Name: Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Öğrenin, mikroglia hücrelerinde mikroRNA ekspresyonunu real-time PCR ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, MSS bağışıklık yanıtlarını ve mikroglia fonksiyonlarını anlamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma NIH R01 NS071039-01A1 araştırma bursu ile desteklenmiştir.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yakın zamanda önemli bir ilgiyi mikroglia ve Nöro ve nörodejenerasyonunun ile ilişkilendirilen birçok patolojilerin bu hücrelerin infiltrasyonu verildi. Ayrıca, bağışıklık ve kanser hücrelerinin farklılaşmasında microRNA rolü önemli ölçüde son birkaç yıl 5,10 içinde büyüdü. Biz önceden normal MSS 7 mikroglia aktive olmayan veya dinlenme fenotip bakım miR-124 rolünü bildirdin, ama mikroglia fenotip ve aktivasyon devlet microRNA diğer türleri rolü keşfedilmeyi beklemektedir. Bu mikroglia özellikle mi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> 7,2-7,4: laboratuar, pH kuru bileşenleri hazırlanabilir </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> 7,2-7,4: laboratuar, pH kuru bileşenleri hazırlanabilir </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11.965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kiti </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> % 100 Percoll 100 ml 10X PBS 10 ml ve Sigma&#39;dan Percoll 90 ml karıştırılması ile hazırlanır. % 70 Percoll 50 ml% 100 Percoll 35 ml karıştırılmasıyla hazırlanır ve 15 ml DMEM % 40 Percoll karıştırma ile 50 ml% 100 Percoll 20 ml ve 1X PBS 30 ml ile hazırlanır </td></tr><tr><td> 35-55 peptid MOG </td><td> AnaSpec A.Ş. </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> Difco </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Boğmaca Toksin </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FCR antikorları bloke </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAb </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Farklı florofor (örneğin AF488) ile kullanılabilir </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Farklı florofor (örneğin APC) ile kullanılabilir </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (% 16) </td><td> EMS A.Ş. </td><td> 15710 </td><td> 1X PBS ile 1:15 sulandırınız </td></tr><tr><td> % 15 TBE-Üre Jel </td><td> Hayat Teknolojileri A.Ş. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan mikroRNA Ters Transkripsiyon Kiti </td><td> Yaşam Teknolojileri A.Ş </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Evrensel PCR Master Mix </td><td> Yaşam Teknolojileri A.Ş </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan mikroRNA Tahliller mmu-miR-124a </td><td> Yaşam Teknolojileri A.Ş </td><td> 4427975 ID 001.182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan mikroRNA Tahliller snoRNA-55 </td><td> Yaşam Teknolojileri A.Ş </td><td> 4427975 ID 001.228 </td><td></td></tr><tr><td> Nükleaz-serbest su </td><td> Yaşam Teknolojileri A.Ş </td><td> AM9937 </td><td> Nükleaz-serbest su </td></tr><tr><td> 384-de net optik reaksiyon plaka </td&gt; <td> Hayat Teknolojileri A.Ş. </td><td> 4309849 </td><td> Farklı real-time PCR aletleri diğer plakalar (örneğin 96 plaka) ile ikame edilebilir </td></tr><tr><td> Dounce homojenizör (15 ml) </td><td> Wheaton Bilim Ürünler. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / cam </td></tr><tr><td> 40 μ naylon hücre süzgecinden </td><td> Şahin </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Büyük santrifüj </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotor çapı 18,5 cm </td></tr><tr><td> Küçük santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotor çapı 6.5 cm </td></tr><tr><td> Real-time PCR Enstrüman </td><td> Hayat Teknolojileri A.Ş. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Diğer araçlar ile ikame edilebilir </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Diğer araçlar ile ikame edilebilir </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Diğer araçlar ile ikame edilebilir </td></tr><tr><td> Nanodrop spektrofotometre </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

normal mss real-time pcr ve nöro sırasında mikroglia içinde microrna tespiti

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) 1 ikamet miyeloid soyunun hücrelerdir. Bu hücreler multipl skleroz (MS) 2 gibi nöro-inflamasyonu ile ilişkili birçok hastalık patolojileri önemli bir rol oynamaktadır. Normal bir MSS mikroglia makrofaj belirteç CD11b ifade ve böyle CD45 olarak aktivasyonu düşük seviyelerde ifade ederek dinlenme fenotip sergilerler. MSS patolojik olaylar sırasında, mikroglia CD45 upregülasyonunun ve diğer belirteçler 3 olarak belirlenmiştir aktive olur. Mikroglia fenotip ve MSS işlevlerini etkileyen faktörler iyi çalışılmıştır değildir. MicroRNA (miRNA&#39;lar) gibi hücre büyümesi ve farklılaşması 4 ve inflamasyon 5 gibi patolojiler gibi birçok normal fizyolojik süreç olarak katılıyor korunmuş molekülleri (~ 22 nükleotid uzunluğunda) büyüyen bir aileyiz. MiRNA&#39;lar bağlayıcı tamamlayıcı dizileri tarafından belli bir hedef genlerin ifade downregulateir mRNA&#39;ların ve makrofajlar 6 ve mikroglia 7 de dahil olmak üzere doğal bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglial fenotipi, biyolojik işlevini tanımlamak ve makrofajların diğer türlerinden mikroglia ayırmak için miRNA aracılı yollarının araştırılması amacıyla, kantitatif MSS yerleşik mikroglia farklı alt grupları özellikle microRNA ifade değerlendirmek için önemlidir. MSS kullarak ölçmek için ortak yöntemler tüm nöronal doku ve in situ hibridizasyon kantitatif PCR içerir. Ancak, bütün doku homojenattan kantitatif PCR nöronal doku hücrelerinin sadece% 5-15 temsil mikroglia miRNA ifadesi değerlendirilmesi, izin vermez. In situ hibridizasyon doku bölümlerini özel hücre tipleri içinde mikroRNA ile ifade değerlendirmesi sağlar, fakat bu yöntem tamamen niceliksel değildir. Bu yazıda, niceliksel ve sens tarifNormal MSS veya deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE), MS için fare modeli kullanılarak nöro-inflamasyonu sırasında izole mikroglia gerçek zamanlı PCR ile miRNA tespiti için itive yöntemi. Açıklanan yöntem, normal MSS veya MS, inme, travmatik yaralanma, Alzheimer hastalığı ve beyin tümörleri gibi çeşitli patolojiler ile ilişkili nöro-inflamasyonu sırasında mikroglia içinde microRNA ifade düzeyini ölçmek için yararlı olacaktır.

Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Mikroglialar, merkezi sinir sisteminde (MSS) yerleşik olan miyeloid soyuna ait hücrelerdir1. Bu hücreler, birçok ... patolojisinde önemli bir rol oynar.

Bu prosedürün genel amacı, mikroglia hücrelerindeki mikro RNA ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle beyin ve spinal kordun diseksiyonu ve ardından merkezi sinir sistemi veya MSS dokusunun homogenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, MSS'den gelen mononükleer hücreler bir Percoll gradyanı ile izole edilir ve ardından mikroglial popülasyon FACS ile tanımlanır.Ardından, mikroglial RNA izole edilir ve örneğin kalitesi analiz edilir. Son olarak, ilgilenilen spesifik mikro RNA için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilir. Nihayetinde, mikroglialarda belirli bir mikro RNA'nın göreceli ekspresyon seviyesini göstermek için delta delta CT yöntemi kullanılabilir.Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, MSS'den yeterli sayıda mononükleer hücre izole edemedikleri veya örneğin miyelin ve hücre debrisi ile kontamine olması nedeniyle zorluk yaşarlar. Her iki durum da düşük kaliteli preparatla sonuçlanır; sırasıyla düşük RNA konsantrasyonuna veya protein kontaminasyonuna yol açar. Prosedür, ben ve vir tarafından gösterilecektir.Tüm farelerin perfüzyonu tamamlandıktan sonra, beyinleri ve omurilikleri çıkarın. Ardından, her seferinde dokulara beş mililitre PBS ekleyerek bir b

detection-micrornas-microglia-real-time-pcr-normal-cns-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Microglia (beynin bağışıklık hücreleri), nanopartiküllerin nörotoksisiteyi nasıl etkilediğini belirlemek için vekil bir biyosensör olarak kullanılır. Nörotoksisiteyi belirlemek için nanopartiküllere mikroglial yanıtı ve hipotalamik nöronların aktive edilmiş mikrogliadan süpernatana maruz kalmasını test etmek için tasarlanmış bir dizi deneyi tarif ediyoruz.

Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Bu makale, retinadaki postsinaptik nokta ve mikroglia hareketliliğini görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini spinning disk konfokal mikroskopisi kullanarak göstermektedir.

Hasta Sare Retinasında Mikroglia Dinamikleri ve Sinapslarla Etkileşimlerin Canlı Görüntülemesi ve Karakterizasyonu

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), kodlama uzmanlığı gerektirmeyen ve immünoflüoresans görüntülerden tek hücreli mikrogliyal morfoloji analizini yarı otomatikleştiren kullanıcı dostu bir analiz hattıdır. Kemirgenlerin lipopolisakkaridi indükleyen nöroinflamasyon modelinde doğrulanan MMPS, aktivasyonla ilişkili morfolojik değişiklikleri tekrarlanabilir şekilde tespit eder ve standart, ölçeklenebilir mikroglial fenotiplemeyi mümkün kılar.

Mikroglial Parametreleri Haritalama Yazılımı (MMPS): Nicel Mikroglia Morfoloji Analizi için Açık Kaynaklı, Kullanıcı Dostu Bir Araç

Öğrenin, mikroglia hücrelerinde mikroRNA ekspresyonunu real-time PCR ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, MSS bağışıklık yanıtlarını ve mikroglia fonksiyonlarını anlamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Daha fazla video keşfet