Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan proteini bildirilen bir gen ile işaretlenmiş çoklu delesyonlar taşıyan maya suşları oluşturmaktır. Bu, ilk olarak, her biri hedef genlerden birinin yerine bir GFP silme kaseti taşıyan, profesyonel canavarlar olarak adlandırılan haplo tek mutantların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, pro canavar suşlarında da bulunan GM araç seti A ve GM araç seti alfa olarak adlandırılan iki set diploid ve haplo seçim markörü kullanarak maya suşlarının çiftleşmesi ve porion yoluyla delesyonları sıralamaktır.

Daha sonra, iki delesyon taşıyan suşları zenginleştirmek için akış sitometrisi kullanılarak miyotik popülasyondan yüksek derecede floresan hücreler seçilir. Son adım, sıralanan suşların genotiplerini doğrulamaktır. Sonuç olarak, ortaya çıkan suşlarla başlayarak, tekrarlanan çiftleşme sasyonu ve akış sitometrik zenginleştirme turları, daha yüksek orum çoklu delesyon suşlarının oluşumuna yol açar.

Bu tekniğin, işaretleyici yeniden kullanımı ve sıralı gen delesyonu için G yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, döngü başına çoklu delesyonların elde edilebilmesi ve bunun sonucunda çoklu mutantların daha hızlı bir şekilde birleştirilebilmesidir Bu videoya eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı gibi pro canavarların neslinin ardından, 1.6 mililitrelik bir eend orph tüpünde yerleşik pro monster GFP delesyon suşlarının kültürlerini hazırlayarak cinsel döngüye başlar. Delesyon hazırlayın, 100 mikrolitre sentetik tam ortamda A tipi çiftleşmenin suşu, eksi ortamı olarak adlandırılan histamin içermez. Ayrıca, hava değişimi için 1.6 mililitrelik bir eend orph tüpünde lösin veya eksi lu ortamı içermeyen 100 mikrolitre sentetik tam ortamda eşleşen alfa tipi delesyon suşunu hazırlayın.

% 70 etanol ile muamele edilmiş bir itme pimi kullanarak tüplerin kapaklarında delikler açın. Tüpleri gece boyunca 30 santigrat derecede yatay olarak döndürün. Dönme ekseninin, borunun uzunlamasına eksenine paralel olması gerekir.

Optik yoğunluktan tahmin, 1.6 mililitrelik bir einor tüpünde kabaca 250.000 a haplo hücresi ve 250.000 alfa haplo hücresi GFP delesyon suşunu karıştırdı. Bu hücre sayısı genellikle her gece boyunca kültür girdabının yedi mikrolitresine karşılık gelir. Hücreler, önce iki dakika boyunca 800 G'de santrifüjleyerek bu hücreleri yapmaya devam eder.

Supinatı çıkardıktan sonra,% 70 etanol ile muamele edilmiş bir itme pimi kullanarak kapakta bir delik açın. Hava değişimine izin vermek için, kazancınızı beş dakika boyunca 800 G'de hızlı bir vorteks santrifüjünün ardından 50 mikrolitre YPDA ortamı ekleyin. Ardından tüpü boş bir uç kutusu, küçük bir uç standı ve ıslak bir kağıt havlu ile oluşturulan nemli bir kutuya yerleştirin.

Kutuyu gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Çiftleşme karışımının 10 mikrolitresini, antibiyotikler G 4 1 8 içeren agar olmadan 500 mikrolitre GNA ortamına aktarın ve gevşetilmiş bir kapağı olan beş mililitrelik bir kültür tüpünde nat, başlangıç optik yoğunluğu 600 nanometreye sahiptir, kabaca 0.1'dir. Kültürü 24 saat boyunca 30 santigrat derecede döndürün.

Bu, diploidlerin seçimine izin verir, çünkü yalnızca her ikisini de içeren diploidler GM araç seti A'da MX dört ve nat MX dört olabilir. GM araç setinde Alfa, G dört 18 ve Nat varlığında büyüyebilir, bir günlük kültürün 20 mikrolitresini G dört 18 ve ağ içeren 500 mikrolitre taze GN ortamına aktarabilir. 600 nanometrede başlangıç optik yoğunluğu kabaca 0.2'dir.

Hücreleri günlük fazına getirmek için tüpü beş saat boyunca 30 santigrat derecede döndürün. S, diploidleri ilişkilendirmek ve sporları izole etmek. Yazılı protokolde belirtilen prosedürü izleyin.

SPO ile ilgili hücrelerin süspansiyonunu iki adet 300 mikrolitrelik parçaya bölmeye devam edin ve her birini ayrı bir 1.5 mililitrelik eend orph tüpüne koyun. Tüpleri 800 G'de beş dakika santrifüjleyin. S süpernatantının çıkarılmasının ardından, her tüpün kapağında bir delik açın.

Bir itme pimi kullanarak, bir tüpün peletine 100 mikrolitre eksi ortamını ekleyin. Diğer tüpün PT'sine bir haplos seçmek için 100 mikrolitre eksi tuvalet ortamı ekleyin. Alfa haplos'u seçmek için.

Tüpleri gece boyunca 30 santigrat derecede döndürün. 600 nanometredeki nihai optik yoğunluk 0,5'ten az olmalıdır. 600 nanometrede optik yoğunluk oda sıcaklığında çok yüksek triol olma eğilimindedir.

GFP'yi indüklemek için, farklı suşlara mililitre başına 20 mikrogram, doksisiklin içeren 100 mikrolitre taze eksi tıslama veya eksi LU ortamı ekleyin. Son doksisiklin konsantrasyonu mililitre başına 10 mikrogramdır. Tüpü girdaplayın ve iki gün boyunca 30 santigrat derecede döndürün.

Akış sitometrisine başlamak için, beş mililitrelik bir polipropilen tüpe 900 mikrolitre önceden filtrelenmiş TE tamponu ekleyin, kapak beş mililitrelik bir polistiren tüpten bir hücre süzgeci kapağı ile değiştirilmiştir. Polipropilen tüpler akış sitometrisi için uygundur. Süzgeç kapağı, büyük parçacıkları çıkarmak için arzu edilir.

75 mikrolitre tamponu yavaşça hücre süzgeci kapağına yerleştirin. İndüklenen hücrelerden 25 mikrolitreyi, perpenin ucunu ve ağa doğru bastırırken kapaktaki çözeltiye ekleyin. Birleştirilmiş çözeltinin tamamını süzgeçten geçirin.

Süzgeç kapağını aşağı bastırın ve tüpü girdaplayın. Toplama tüplerini hazırlayın: 200 mikrolitre eksi tıslama veya eksi yağlama ortamı ile doldurulmuş 1.6 mililitre fendor tüpleri. Hücre sıralayıcıyı başlatın ve ayarları üreticinin kılavuzuna göre yapın.

Duvarı ortamla kaplamak için toplama tüplerini girdaplayın. Ayrıca, hücre sıralayıcıya yüklemeden önce hücreleri içeren tüpü girdaplayın. Numunenin akış sitometrisi verilerini alın.

GFP'siz bir suş negatif bir kontrol olabilir. Yüksek GFP yoğunluğu sergileyebilecek hücre agregalarını önlemek için sıralama için kapılar çizin. Orantısız derecede büyük darbe genişliğine veya ileri saçılma kısaltılmış FSC alanına sahip aykırı değerleri, darbe genişliği ve darbe yüksekliği grafiği veya FSC alanı ve FSC yüksekliği grafiği kullanarak atın.

Hücre agregaları için büyük FSC beklendiğinden, FSC'de yalnızca daha düşük %20'lik hücreleri alır. FSC ve yan saçılma veya hücre kalıntılarının sıklıkla bulunduğu SSC için en düşük değerlere sahip bölgelerden kaçının. SSC ve GFP sinyali genellikle pozitif korelasyon gösterir.

Hücreleri daha yüksek bir SSC değeri ile zenginleştirmekten kaçınmak için, SSC ekseni boyunca her noktadan en parlak hücrelerin benzer bir yüzdesini almak için bir GFP yoğunluğu ve SSC grafiği kullanarak popülasyonun çevresi boyunca bir kapı çizin. Bu adımdan önce FSC ve SSC kapıları kullanılarak seçilen alt popülasyonun %0,1 ila %1'i, sıralama 200'ü toplama tüpüne sıralamak için işaretlenmelidir. Sıralanmış hücreleri orta plaka ile kaplamak için toplama tüpünü girdaplayın.

Genotipleme için A-Y-P-D-A plakası üzerindeki bir hücre alt kümesi. Plakayı inkübasyondan sonra iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Yaklaşık 12 koloni için bir lizat yapın.

Genotipleme için yazılı protokolde belirtilen adımları takip etmek. İleri bir primer ile 10 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu kullanarak seyreltilmiş bir lizatın bir mikrolitresini analiz edin. Bu 10, silinen her genin yukarı akış yan bölgesine diz çöker, 10'un tüm delesyon lokusları içinde diz çöktüğü ortak bir primer ile eşleştirilir.

PCR 96 veya 3 84'te yapılabilir. Amplifikasyonu takiben iyi format. PCR ürünlerini elektroforez kullanarak analiz edin.

İstenilen genotiplere sahip olması muhtemel haploları tanımlayın. Bu suşları taze bir tabağa koyun. Ayrıca eksi 80 santigrat derecede% 25 gliserol içinde dondurun.

Silinen genler için vahşi tip dizilerin yokluğunun doğrulanması ve alan sonrası jel elektroforezi gibi ek testler önerilir. Yararlı suşlarla cinsel döngüyü tekrarlayın. İki suşun çaprazlamasından elde edilen Haplo dölleri, GFP'yi eksprese etmek için indüklendi.

Her gen delesyonunun bir akış sitometresi ile kapılar kullanılarak bir GFP kaseti vardı, elde edilen hücrelerin bir popülasyonu seçildi. Bunun, bu popülasyon içinde enkaz veya hücre agregaları içermesi olası değildir. Hücrelerin en parlak %1'i, ileri saçılma alanı ve ileri saçılma yüksekliğine göre geçit hücreleri tarafından sıralandı ve tutuldu.

Orantısız bir şekilde büyük ileri saçılma alanına sahip olma eğiliminde olan veya ileri saçılmada daha düşük %20'lik kısımda ileri saçılma ve yan saçılma hücreleri temelinde geçit hücreleri tarafından dışlanan hücre agregaları kabul edilirken, en düşük ileri saçılma ve yan saçılmaya sahip gün döküntüleri hariç tutuldu, hücreler yan saçılma ve GFP sinyali temelinde geçitlenerek, miyotik karışımın karşılaştırılmasına izin vermek için belirli bir yan saçılma aralığındakiler arasında daha fazla floresan hücre alındı ve P üç popülasyonunu seçmek için kullanılanla aynı GFPA GA'yı ifade etmeyen negatif kontrol numunesi diyagramda gösterilmiştir. Negatif kontrolün benzer şekilde seçilen hücreleri için, ayrı bir haplos, GFP'yi eksprese etmek için indüklendikten ve floresansa göre sıralandıktan sonra PCR ile analiz edildi. Rastgele ayrışmadan kaynaklanan sıralanmamış bir hücre için beklenen silme sayısı 7,5 idi.

Bu özel deneyde, sıralanan hücreler, 10 delesyon içeren beş hücre dahil olmak üzere ortalama 8.8 artı veya eksi 0.3 silme sayısına sahipti. DO genotipi. Sıralanan PCL suşları bir ters primer kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu 10, ileri bir astar ile eşleştirilmiş aşağı akış kanat bölgesine diz çöker. O 10 kasetin sonuna diz çöker. Bir bandın varlığı, GFP kasetinin varlığını gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, mayadaki delesyonları tasarlamak için yeşil Canavar Yönteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.