Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan protein raporlayıcı gen ile işaretlenmiş çoklu delesyonlar taşıyan maya suşları üretmektir. Bu işlem, öncelikle her biri hedef genlerden birinin yerine bir GFP delesyon kaseti taşıyan ve "pro monster" olarak adlandırılan haplo tekli mutantların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, pro monster suşlarında da bulunan GM toolkit A ve GM toolkit alpha olarak adlandırılan iki set diploid ve haplo seçici marker kullanılarak, çiftleşme ve mayaların sporülasyonu yoluyla delesyonların sıralanmasıdır.

Ardından, iki delesyon taşıyan suşları zenginleştirmek için akış sitometrisi kullanılarak miyotik popülasyondan yüksek floresan gösteren hücreler seçilir. Son adım, sıralanan suşların genotiplerini doğrulamaktır. Nihayetinde, elde edilen suşlarla başlanarak tekrarlanan çiftleşme ve akış sitometrik zenginleştirme döngüleri, daha fazla çoklu delesyon suşlarının oluşturulmasını sağlar.

Bu tekniğin, marker yeniden kullanımı ve ardışık gen delesyonu için G yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, döngü başına birden fazla delesyonun elde edilebilmesi ve bunun sonucunda çoklu mutantların daha hızlı bir şekilde birleştirilmesidir. Bu videoya eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde pro-monster'ların üretilmesinin ardından, yerleşik pro-monster GFP delesyon suşlarının kültürlerini 1,6 ml'lik bir eppendorf tüpünde hazırlayarak seksüel döngüye başlayın. Çiftleşme tipi A olan delesyon suşunu, histidin içermeyen ve "minus his medium" olarak adlandırılan 100 µL sentetik komple medyumu hazırlayın. Ayrıca, hava değişimi için 1,6 ml'lik bir eppendorf tüpünde, çiftleşme tipi alpha olan delesyon suşunu, lösin içermeyen 100 µL sentetik komple medyumda veya "minus lu medium"da hazırlayın.

%70 etanol ile işlem görmüş bir raptiye kullanarak tüplerin kapaklarında delikler açın. Tüpleri 30 °C'de gece boyunca yatay olarak döndürün. Dönme ekseni, tüpün boylamsal eksenine paralel olmalıdır.

Optik yoğunluktan tahmin ederek, GFP delesyon suşlarından yaklaşık 250.000 a haplo hücre ve 250.000 alfa haplo hücreyi 1,6 mililitrelik bir eppendorf tüpünde karıştırın. Bu hücre sayısı genellikle her bir gece boyu kültürden 7 µL'ye tekabül eder ve vortexlenir. Bu hücreleri hazırlamak için önce 800 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpinat çıkarıldıktan sonra, %70 etanol ile işlem görmüş bir raptiye kullanarak kapakta bir delik açın. Hava değişimine izin vermek için, 50 µL YPDA besiyeri ekleyin ve ardından örneğinizi 800 G'de beş dakika boyunca hızlı bir vorteks santrifüj işlemine tabi tutun. Ardından tüpü; boş bir pipet ucu kutusu, küçük bir pipet ucu standı ve ıslak bir kağıt havlu ile oluşturulmuş nemli bir kutuya yerleştirin.

Kutuyu 30 °C'de gece boyu inkübe edin. Çiftleştirme karışımının 10 µL'sini, kapağı gevşetilmiş beş mL'lik bir kültür tüpü içindeki G 4 1 8 ve nat antibiyotikleri içeren, agarsız 500 µL GNA besiyerine aktarın; 600 nm'deki başlangıç optik yoğunluğu yaklaşık 0,1'dir. Kültürü 30 °C'de 24 saat boyunca rotasyona tabi tutun.

Bu durum, sadece hem GM toolkit A'daki MX four hem de nat MX four içeren diploidlerin G 418 ve Nat varlığında büyüyebilmesi nedeniyle diploidlerin seçilmesine olanak tanır. Bir günlük kültürden 20 µL alınarak G 418 ve net içeren 500 µL taze GN ortamına aktarılır. 600 nm'deki başlangıç optik yoğunluğu yaklaşık olarak 0.2'dir.

Hücreleri log fazına getirmek için tüpü 30 °C'de beş saat boyunca döndürün. Diploidleri korele etmek ve sporları izole etmek için yazılı protokolde belirtilen prosedürü izleyin.

SPO ilişkili hücre süspansiyonunu iki adet 300 µL'lik parçaya ayırın ve her birini ayrı bir 1,5 mL'lik Eppendorf tüpüne koyun. Tüpleri 800 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, her tüpün kapağına bir delik açın.

Bir raptiye yardımıyla, bir tüpteki pelete 100 µL minus his ortamı ekleyin. Diğer tüpteki PT'ye haplo seçimi yapmak için, alfa haploları seçmek üzere 100 µL minus loo ortamı ekleyin.

Tüpleri 30 degrees Celsius'de gece boyunca döndürün. 600 nanometers'deki nihai optik yoğunluk 0.5'ten düşük olmalıdır. Eğer 600 nanometers'deki optik yoğunluk çok yüksek olma eğilimindeyse, oda sıcaklığında triol yapın.

GFP indüksiyonu sağlamak için, farklı suşlara 20 µg/mL doksisiklin içeren 100 µL taze minus his veya minus LU besiyeri ekleyin. Doksisiklinin nihai konsantrasyonu 10 µg/mL olacaktır. Tüpü vorteksleyin ve 30 °C'de iki gün boyunca rotasyona bırakın.

Akış sitometresine başlamak için, beş mililitrelik polistiren tüpten alınan hücre süzgeçli kapakla değiştirilmiş beş mililitrelik bir polipropilen tüpe 900 µL önceden filtrelenmiş TE tamponu ekleyin. Polipropilen tüpler akış sitometrisi için uygundur. Süzgeçli kapak, büyük partiküllerin uzaklaştırılması için tercih edilir.

Hücre süzgeç kapağının üzerine nazikçe 75 µL tampon ekleyin. Pipet ucunu eleğe doğru bastırırken, indüklenmiş hücrelerden 25 µL'sini kapaktaki çözeltiye ekleyin. Birleştirilmiş çözeltinin tamamını süzgeçten geçirin.

Süzgeç kapağını aşağı bastırın ve tüpü vorteksleyin. Koleksiyon tüplerini, 200 µL minus hiss veya minus lube ortamı ile doldurulmuş 1,6 ml'lik fendor tüpleri şeklinde hazırlayın. Hücre ayırıcıyı çalıştırın ve ayarları üretici kılavuzuna göre düzenleyin.

Besiyerinin çeperleri kaplaması için toplama tüplerini vorteksleyin. Hücreleri hücre ayıklayıcıya yüklemeden önce hücrelerin bulunduğu tüpü de vorteksleyin. Numunenin akış sitometrisi verilerini elde edin.

GFP içermeyen bir suş negatif kontrol olarak kullanılabilir. Yüksek GFP yoğunluğu gösterebilen hücre agregatlarından kaçınmak için ayıklama kapılarını (gates) çizin. Puls genişliği ve puls yüksekliği grafiği veya FSC alanı ve FSC yüksekliği grafiği kullanarak, ileri saçılım (FSC) için orantısız derecede büyük puls genişliğine veya alanına sahip uç değerleri ayıklayın.

Hücre agregatları için yüksek FSC beklenildiğinden, sadece FSC'nin alt %20'lik kısmındaki hücreleri alın. Hücre döküntülerinin sıklıkla bulunduğu, FSC ve yan saçılım veya SSC için en düşük değerlerin olduğu bölgelerden kaçının. SSC ve GFP sinyali genellikle pozitif korelasyon gösterir.

Hücrelerin daha yüksek SSC değerine sahip olacak şekilde zenginleştirilmesini önlemek için, GFP yoğunluğu ve SSC grafiğini kullanarak popülasyonun çevresi boyunca bir kapı (gate) çizin; böylece SSC ekseni boyunca her noktadan en parlak hücrelerin benzer bir yüzdesini toplu olarak alın. Bu adımdan önce FSC ve SSC kapıları kullanılarak seçilen alt popülasyonun %0,1 ila %1'i sıralama için işaretlenmeli ve toplama tüpüne 200 hücre sıralanmalıdır. Sıralanan hücrelerin besiyeri ile kaplanması için toplama tüpünü vorteksleyin ve plakaya ekleyin.

Genotipleme için A-Y-P-D-A plakası üzerindeki bir grup hücre. İnkübasyonu takiben plakayı iki gün boyunca 30 °C'de inkübe edin. Yaklaşık 12 koloni için lizat hazırlayın.

Genotipleme için yazılı protokolde belirtilen adımları takip edin. Seyreltilmiş lizattan bir mikrolitreyi, ileri primer kullanarak 10 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu ile analiz edin. Bu 10, tüm delesyon lokusları içinde bağlanan ortak bir primer ile eşleşmiş, silinen her genin yukarı akış flanke bölgesine bağlanır.

PCR, amplifikasyonun ardından 96 veya 384 kuyucuklu formatta gerçekleştirilebilir. PCR ürünlerini elektroforez kullanarak analiz edin.

İstenen genotiplere sahip olma olasılığı yüksek olan haploipleri belirleyin. Bu suşları taze bir plakada üretin. Ayrıca bunları %25 gliserol içerisinde -80 °C'de dondurarak saklayın.

Silinen genler için vahşi tip dizilerin yokluğunun doğrulanması ve alan jel elektroforezi sonrası işlemler gibi ek testler önerilir. Yararlı suşlarla seksüel döngü tekrarlanır. İki suşun çaprazlamasından elde edilen haplo progenilerin GFP ekspreslemesi indüklenmiştir.

Her gen delesyonu bir GFP kaseti içeriyordu; bir akış sitometresi kullanılarak kapılar (gates) yardımıyla ortaya çıkan hücrelerin bir popülasyonu seçildi. Bu popülasyonun kalıntı veya hücre agregatları içerme olasılığı düşüktür. Hücrelerin en parlak %1'lik kısmı, ileri saçılım alanı (forward scatter area) ve ileri saçılım yüksekliğine (forward scatter height) göre kapılama yapılarak ayrıştırıldı ve tutuldu.

Orantısız derecede büyük ileri saçılma (forward scatter) alanına sahip olma eğiliminde olan hücre agregaları dışlanmış veya ileri saçılma ve yan saçılma (side scatter) temelinde kapılama (gating) yapılarak ileri saçılmanın en alt %20'sindeki hücreler kabul edilmiştir; bu sırada yan saçılma ve GFP sinyali temelinde kapılama yapılarak en düşük ileri saçılma ve yan saçılmaya sahip kalıntılar dışlanmıştır. Belirli bir yan saçılma aralığındaki hücreler arasından daha floresan olanlar, miyotik karışımın ve GFP eksprese etmeyen negatif kontrol örneğinin karşılaştırılmasına izin vermek için alınmıştır. P3 popülasyonunu seçmek için kullanılanla aynı olan AG, diyagramda gösterilmiştir. Negatif kontrolün benzer şekilde seçilen hücreleri ayrı haploslarda, GFP eksprese etmeleri için indüklendikten ve floresansa göre sıralandıktan sonra PCR ile analiz edilmiştir. Rastgele ayrılma sonucunda sıralanmamış bir hücre için beklenen delesyon sayısı 7,5 idi.

Bu özel deneyde, ayrıştırılmış hücrelerin ortalama delesyon sayısı 8,8 ± 0,3 olarak belirlenmiş olup, buna 10 delesyon içeren beş hücre dahildir. DO genotipi. Ayrıştırılmış suşların PCL işlemi, bir ters primer kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Bu primer, ileri primerle eşleşen aşağı akış yönündeki flaking bölgesine bağlanır. Diğer primer ise kasetin sonuna bağlanır. Bir bandın oluşması, GFP kasetinin varlığını gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, mayada delesyonlar oluşturmak için green Monster Yöntemi'nin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.