Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Bu prosedürün genel amacı, mikroglia hücrelerindeki mikro RNA ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle beyin ve spinal kordun diseksiyonu ve ardından merkezi sinir sistemi veya MSS dokusunun homogenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, MSS'den gelen mononükleer hücreler bir Percoll gradyanı ile izole edilir ve ardından mikroglial popülasyon FACS ile tanımlanır.

Ardından, mikroglial RNA izole edilir ve örneğin kalitesi analiz edilir. Son olarak, ilgilenilen spesifik mikro RNA için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilir. Nihayetinde, mikroglialarda belirli bir mikro RNA'nın göreceli ekspresyon seviyesini göstermek için delta delta CT yöntemi kullanılabilir.

Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, MSS'den yeterli sayıda mononükleer hücre izole edemedikleri veya örneğin miyelin ve hücre debrisi ile kontamine olması nedeniyle zorluk yaşarlar. Her iki durum da düşük kaliteli preparatla sonuçlanır; sırasıyla düşük RNA konsantrasyonuna veya protein kontaminasyonuna yol açar. Prosedür, ben ve vir tarafından gösterilecektir.

Tüm farelerin perfüzyonu tamamlandıktan sonra, beyinleri ve omurilikleri çıkarın. Ardından, her seferinde dokulara beş mililitre PBS ekleyerek bir beyin ve bir omuriliği 15 mililitrelik bir doku homogenizatörüne yerleştirin. 10 ila 20 kez hafifçe vurduktan sonra, homojenize edilen örneği 70 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirerek ayrı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve tüpleri dört santigrat derecede 834 ×g hızında beş ila yedi dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatan atıldıktan sonra, iki ila üç fareden elde edilen beyin ve omurilik homojenini beş ila yedi mililitre %70 Percoll içerisinde resüspande edin. Ardından, üzerine yedi mililitre %40 Percoll ekleyin ve Percoll ile hücre çözeltisini 20 °C'de, frenleme olmadan 30 dakika boyunca 850 ×g hızında santrifüjleyin. %70 Percoll tabakasının üstünde yer alan hasarlı hücreleri, miyelin ve debrisleri atın.

Ardından, %70 ve %40'lık Ficoll çözeltileri arasındaki ara yüzeyde bulunan mononükleer hücreleri toplayın ve toplanan hücreleri PBS ile en az bire bir oranda seyreltin. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, peleti yarım mililitre PBS içinde yeniden süspande edin ve 1,7 mililitrelik bir ependorf tüpüne aktarın. Yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılmış hücrelerin 50 mikrolitresini yeni bir 1,7 mililitrelik ependorf tüpüne aktararak başlayın ve tüpe 350 mikrolitre FACS tamponu ekleyin.

Ardından tüpe 5 ila 10 µL anti FCR antikoru ekledikten sonra hücreleri buz üzerinde 10 ila 15 dakika inkübe edin. Hücre örneğini iki Eppendorf tüpüne bölün; tüplerden birine 1 µL anti CD 11 B ve 2 µL anti CD 45 antikoru ekleyin.

Hücreleri buz üzerinde 10 ila 15 dakika daha inkübe edin. İkinci tüpü negatif kontrol olarak etiketleyin ve buz üzerine yerleştirin. Boyama antikorları ile inkübasyondan sonra, her iki tüpe bir mililitre fax tamponu ekleyin ve hücreleri bir mikro santrifüjde 1200 hızında beş dakika boyunca döndürerek çöktürün.

Ardından, peletleri PBS içindeki %1'lik paraformaldehitin 400 mikrolitresinde sabitleyin ve topaklanmayı önlemek için tüpleri vorteksleyin. Son olarak, negatif kontrol hücre örneği ve BD com bead'ler kullanarak hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. EAE'yi indüklemek için, 8-12 haftalık C 57 black six farelerinden oluşan beş ila 10 farelik bir grubu, 4 mg/mL'lik komple Freund adjuvanı içindeki 150 mikrogram MOG 35-55 peptidi ile deri altından immunize ederek başlayın. Daha sonra, sıfırıncı günde ve immunizasyondan iki gün sonra intraperitonal olarak pertussis toksini uygulayın.

Az önce gösterildiği şekilde hücreleri izole edip boyadıktan sonra, sıralama işleminden hemen önce peletleri fiksatif yerine 400 µL PBS içinde süspande edin. Ardından, örnekleri toplamak için iki adet 1,7 mL Eppendorf tüpünü %10 FBS ile desteklenmiş 300 µL PBS ile doldurun. Son olarak, mikroglia ve makrofaj popülasyonlarını, bu temsilci yoğunluk grafiğinde gösterilen kapılama stratejisini kullanarak yüksek saflıkta sıralayın.

Sıralama işleminden sonra, izole edilen hücre örneklerinin saflıklarını belirlemek için mikroglia ve makrofaj popülasyonlarını yeniden analiz edin. Sıralanmış hücre popülasyonlarını bir mikro santrifüjde 1200 ×g hızında beş ila yedi dakika boyunca çöktürdükten sonra, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve hücre peletlerini kuru buz üzerinde dondurun. Ardından, donmuş hücre peletlerini normal buza aktarın.

Çözmek için, Nirvana kitinden 300 microliters lizis tamponu ekleyin ve ardından hücre çözeltisini beş ila yedi kez pipetleyerek nazikçe karıştırın. Daha sonra 30 microliters homojenat katkı maddesi ekleyin, hücre süspansiyonunu 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından tüpleri 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Şimdi 300 microliters asit fenol, kloroform ekleyin ve tüpü 30 saniye daha vorteksleyin.

Ardından, hücreleri 9.500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjledikten sonra, sulu fazı içeren süpernatantın üstteki 300 µL'sini dikkatlice yeni bir 1,7 mL'lik ependorf tüpüne aktarın. Çözeltiyi 375 µL %100 etanol ile karıştırın. Tüpün tüm içeriğini Nirvana kitindeki bir filtre kartuşuna aktarın ve kartuşu 9.500 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, süzülerek akan tampon çözeltiyi atın.

Kartuşu yıkadıktan sonra, Nirvana kitinden 700 µL yıkama solüsyonu 1 ekleyin ve 9.500 ×g hızda bir dakika daha santrifüjleyin. Nirvana kitindeki yıkama solüsyonu 2 ile 500 µL üzerinden iki kez daha tekrarlayın. Kartuşaki RNA'yı 60 µL önceden ısıtılmış nükleaz içermeyen su ile elüe edin.

Son olarak, mikrogliya ve makrofaj örneklerinde mikro RNA saptamak için gerçek zamanlı Q-R-T-P-C-R gerçekleştirdikten sonra, RNA'nın saflığını ve miktarını değerlendirmek için bir NanoDrop spektrofotometresi kullanın. Floresan işaretli mere 1 24 ve snow RNA 55 PCR ürünleri için P-R-T-P-C-R eğrileri, burada ilk grafikte gösterildiği gibi oluşturulabilir. Mikrogliya veya kemik iliği türevli makrofajlardan izole edilen kontrol snow RNA 55 RNA örnekleri için floresan işaretli spesifik PCR ürünlerinin miktarının PCR döngü sayısı ile karşılaştırıldığı tipik eğriler gösterilmektedir.

Farklı hücre popülasyonlarından elde edilen snow RNA 55 ekspresyonu analizine ait CT değerlerinin, grafikte yeşil ve mavi dikey çizgilerle belirtildiği gibi, baz hattının Q-R-T-P-C-R eğrilerinin doğrusal aralığının alt kısmıyla kesiştiği noktada belirlendiğine dikkat edin. Bu ikinci grafikte, mikroglialardan veya kemik iliği kaynaklı makrofajlardan alınan deneysel mere 1 24 RNA örnekleri için floresan işaretli spesifik PCR ürünlerinin miktarı, PCR döngü sayılarına kıyasla gösterilmektedir. Farklı hücre popülasyonlarından mere 1 24 ekspresyonu analizine ait CT değerlerinin de yine, grafikte yeşil ve mavi dikey çizgilerle belirtildiği gibi, baz hattının Q-R-T-P-C-R eğrilerinin doğrusal aralığının alt kısmıyla kesiştiği noktada belirlendiğine dikkat edin.

Bu tabloda gösterilen normal ve EAE farelerinden alınan mikrogliya ve BM dm'lerdeki snow RNA 55 ve mere 1 24 ekspresyonları için olduğu gibi, her bir numune için CT değerleri belirlendikten sonra, her bir numunenin her bir dublikesinin delta CT değerlerini hesaplamak için deneysel mere 1 24 numunesinin CT değerinden kontrol snow RNA 55 numunesinin CT değerini çıkarın. Ardından, delta delta CT değerlerini hesaplamak için diğer numunelerin delta CT değerlerinden referans numunenin delta CT değerini çıkarın. Son olarak, her bir numunenin göreceli ekspresyon düzeyi, bu yoğunluk grafiğinde görüldüğü üzere, iki üzeri eksi delta delta CT olarak hesaplanır.

Normal MSS'den mikrogliaların başarılı bir şekilde izole edildiği durumda, hücrelerin %95 ila %98'i CD 11 B pozitif CD 45 düşük mikrogliaları temsil ederken; hücre süspansiyonunun %2 ila %5'ini CD 11 B pozitif CD 45 yüksek perivasküler makrofajlar, %1'den azını ise CD 11 B negatif CD 45 yüksek lenfositler veya CD 11 B negatif CD 45 negatif astroglialar veya oligodendroglial hücreler ya da hücre fragmanları oluşturacaktır; buna karşın hatalı bir preparasyonda, hücreleri RNA izolasyonu ve ileri analizler için uygunsuz hale getiren astroglia veya miyelin partikülleri gibi CD 11 B negatif CD 45 negatif hücrelerin veya hücre fragmanlarının belirgin bir kontaminasyonu görülür. Ek olarak, yetersiz perfüzyon nedeniyle kan lenfosit kontaminasyonuna işaret eden CD 11 B negatif CD 45 yüksek hücreler de mevcut olabilir. Bu yoğunluk grafiğinde, nöroinflamasyon sırasında MSS'de bulunan üç hücre popülasyonu; CD 11 B pozitif CD 45 düşük mikroglialar, CD 11 B pozitif CD 45 yüksek makrofajlar ve CD 11 B negatif CD 45 yüksek lenfositler gösterilmektedir.

Başarılı ve başarısız bir izolasyon sonrası jel elektroforezi ile belirlenen RNA kalitesi gösterilmiştir. RNA temiz bir şekilde izole edildiğinde, bir RNA merdiveni ve ribozomal RNA belirgindir; izolasyon işlemi kötü gerçekleştirildiğinde ise yayılma (smear) ve düşük moleküler ağırlıklı degredasyon ürünleri görülür. Bu nihai veriler, normal yetişkin mikroglialarda, EAE'li farelerin mikroglialarında ve gelişimin erken aşamalarındaki farelerden izole edilen mikroglialarda mere 1 24 ekspresyonunu kanıtlamaktadır.

Bu ilk sütun grafiğinde, normal MSS kaynaklı mikroglialarda mere 1 24'ün göreceli ekspresyonu, kemik iliği kaynaklı makrofajlar için gözlemlenen değere kıyasla çok daha yüksektir. Benzer şekilde, EAE'li farelerin MSS makrofajlarında mere 1 24 RNA'sında bir artış olsa da, mikroglialar hâlâ beş kat daha fazla miktarda mere 1 24 RNA eksprese etmektedir. Bu son sütun grafiği, prosedür uygulanırken, bir, iki ve dört haftalık farelerin gelişim sürecindeki mikroglialarda mere 1 24 ekspresyon düzeyindeki değişimlerin, yetişkin sekiz haftalık farelerle karşılaştırılarak bu yöntemle nasıl değerlendirilebileceğini göstermektedir.

Tüm deney için iyi sonuçlar garanti edecek, yeterli miktarda ve kaliteli izole edilmiş hücrelere sahip olmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.