Name: Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Öğrenin, Green Monster yöntemiyle maya suşlarında çoklu gen delesyonlarını GFP işaretleyicisi kullanarak nasıl oluşturulacağını. Akış sitometrisiyle floresan hücreleri zenginleştirerek genetik mühendisliği çalışmalarını hızlandırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma FPRFPR için YS, rsl Alfred P. Sloan Vakfı tarafından sağlanan hibe ve Sağlık hibe US National Institutes R01 HG003224 ve R21 CA130266 için ABD Savunma Bakanlığı İleri Araştırma Projeleri Ajansı sözleşme N66001-12-C-4039 tarafından desteklenen oldu Ayrıca İleri Araştırma Kanada Enstitüsü bir burs ile ve Kanada Mükemmellik Araştırma Sandalyeler program tarafından desteklenmektedir.

1. ProMonsters Üretimi <ol><li> Bir Teto 2-GFP işaretleyici ve dizileri ile primerler kullanılarak plazmid pYOGM012 (ampisilin direnci) dan URA3 işareti yükselterek evrensel GFP yedek kaset hazırlayın: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG ve GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (kalın bölgeler hedeflenen değiştirme sağlayarak KanMX4 kaset komşu bölgelere homoloji sağlamak). PCR reaksiyonu Phusion polimeraz, HF tampon, ve 0.5 ng / ml &#39;den, şablon DNA konsantrasyonu ile başlayarak% 3 dimetil sülfoksit (New England Biolabs) ile yapılmalıdır. PCR programı 98 10 sn 30 sn ve 98 ° C 35 döngüleri ° C, 49 ° 30 sn için C ve 1.5 dakika boyunca 72 ° C&#39;dir. Reaksiyon hacim, her bir deney için yeterli dönüşüm DNA sağlamak için&gt; 50 ul olmalıdır. Biz arındırmakSütun başına işlemden PCR reaksiyon ~ 50 ul ile bir QIAquick PCR saflaştırma kiti (Qiagen) kullanılarak, fakat saflaştırma adımı atlama ürün transformantlar verimini artırır. Alternatif olarak, kısıtlama enzimi EcoRI (New England Biolabs) kullanarak, plazmid pYOGM057 (ampisilin direnci) ile sindirerek, hedefleme Teto 2-GFP ve KanMX4 için homolog URA3 belirteçler, hem de bölgeler içeren bir parça serbest bırakın. Bu reaksiyon için DNA konsantrasyonu yaklaşık 30 ng / ul olması gerekir. Reaksiyon hacmi&gt; 34 ul olmalıdır. KanMX4 başka bir bölgeye GFP kaset entegre etmek için, uygun homolog dizileri yukarıdaki PCR primerleri, bir homoloji bölgesi ayarlayın. </li><li> Evrensel GFP silme kaset ile KanMX4 maya nakavt koleksiyonu 12 bir bir-haploid zorlanma Transform. Woods ve Gietz 13 .34 ul protokolü takibenDNA örneği (arıtılmış PCR ürünleri ya da non-saflaştırılmış kısıtlama digest) her bir deney için dönüşüm kullanılır. Levha bir CAA-Ura plaka üzerine dönüşüm karışımının beşincisi (% 0.67 maya azot baz,% 2 glikoz,% 0.6 casamino asit,% 0.0025 adenin hemisulfate,% 0.005 triptofan ve% 2 agar). </li><li> Izole koloniler elde etmek için taze CAA-Ura plaka transformantlar dışarı Streak. </li><li> Büyüme eksikliği teyit etmek için 200 ug / ml G418 içeren bir YPDA plaka üzerine bir koloniden hücre transfer edin. (1.9) koloni PCR işlemi gerçekleştirmek için - Başarılı GFP entegrasyonu onaylamak için, adımları (1.5) izleyin. </li><li> Bir 0.2-mL PCR tüp veya bir 96-kuyulu plakanın bir kuyu içinde lizis tamponu 2 ul (0.1 M sodyum fosfat, pH 7.4, ZymoResearch 1 birim zymolyase) içine bir koloniden alınan hücreler ekleyin. Bir pipet içinde ve dışında çözüm pipetleme karıştırın. </li><li> Bir P200 Pipetman (Gilson) kullanılarak mineral yağ, bir damla (yaklaşık 20 ul) ile Kaplama. </li><li> 37 ° karışımı inkübe95 dakika sonra 20 ° ve 10 dakika süreyle C&#39;de. </li><li> 50 ul su ile lizat seyreltin. On kez ve çözüm pipetleme karıştırın. </li><li> Yukan doğru komşu bölgeye anneals sıra CCTGAGAAAGCAACCTGACC (kaset başlangıcından itibaren 285 bp), bir astar ile eşleştirilmiş (A) bir ileri primer ile 10 ul PCR reaksiyonları kullanılarak lizat 1 ul, (B), bir ters analiz Astar, sıralı GCATTGGGTCAACAGTATAG (ucundan 375 bp), bir astar ile eşleştirilmiş aşağı bölge için anneals (C) iki dizileri CGTACTCCTGATGATGCATG ve (181 bp) ile GACGAAATACGCGATCGCTG KanMX4 için tavlama primerler, ve (D) iki primer ki hedef geni (Şekil 4) ve vahşi tip sıra ile tavlama. Silme koleksiyonlarında suşların yaklaşık% 8 anöploidi 14 içerdiği bilinmektedir, çünkü (D) çok önemlidir. Doğru bir transformant ile pozitif olması gerekir (A) ve (B), ve negatif ile (C) ve (D). </li><li> Bir tanıtmakTransformatant içine GMToolkit, bir 1.6 ml Eppendorf tüpüne dönüştürülmüş suşundan yaklaşık 250,000 hücre ve ya RY0146 (GMToolkit-a içeren) ya da RY0148 (GMToolkit-α içeren), 250.000 hücre ekleyin. Vortex. RY0146 ve RY0148 bir genotip olan MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5] ve MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4-STE3pr LEU2], sırasıyla. pr organizatörü gösterir. Hücre sayısı, yukarıdaki kültür optik yoğunluk ile tahmin edilir olmalıdır. </li><li> 2 dakika süreyle 800 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı. </li><li> Hava değişimi için izin vermek için,% 70 etanol ile muamele bir raptiye kullanarak kapağı üzerinde bir delik açın. </li><li> YPDA ortamı (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 2 glikoz, ve ağırlıkça% 0.003 &#39;adenin hemisulfat 50 ul eklee). Vortex. </li><li> 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Nemli bir kutuda tüpü yerleştirin. Bu boş bir ipucu kutusu, küçük bir ipucu standı ve ıslak bir kağıt havlu ile oluşturulabilir. </li><li> 30 geceleme kutu inkübe ° C. </li><li> Ilk CAA-Ura plaka hücreleri sürerek evlendirilen diploidlerin seçin. Bir gün için, 30 ° C plaka inkübe edin. </li><li> Diploid seçilmesi için 200 ug / ml G418 içeren YPDA plakalar üzerinde koloniler izole (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 2 glikoz,% 0.003 &#39;adenin hemisulfate ve% 2 agar) yapmak için toplu alanı, iz bunları hücre dışı bırakılması içeren GMToolkit-a ya da 100 ug / ml nourseothricin (Nat) GMToolkit-α içeren diploid seçilmesi için 15. </li><li> 3 gün için 30 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> Izole edilmiş bir koloniden başlayarak, agar olmaksızın GNA ortam 500 ul için en hücrelerin aktarmak (% 1 maya ekstresi,% 3 Difco besin et suyu ve% 5 glükoz; otoklav glikoz ve t geri kalanıO bileşenleri ayrı olarak kapaklı bir 5 ml kültür tüpüne karamelizasyon önlemek için 2 × çözümler) gevşetti. </li><li> 30. az beş saat için yatay olarak tüp döndürme ° C. Dönme ekseni borunun uzunlamasına eksenine paralel olması gerekir. </li><li> Kullanılan bu koloniler onaylayın (1.21) Ura olan + a CAA-Ura plaka üzerinde onları sürerek. </li><li> 2 dakika boyunca 800 xg&#39;de tüp santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Minimal sporlanma orta (; filtresi sterilize% 1 potasyum asetat, 0.005% çinko asetat) 500 ul ekleyin. Vortex. </li><li> 2 dakika boyunca 800 xg&#39;de tüp santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Tekrarlama (1.25) - (1.26) iki kez. </li><li> 7.5 ug / ml lizin, 7.5 ug / ml lösin, 5 ug / ml histidin, 5 ug / ml, metiyonin, ve 1.25 ug / ml urasil (okzotrofik soylar arasında sporlanma oranını artırmak için) ilave edilmiş asgari sporlanma orta 1 ml ekleyin . Vortex. </li><li> Bir gün için oda sıcaklığında tüp döndürün. </li><li> 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de tüp döndürün. </li><li> 2 dakika boyunca 800 x g, 1.6 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde bu karışımdan 125 ul santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Zymolyase çözeltisi (100 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.4, sorbitol 1 M, ve ZymoResearch 2 adet zymolyase) 50 ul ekle. Bir pipet içinde ve dışında çözüm pipetleme karıştırın. </li><li> 1 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> % 0.02 NP-40 50 ul ekle. Bir pipet içinde ve dışında çözüm pipetleme karıştırın. </li><li> Beş dakika için oda sıcaklığında bırakın tüp. </li><li> Su 500 ul ekleyin. </li><li> Buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> Sonifier 450 (Branson) ile 3.2 mm mikrotip kullanarak 15 saniye için 1 çıkış ayarı (zayıf ayar) iki kez bu karışım sonikasyon. Sonikasyon ve iki tur arasında, ~ 0 ° C&#39;ye kadar ısı geri dönmek için buz üzerinde tüp yerleştirmek </li><li> 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de tüpler santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> SC-Ura-His 200 ul ekleyin(A) ya da çapraz-GMToolkit bir ya da GMToolkit-α içeren için olmasına bağlı olarak SC-Ura-Leu (α) ortam. Ortam hazırlamak için, SC-Ura-His-Leu ortam (% 0.67 maya azot baz,% 2 glikoz,% 0.01 &#39;arginin, aspartik asit,% 0.01,% 0.01&#39; glütamik asit, izolösin% 0.01,% 0.01 lisin, metiyonin% 0.01 yapmak ,% 0.01 fenilalanin,% 0.08 serin,% 0.04 treonin,% 0.002 tirozin,% 0.03 valin, 0.0025% adenin,% 0.005 triptofan, 0.003% adenin ve 0.005% triptofan) ve steril histidin veya lösin ile ek Kullanmadan önce % 0.01 nihai konsantrasyonu. </li><li> % 70 etanol ile muamele bir raptiye kullanarak kapağı üzerine bir delik açın. </li><li> 2 gün için 30 ° C &#39;de yatay boru döndürün. Dönme ekseni borunun uzunlamasına eksenine paralel olması gerekir. </li><li> Bir SC-Ura-His veya SC-Ura-Leu agar (yukarıdaki gibi aynı maddeleri artı% 2 agar hücreleri Streak, treonin ve aspartik asit bir süre sonra eklenmesi gerekirutoclaving; ProMonster suşları için izole koloniler yapmak) dökülmeden önce histidin veya lösin ekleyin. </li></ol> 2. Cinsel Bisiklete binme <ol><li> 100 SC-His ul (a) ya da 30 çiftleşme tipine bağlı olarak SC-Leu (α) kurulu bir GFP silme gerginlik bir kültür döndürme ° C de bir gece, 1.6 ml&#39;lik Eppendorf tüpü kullanılarak. Hava değişimi için,% 70 etanol ile tedavi edilen bir raptiye kullanarak bir delik açın. Yatay tüp döndürün. Dönme ekseni borunun uzunlamasına eksenine paralel olması gerekir. Bu topluca çiftleşme yoluyla birden suşları geçmek mümkündür. Sıralanmış bir örnek, doğrudan 2 gün için 30 ° C &#39;de 200 ul Bu amaçla, kültür hücreleri için kullanıldığı zaman. SC-Ura-His-Leu-orta ve histidin (% 0.01) ya da lösin (0.01%): orta hazırlamak için, urasil (0.0025 ile% nihai konsantrasyon) ilave edilir. </li><li> 1.6 ml Eppe 250.000 a-haploid hücrelerin ve GFP silinmesi suşların 250,000 α-haploid hücrelerin Mixndorf tüpü. Vortex. </li><li> (1.17) - aşağıdaki adımları (1.11) tarafından bu hücrelerin çiftleşirler. </li><li> Gevşeyen bir kapak içeren bir 5 ml&#39;lik kültür tüpü içinde 200 ug / ml G418 ve 100 ug / ml Nat ihtiva eden 500 ul ortam GNA ile çiftleşme karışım 10 ul aktarın. Başlangıç ​​OD 600 kabaca 0.1. </li><li> 24 saat süre ile 30 ° C &#39;de kültür döndürün. Tek diploid hem de KanMX4 içeren, çünkü bu diploid bir seçimine olanak tanıyan GMToolkit-a GMToolkit-α ve NatMX4 G418 ve Nat varlığında (Şekil 3) büyüyebilir. </li><li> Ve G418 içeren taze Nat GNA 500 ul için bir günlük kültür 20 ul aktarın. Başlangıç ​​OD 600 kabaca 0.2. </li><li> Log faz (~ 1 OD 600) hücre getirmek için 5 saat boyunca 30 ° C&#39;de tüp döndürün. </li><li> Diploidlerin biçime girdiklerinde ve sporlar izole etmek (1.38) - adımları (1.24) izleyin. </li><li> İki 300-ul içine sporlu hücre süspansiyonu bölmekparça ve ayrı 1.5 ml Eppendorf tüp içine her koydu. </li><li> 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de tüpler santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Bir tüp pelet için, bir-haploidlerin seçmek için SC-His ortam 100 ul ilave edin. Diğer tüp pelet için, α-haploidlerin seçmek için SC-Leu ortam 100 ul ilave edin. </li><li> 30 ° C&#39;da gece boyunca tüp döndürün. Nihai OD 600 0.5 &#39;den daha az olmalıdır. OD 600 çok yüksek olması durumunda, oda sıcaklığında kültüre deneyin. </li><li> GFP indüklemek için, taze SC-His (a) veya 20 ug / ml içeren doksisiklin SC-Leu (α) ortamı. 100 ul ekle Doksisiklin nihai konsantrasyon 10 ug / ml &#39;dir. Vortex. </li><li> 2 gün boyunca 30 ° C&#39;de tüp döndürün. </li></ol> 3. Akış Sitometri <ol><li> Kapak ile birlikte bir 5-ml polipropilen tüp (BD Falcon # 352063) ile 10 ug / ml doksisiklin içeren ön-filtre TE tamponu, 900 ul (pH 7.5) ekleme ile değiştirilir hücre5 ml polistiren tüp süzgeç başlığı (BD Falcon # 352235). Polipropilen tüplere akış sitometrisi için uygundur. Süzgeç kapak büyük partikülleri için tercih edilir. </li><li> Yavaşça hücre-süzgeç kapağı doksisiklin TE tampon 75 ul yerleştirin. </li><li> Kapak üzerinde çözelti ile indüklenen hücre 25 ul ekle. </li><li> Örgü karşı Pipetman ucu basarken, süzgeç vasıtasıyla birleştirilmiş çözeltinin her vur. </li><li> Süzgeçli kap ve vorteks tüpü aşağı doğru bastırın. </li><li> SC-Onun veya SC-Leu 200 ul dolu toplama tüpleri (1.6 ml Eppendorf tüpleri) hazırlayın. </li><li> Hücre sıralayıcı başlatın ve üreticinin kılavuzuna göre ayarlar. </li><li> Vorteks toplama tüpü (mont orta duvara) ve hücre sıralayıcı üzerine yerleştirmeden önce hücreleri içeren tüp hem. </li><li> Örnek akım sitometri verileri edinin. GFP içermeyen A cins bir negatif kontrol edilebilir. </li><li> Sıralama için kapıları çizin. (A)Yüksek GFP yoğunluğu sergilerler ki hücre agrega, önlemek için, FSC yüksekliği arsa ve FSC kullanarak darbe genişliği ve darbe yükseklik MoFlo sıralayıcı veya orantısız küçük FSC yükseklikte bir komplo kullanarak ileri saçılım (FSC) için orantısız büyük darbe genişliği ile sapan atmak FACSAria sıralayıcı (Şekil 5, sol üst panel) alanı. (B) büyük FSC (bölge) hücre agregatları için beklendiği için, en düşük FSC ve yan saçılma (SSC) hücre artıkları sık sık bulunan değerlere sahip bölgeler kaçınarak sadece FSC, daha düşük% 20 hücreleri alır (Şekil 5, sağ üst panel). (C) SSC (bölge) ve GFP sinyali (bölge) genellikle pozitif bir korelasyon vardır. Sadece yukarıda verilen giriş kapıları parlak hücrelerin alma için de yüksek bir değer SSC olan hücreler için zenginleştirmek ki, her bir nokta en parlak hücrelerin benzer bir yüzdesi almak için GFP yoğunluk ve SSC, bir arsa kullanılarak nüfusun çevresi boyunca bir geçit çekmek SSC ekseni (Şekil 5, Bott arasında) diyagramı om-sol. (C) olarak seçilmiş nüfus (B) &#39;de seçilen nüfusun% 0.1-1 olması gerekir. </li><li> (3.10) deki kriterlere verilen toplama tüpüne 200 hücre sıralayın. Gerektiği gibi topluca süreci için veya daha karmaşık bir nüfus gerektiren diğer projeler için, daha fazla hücre sıralayabilirsiniz. </li><li> Vorteks toplama tüpü orta kriteri hücreleri kapsayacak. </li><li> Levha genotipleme için bir YPDA plaka üzerinde hücrelerinin bir alt kümesi (örneğin, 50 hücreleri). </li><li> 2 gün boyunca, 30 ° C plaka inkübe edin. </li><li> (1.8) - adımları (1.5) takip ~ 12 sömürgeler için bir lizat olun. </li><li> Nazikçe ucu ile plaka dokunarak G418 ve Nat içeren bir YPDA plaka üzerinde bir nokta için kullanılan ucu (1.5) üzerinde kalan hücreler aktarın. Seçilmiş haploidlerin Bu plaka üzerinde büyümesini değil. Diploid daha GFP kopya sahip olabilir ve bu nedenle daha parlak olabilir. Bu test haploid seçimi verimliliği gösterebilir. </li><li> Genotipleme için, 10-ul PCR r kullanarak lizat 1 ul analizdizisi CCTGAGAAAGCAACCTGACC bir astar ile eşleştirilmiş Silinen her genin memba komşu bölgeye anneals bir ileri astar ile eaction. Multiplex PCR reaksiyonları mümkünse (koşulların tek mutantlar lizatları kullanılarak tespit edilebilir). Ya da 384-kuyucuklu biçim - PCR, 96 içinde yapılabilir. Bu ikinci biçim az 5 ul&#39;lik reaksiyon hacmi için uygundur. PCR usta Arraying primerler ve bu karışımları ile hücre lizatları ayrıca bir çok kanallı bir pipet ya da bir sıvı taşıma robot ile gerçekleştirilebilir farklılaşan bir araya getirmektedir. Farklı PCR karışımları ile aynı lizat eklerken kriteri değişiklikler isteğe bağlıdır. </li><li> PCR ürünleri analiz edin. Jel XL Ultra V-2 elektroforez sistemi (Labnet) çok kanallı pipetler kullanılarak numune yükleme ile uyumludur. </li><li> Bilgi (3.16) ve (3.18) göre, genotipler istenen var olasılıkla haploidlerin tespit. </li><li> Taze bir tabak (YPDA, CAA-Ura, ya SC-Ura-His/Leu) bu suşların oluşturulması. Ayrıca, bunları dondurmak-80 Az% 25 gliserol ° C. Bu silinen genler ve pulsed-field jel elektroforezi için vahşi tip dizilerinin yokluğu onayı gibi ek testler önerilmektedir. </li><li> Kullanışlı suşları ile cinsel bisiklet (2.1) tekrarlayın. </li></ol>

<ol><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117(2001).</li>
<li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li>
<li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li>
<li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li>
<li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519(1996).</li>
<li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome%3A+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li>
<li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li>
<li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+%28TREC%29%3A+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li>
<li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li>
<li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li>
<li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962(2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz Yeşil Canavar yaklaşım geliştirdi olarak, genom düzenlenmesi giden, farklı GFP yedek kasetler arasındaki rekombinasyon olasılığı ile ilgiliydi. Bu olasılığa karşı Azaltıcı başarıyla çiftleşme ve mayoz çok sayıda mermi geçirmiş hücreleri için bizim seçimdir. Düzenlenmeyecek genomları taşıyan hücreler özdeş düzenlenmesi olmadan hücrelerine çiftleşme sonrası daha az uyumlu olması beklenmektedir. Nitekim, biz GFP kasetler 11 arasındaki rekombinasyon kaynaklanan herhangi bir genom istikrarsızlık dikkat etmedi....

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ya da cihazın adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> (0.2 mikron filtre) suda çözülür ve filtre sterilize. Stok konsantrasyon: 200 mg / ml idi. 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> (0.2 mikron filtre) suda çözülür ve filtre sterilize. Stok konsantrasyon: 100 mg / ml idi. 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> Doksisiklin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> (0.2 mikron filtre)% 50 etanol içinde çözülür ve filtre sterilize. Stok konsantrasyon: 10 mg / ml idi. Dört haftada taze olun. 4 de alüminyum folyo ve mağaza kullanarak ışıktan Kalkanı ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco maya azot baz w / o amino asitler </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (tüpler için döndürücü) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Jel XL elektroforez ünitesi </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 Microtip </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria hücre sıralayıcı </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo hücre sıralayıcı </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX veya eşdeğeri robot </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> İsteğe bağlı. Genotipleme PCRlar kurmak için. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

Çoklu gen delesyonlar taşıma maya suşlarında nesil için yeşil canavar süreci

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Bir gen delesyonu için fenotipleri sık mutasyon belirli bir genetik arka plan veya çevre koşulu 1,2 test olduğunda ortaya çıkar. Birçok gen gizli gen fonksiyonlarının 3,4 maskesini düşürmeye silinmesi gerekir örnekleri vardır. Önemli buluşlar için potansiyeline rağmen, üç veya daha fazla geni içeren genetik etkileşimler büyük oranda araştırılmamıştır. Multi-mutant etkileşimleri kapsayan taramalar delesyonlar olası kombinasyonların çokluğu nedeniyle pratik olmaz. Bununla birlikte, böyle bir ortak işlev şekilde daha büyük bir önsel şans ile paraloglarına setleri gibi genler, seçilmiş kümelerinin çalışmalar bilgilendirici olacaktır. Mayası Saccharomyces cerevisiae, gen nakavt homolog rekombinasyon yoluyla, seçilebilir bir işaretleyici gen ile değiştirilmesi ile gerçekleştirilir. Belirteçlerinin sayısı sınırlı olduğundan, yöntemler sam kaldırılması ve yeniden kullanmak için geliştirilmiştir<html> e işaretleyici 5,6,7,8,9,10. Zaman elde edilmesi için silme sayısı ile doğrusal ölçekler gereken Bununla birlikte, bu yöntemler kullanılarak ardışık olarak çoklu mutasyonlarla mühendislik zaman alıcıdır. Burada rutin maya 11 birden silme mühendisliği için Yeşil Canavar yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemde, silmeler içine entegre bir yeşil flöresanlı protein (GFP) raportör her bir suş içinde yer silme sayısı (Şekil 1) &#39;e göre kantitatif etiket suşları için kullanılır. Maya çiftleşme ve mayoz ile GFP işaretlenmiş delesyonlar ürün yelpazesine Tekrarlanan mermi suşlarında delesyonlar birikimi (Şekil 2) neden bu delesyonlar fazla taşıyan suşlarının akış sitometrik zenginleştirme ile birleştiğinde. , Tur başına bir veya daha fazla silme içeren her işlem ile paralel olarak çoklu süreçleri Sahne suşu yapımı için gereken süreyi azaltır. content &quot;&gt; İlk adım haploit tek mutantlar adlandırdığı hazırlamaktır &#39;ProMonsters,&#39; bir GFP silinmiş bir odağı muhabiri ve &#39;araç birini taşıyan her biri lokus-Ya Yeşil Canavar GMToolkit-Bir ya GMToolkit-α .. can1Δ yerinin (Şekil 3) maya silme toplama 12 den suşu kullanılarak, GFP-işaretli silmeler uygun bir evrensel GFP ile bu suşların içinde mevcut ortak KanMX4 kaset değiştirerek elde edilebilir - URA3 fragmanı her GMToolkit içerir: bir ya da - ya da α-çiftleşme-tipi-spesifik haploid seçim işaretleyici her ikisi de 1 ve tam olarak GMToolkits mevcut olduğunda, toplu olarak diploid seçimine izin veren, bu iki belirteçlerinden biri. İkinci adım, silme loci rasgele yelpazesine ve / veya mayotik recomb ile tek bir hücre içinde kombine edilebilir yoluyla cinsel bisiklet gerçekleştirmek için olançiftleşme ve sporlanma her döngüsünde eşlik asÙ.

Dört GFP işaretli delesyonlar (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) taşıyan bir-haploid zorlanma dört delesyonlar taşıyan bir α-haploid zorlanma ile geçti edildiğinde (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), iki silme ile (ycl033cΔ yer042wΔ) iki suş, bir temsilcisi tarafından paylaşılan sonucu elde edilmiştir. Çiftleşme karışımı diploidlerin seçmek için G418 ve Nat içeren YPDA ortamda kültüre edildi. Elde edilen diploid sporlanma ortam içinde kültür edildi. Sporlar zymolyase ted...

Yeşil Canavar yöntemi bir muhabir gen kodlaması yeşil flüoresan protein ile işaretlenmiş birden silme hızlı montaj sağlar. Bu yöntem, tekrarlanan delesyonlar cinsel çeşit döngüleri ve daha fazla silme taşıyan hücrelerin floresan merkezli zenginleştirme yoluyla maya suşu sürüş dayanmaktadır.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Bir gen delesyonuna ait fenotipler, genellikle mutasyon yalnızca belirli bir genetik arka planda veya çevresel koşulda test edildiğinde ortaya çıkar1,2. ...

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan protein raporlayıcı gen ile işaretlenmiş çoklu delesyonlar taşıyan maya suşları üretmektir. Bu işlem, öncelikle her biri hedef genlerden birinin yerine bir GFP delesyon kaseti taşıyan ve "pro monster" olarak adlandırılan haplo tekli mutantların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, pro monster suşlarında da bulunan GM toolkit A ve GM toolkit alpha olarak adlandırılan iki set diploid ve haplo seçici marker kullanılarak, çiftleşme ve mayaların sporülasyonu yoluyla delesyonların sıralanmasıdır.Ardından, iki delesyon taşıyan suşları zenginleştirmek için akış sitometrisi kullanılarak miyotik popülasyondan yüksek floresan gösteren hücreler seçilir. Son adım, sıralanan suşların genotiplerini doğrulamaktır. Nihayetinde, elde edilen suşlarla başlanarak tekrarlanan çiftleşme ve akış sitometrik zenginleştirme döngüleri, daha fazla çoklu delesyon suşlarının oluşturulmasını sağlar.Bu tekniğin, marker yeniden kullanımı ve ardışık gen delesyonu için G yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, döngü başına birden fazla delesyonun elde edilebilmesi ve bunun sonucunda çoklu mutantların daha hızlı bir şekilde birleştirilmesidir. Bu vide

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Burada, gelişmiş gen delesyon verimliliği için Yarrowia lipolytica Po1g suşunun moleküler genetik manipülasyonuna ilişkin yöntemleri rapor ediyoruz. Elde edilen mühendislik ürünü Y. lipolitica suşları, biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalara sahiptir.

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Homolog rekombinasyon yoluyla üretilen gen silme mutantları, gen fonksiyonu çalışmaları için altın standarttır. Silme yapılarının hızlı oluşturulması için OSCAR (Agrobacterium-Rekombinasyona hazır plasmidler'in Bir Adımlı Yapısı) yöntemi anlatılmıştır. Agrobacterium aracılı fungal transformasyon izlenir. Son olarak, fungal transformantlarda gen çıkarılmalarının PCR tabanlı onay yöntemi.

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em&gt; Agrobacterium</em&gt; OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi

Saccharomyces cerevisiae'deki endojen konumlarında histon genlerinde mutasyon oluşturmak için bir strateji sunulmuştur.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Sıralama (RH-seq) ile karşılıklı hemizygosity türler arasındaki bir özellik farkıgenetik temelharita için güçlü bir yeni yöntemdir. Hemizygot havuzları transposon mutagenezi tarafından oluşturulur ve fitness yüksek sıralama boyunca kullanarak rekabetçi büyüme ile izlenir. Elde edilen verilerin analizi, özelliğin altında yatan genleri saptar.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Öğrenin, Green Monster yöntemiyle maya suşlarında çoklu gen delesyonlarını GFP işaretleyicisi kullanarak nasıl oluşturulacağını. Akış sitometrisiyle floresan hücreleri zenginleştirerek genetik mühendisliği çalışmalarını hızlandırın.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Daha fazla video keşfet