Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama Escherichia Coli Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bu işlemin amacı, bakteri genleri ve yolakları arasındaki fonksiyonel ilişkileri araştırmaktır. Bu, önce konjuge edilecek veya çiftleştirilecek tek mutant suşlar olan bir ceia coli dizisinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tek mutantları plakalar üzerinde bir dizi biçiminde eşleniktir.

Daha sonra, çift mutantlar seçilir. Son adım, çift mutant plakaları görüntülemek ve suş uygunluğunu belirlemek için çift mutant kolonileri nicelleştirmektir. Sonuç olarak, koloni büyüklüğü verileri, genetik etkileşim puanlarını hesaplamak ve işlevsel olarak etkileşime giren genleri, yolları ve süreçleri belirlemek için analiz edilir.

Bu tekniğin rastgele mutajenez gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, birçok bireysel çift mutant suşun oluşturulabilmesidir. Ayrıca, birçok gen arasındaki etkileşimler, gen boyutu, gerekliliği veya tek gen mutant uygunluğundan bağımsız olarak aynı anda değerlendirilebilir. Bu yöntem, gen fonksiyonları ve yollar ve süreçler arasındaki işlevsel karışma ile ilgili olanlar gibi sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, bakteriyel enfeksiyonların tedavisine kadar uzanır, çünkü işlevsel olarak merkezi genlerin ve süreçlerin çoğu hakkında bilgi sahibi olmanın yanı sıra, bozulduğunda bakteriyel genlerin, yolların ve süreçlerin hangi kombinasyonlarının bakteri uygunluğunu iyileştirdiğinin veya azalttığının anlaşılması, en etkili müdahale stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. İki adımlı iç içe. PCR amplifikasyonu, hedef açık okuma çerçevesini, yazılı prosedürde açıklandığı gibi PKD üç plazmidinden bir kloramfenikol direnç markörü ile değiştirmek için kullanılır.

Beklenen ürünü onaylayın ve PCR, elde edilen parçayı üreticinin protokolüne göre saflaştırın. PCR ürününü 30 mikrolitre steril damıtılmış su içinde ayrıştırdıktan sonra, mikrolitre konsantrasyon başına yaklaşık 50 miligrama kadar seyreltin. Saflaştırılmış ürün, dönüşümden önce eksi 20 santigrat derecede saklanır.

Daha sonra, donör yapımı için yüksek frekanslı rekombinasyon veya HFR Caval yetkin hücrelerini hazırlayın. İlk olarak, HFR Cavalli suşunun doymuş bir gece kültüründen bir mililitreyi, mililitre başına 35 mikrolitre 50 miligram ile 70 mililitre taze LB ortamına aşılayın. 250 mililitrelik bir şişede ampisilin.

Yaklaşık 0,5 ila 0,6 optik yoğunluk elde edilene kadar 220 RPM'de hafifçe çalkalayarak kültürü 32 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kültürü, Lambda Red Rekombinasyon sisteminin ısı indüksiyonu için 42 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir su banyosuna aktarın ve indüksiyonu durdurmak için 160 RPM'de çalkalayın. Kültürü 160 RPM'de 10 ila 20 dakika soğutulmuş bir buz bulamacı su banyosuna aktarın.

Dönüşüm sonrasına kadar hücreleri soğuk tuttuğunuzdan emin olun. Hücreleri yazılı protokolde tarif edildiği gibi santrifüjleme ile yıkadıktan ve hasat ettikten sonra, sinamekiyi boşaltın ve peleti 500 mikrolitre buz gibi, %10 gliserol Eloqua'da yeniden süspanse edin. 50 mikrolitrelik hacimlerdeki hücreler, önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplere dönüştürülür ve hemen dönüşüme devam edilir.

100 nanogram saflaştırılmış gen delesyonu, yetkili hücrelere kaset ekleyin. Tüpü hafifçe vurun ve süspansiyonun beş dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin. Daha sonra süspansiyonu önceden soğutulmuş bir elektroporasyon vete elektrosuna aktarın, hücre karışımını hemen çalıştırın.

Bir mililitre oda sıcaklığında SOC ortamı ekleyin ve ortamdaki elektroporasyonlu hücreleri 15 mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın. Hücreleri 32 santigrat derecede bir saat boyunca 220 RPM'de yörünge sallama ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 4.400 kez G hücrelerini beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, yaklaşık 850 mikrolitre supinat çıkarın ve kalan sıvıda hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreleri mililitre başına 17 mikrogram, kloramfenikol içeren LB plakalarına yayın ve gece boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, mutant doğrulama için LB kloramfenikol plakaları üzerinde iki ayrı dönüştürücü çizin, suşların misine dirençli olmadığını doğrulamak için LB kutu misin plakaları üzerinde aynı dönüştürücüleri çizin.

Daha sonra, DNA, yazılı protokolde açıklandığı gibi üç farklı nakavt onay primeri seti ile amplifiye edilir. İlk astar seti, hedeflenen bölgenin 200 baz çiftinin yukarısına yerleştirilmiş ileri doğru uzanan 20 nükleotidlik bir astar ve kloramfenikol direnç kasetine tamamlayıcı olan bir ters astardan oluşur. Bu amplifikasyonun 445 nükleotidlik bir amplikon üretmesi bekleniyor.

İkinci set, bir ileri astar, kloramfenikol direnç kaset dizisine diz çökme ve silinen genin üç ana ucunun aşağı akışında 200 baz çifti oluşturmak için tasarlanmış bir ters yan doğrulama astarı içerir. Bu amplifikasyon reaksiyonunun bir 309 nükleotid amplikon üretmesi bekleniyor. Üçüncü PCR, hem yukarı hem de aşağı akış yan astarları içerir.

Bu reaksiyon, seçilen suşun, bir gen lokusunun kaset ile değiştirildiği ve başka bir kopyalanmış, ancak aksi takdirde vahşi tip gen kopyasının hala mevcut olduğu bir kemik iliği diploidi olmadığını doğrulamak için gereklidir. Bu amplifikasyonun 1.4 KB'lık bir ürün üretmesi bekleniyor. E coli ke io tek esansiyel olmayan gen delesyon mutant koleksiyonu, robotik olarak 24 384'e replika olarak sabitlenir.

Peki, kuyu başına 80 mikrolitre sıvı LB ortamı içeren mikroplaka. Mililitre başına 50 mikrogram ile takviye edilmiş, pozitif bir kontrol olarak eksik olan ve plaka normalizasyonlarında ve otomatik koloni nicelemesinde yardımcı olan sınır kontrol suşuna yer açmak için misin olabilir. Aşılanmış ortamı her bir plakanın en dış oyuklarından çıkarın ve en dıştaki oyukları boş bırakarak yeni plakalara aktarın.

Benzer şekilde, herhangi iki suşu her bir plaka içinde farklı bir yerden çıkararak ve suşları yeni bir plakaya aktararak negatif kontrol noktaları oluşturun. Daha sonra, sınır kontrol kuyuları ve negatif kontrol kuyuları da dahil olmak üzere boş kuyuları, mililitre başına 17 mikrogram kloramfenikol içeren LV ortamı ile doldurun. Bu negatif kontrol noktalarının alıcıda boş olması ve dolayısıyla çift mutant plakaların olması beklenir.

Plakaları numaralandırırken, görüntülerken veya sabitlerken herhangi bir işleme veya plaka işleme hatası olmamasını sağlamaya hizmet ederler. Yazılı prosedürde tarif edildiği gibi sınır pozitif suş hazırlandıktan sonra, dizi suşları ve sınır pozitif gerinim, ertesi gün 190 RPM orbital çalkalama ile 32 santigrat derecede gece boyunca büyütülür, sınır kuyuları yaklaşık 80 mikrolitre gece boyunca kültürle doldurulur. Monte edilen plakalar, bir sonraki bölümde açıklandığı gibi çiftleştirme için kullanılabilir.

Alternatif olarak, uzun süreli depolama için, alıcı plakalardaki her bir kuyucuk% 15 gliserol ile desteklenir ve ortam ve gliserol karıştırılır. Plakalar daha sonra eksi 80 santigrat derecede saklanır. Çiftleşme prosedürüne, mililitre kloramfenikol pimi başına 17 mikrogram ile zengin LB sıvı ortamda gece boyunca 32 santigrat derecede kloramfenikol direnç kaseti ile işaretlenmiş sorgu gen delesyonunu taşıyan HFR donör suşunu büyüterek başlayın.

TH, katı LB plakaları üzerine 3 84 koloni yoğunluğunda alıcı mutant koleksiyonu sipariş etti. Mililitre başına 50 mikrogram kutu misin ile desteklenmiştir. Paralel olarak, 3 84 koloni yoğunluğundaki donör sorgu mutant suşunu aynı sayıda LB plakasına sabitleyin.

Mililitre başına 17 mikrogram kloramfenikol ile desteklenmiştir. Suşları birleştirmek için plakaları gece boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin. 3 84 koloni gece boyunca donör plakalarından gelen donörü katı LB plakalarına sabitleyin.

Ardından, tek bir 3 84 koloni gece boyunca alıcı plakasından gelen suşları yeni sabitlenmiş donörlerin üzerine sabitleyin. Sabitlenmiş konjugasyon plakalarını 32 santigrat derecede 16 ila 24 saat inkübe edin. Daha sonra, her bir 384 yoğunluklu konjugasyon plakasını kloramfenikol içeren tek bir katı LB plakasına sabitleyin.

Ve misin, tüm konjugasyon plakaları sabitlenene kadar bu işlemi tekrarlayabilir mi? Yeni sabitlenmiş ilk seçim plakalarını 32 santigrat derecede 16 ila 36 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir ilk seçim plakasını 1536 SPOT formatında ikinci bir çift ilaç seçim plakasına yeniden sabitleyin, böylece her bir ilk seçim kolonisi dört koloni ile temsil edilir.

İkinci seçim plakasında, plakaları 16 ila 36 saat inkübe edin. 32 derece oss'de, mutantların büyüme uygunluğunu nicel olarak ölçmek ve gen çiftleri arasındaki etkileşimleri analiz etmek için son çift mutant seçim plakalarını fotoğraflayın. Aynı yoldaki genler yakından ilişkili GI paternleri gösterdiğinden, fonksiyonel olarak ilişkili genler, S skor profillerinin genel benzerliğine göre kümelenerek gruplandırılabilir.

GI profili benzerliği, iki genin mutasyonu üzerine fenotiplerin uyumunu temsil eder ve iki genin aynı veya örtüşen yolda hareket edip etmediğinin göstergesi olmalıdır. Burada gösterilen, fiziksel olarak etkileşen proteinleri kodlayan gen çiftlerinin GI profilleri ile rastgele çizilmiş gen çiftleri arasındaki korelasyon katsayılarının dağılımıdır. Sperm atılımı için gerekli olan heterotrimerik bir kompleks oluşturan iki taşıyıcı için ilişkili genetik profillerin bir dağılım grafiği örneği, maya ekolin geninin sergilenmesinde olduğu gibi gösterilmiştir.

Yüksek korelasyonlu GI profilleri ile etkileşimleri hafifletmek, fiziksel olarak ilişkili olan veya ortak bir biyokimyasal yolda tutarlı bir şekilde hareket eden yolları kodlama eğilimindedir. Burada, temel bir sürece ortaklaşa katılan işlevsel olarak yedekli ISC ve SUF demir kükürt biyosentez yollarının bileşenlerinin, kapsamlı ağırlaştırıcı etkileşimlerle birbirine bağlanan farklı kümeler oluşturduğu temsili bir örnek gösterilmektedir. İstatistiksel bir ölçüm, yolların belirli kombinasyonları, GI ağlarının fiziksel etkileşimlerle entegrasyonu ve genomik bağlam gibi diğer işlevsel ilişkilendirme verileri arasındaki etkileşimler için herhangi bir önemli zenginleştirme bulmak için kullanılabilir.

İlişkiler, bakterilerdeki temel biyolojik sistemleri tanımlayan daha üst düzey fonksiyonel modüllerin organizasyonunu ortaya çıkarabilir. Küme analizi, açıklamalı genlerin işlevlerini tahmin etmek için GI ağlarına da uygulanabilir. Kümeleme algoritmaları değişiklik gösterdiğinden.

Bununla birlikte, kümeleme yoluyla belirlenen varsayılan işlevsel atamalar, bağımsız deneysel doğrulama gerektirir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben gerekli tüm olumlu ve olumsuz şeyleri dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Proteomik, biyokimyasal takip deneyleri ve kimyasal genomik gibi diğer yöntemler, belirli gen fonksiyonlarının yanı sıra genler ve yollar arasındaki fonksiyonel ilişkilerin doğası hakkında ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çift mutant suşların nasıl oluşturulacağını, alıcı dizilerinin nasıl birleştirileceğini ve e coli'deki genler ve süreçler arasındaki işlevsel ilişkileri araştırmak için ESGA ekranlarının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.