileri ve genetik etkileşim ağlarını haritalamayı. Bu yöntem, gen fonksiyonları ve yolaklar arası çapraz etkileşimleri anlamak için güçlü bir araç sunar.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama

Daha fazla video keşfet