Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu videonun amacı, fare kalbinden izole edilen mitokondrilerdeki mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin karakterizasyonuna yönelik bir prosedürü tanımlamaktır. İlk olarak, mitokondriler fare kalplerinden izole edilir.

Diferansiyel santrifügasyon yöntemi kullanılarak izole edilen mitokondrilerin kalitesi, solunum kontrol oranını ölçmek ve mitokondriyal membran bütünlüğünü değerlendirmek amacıyla bir bilgisayara bağlı oksi termal oksijen elektrodu kullanılarak değerlendirilir. Ardından, spektral florometrik cihazlar kullanılarak kalsiyum yönetimi, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal hacmin eş zamanlı ölçümleri, permeabilite geçiş gözenek açılımını belirlemek için kullanılır.

Elde edilen veriler, kalsiyum tutma kapasitesinde ve mitokondriyal geçirgenlik geçişinde farklılıklar göstermiştir. İzole mitokondrilerin düşük hassasiyeti ile mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneğinin açılması, mitokondriyal fizyoloji ve anatomide birkaç düzeyde meydana gelen değişiklikleri içeren karmaşık bir fenomendir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, birden fazla parametrenin aynı anda ölçülmesinin, kalsiyum, mobilizasyon veya şişme gibi tekil parametrelerin tek başına ölçülmesine kıyasla olguya ilişkin daha kapsamlı bir tablo sunmasıdır. Prosedüre başlamadan önce, mitokondri izolasyon tamponunu çözdürün ve pH değerinin 7.4 olduğunu kontrol edin. Ardından, kullanılacak tüm tamponları, kapları ve tüpleri buz üzerine yerleştirin. Mitokondri izolasyon protokolünün tüm adımlarının buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Ötanazi uygulanmış farelerin kalplerini bir Petri kabına yerleştirin ve üzerindeki kanı soğuk mitokondri izolasyon tamponu ile durulayın. Ardından, kalpleri bir bistüri yardımıyla yeni bir Petri kabına aktarın, yağ dokularını ve atriyumları çıkarın, daha sonra homojen bir ürün elde edene kadar kalpleri ince parçalara ayırın.

Doğranmış kalp parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 0,1 miligram/mililitre tripsin içeren 10 mililitre mitokondri izolasyon tamponu ekleyin ve örneğin buz üzerinde 10 dakika boyunca sindirilmesini sağlayın. Tripsin kullanımının, izole edilen mitokondri verimini artırdığını ve mitokondri hazırlıkları arasında sabit tutulması gerektiğini unutmayın.

Buna rağmen, enzimin iyonlarla etkileşime girmediğinden emin olmak için, izole edilmiş mitokondrilerin fonksiyonelliğinin tripsin içermeyen preparatlar üzerinde test edilmesini öneririz. İnkübasyon sonrası, %0,1 yağ asidi içermeyen BSA ve beş miligram tripsin inhibitörü içeren 10 mililitre mitokondri izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tripsini nötralize etmek için, sindirilmiş dokuyu dört derece Celsius'ta bir dakika boyunca düşük ila orta hızda santrifüj ederek geri kazanın.

Santrifüj sonrası resüspansiyon için, numuneyi buz üzerinde tutarak 0,1% yağ asidi içermeyen BSA içeren sekiz mililitre mitokondri izolasyon tamponu içinde süspande edin. Numuneyi 1.200 ila 1.400 RPM hızında, dört ila altı geçişle homojenize etmek için Teflon havanlı motorlu bir Dounce homojenizatörü kullanın. Homojenatı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 800 ×g'de santrifüjleyin.

Çekirdekleri ve doku kalıntılarını çöktürmek için. Santrifüj sonrası, mitokondrileri içeren süpernatantı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 8.000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, peletin üzerinde beyaz bir tabaka oluşacaktır.

Mitokondri pelletinin üzerindeki beyaz tabakayı dikkatlice aspire etmek ve uzaklaştırmak için bir vakum sistemi kullanın. Ardından, mitokondrileri içeren geri kalan daha koyu renkli pelleti bir mililitre mitokondri izolasyon tamponu içinde yeniden süspanse edin.

Ardından mitokondrileri 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve mitokondri peletini 150 µL mitokondri izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin; mitokondrileri buz üzerinde bekletin.

İzole mitokondrilerin solunumu, bir bilgisayara bağlı ve oxy. the plus yazılımı ile kontrol edilen bir oksitermal oksijen elektrodu ile ölçülür. Oksijen elektrodu, deney gününde kalibre edilmelidir. Oksy haznesine, son konsantrasyonu 1 µM rotenon içeren iki mililitre mitokondri solunum tamponu ekleyin, hazneyi kapatın ve oksijen sinyalini kaydetmeye başlayın.

Sistem tarafından kaydedilen ve bilgisayar ekranında görüntülenen sinyal, oxy therm odasındaki oksijen konsantrasyonu ile orantılıdır. Oksijen sinyali stabilize olduğunda, 250 µg mitokondri ekleyin ve bir dakika boyunca bazal respirasyonu kaydedin. Mitokondriler endojen substratlar üzerinden solunum yaptığından, bu noktadaki respirasyon çok düşük olmalıdır.

Bu, durum bir solunumudur. Kompleks iki'de mitokondriyal solunumu başlatmak için beş millimolar nihai konsantrasyona kadar süksinat ekleyin ve sinyali bir dakika boyunca kaydedin. Durum iki solunumu sırasında oksijen tüketimi artmalıdır.

Durum solunumunu indüklemek için, 150 micromolar son konsantrasyona ulaşacak şekilde bir DP ekleyin. Bu noktada, oksidatif fosforilasyon yoluyla gerçekleşen bir TP sentezi nedeniyle oksijen tüketimi artmalıdır. Solunum yavaşlayana kadar sinyali kaydedin; bu durum DP tüketimini ve durum dört solunumu kaydına geçişi gösterir.

Dördüncü aşama, en az bir dakika boyunca solunumdur. Nihai konsantrasyonu bir micromolar olacak şekilde CCCP ekleyin ve sinyali bir dakika boyunca kaydedin. Bu noktada, ayrık solunum maksimum düzeyde olmalıdır.

Durum üç solunumu sırasındaki oksijen tüketim hızını, durum dört solunumu sırasındaki oksijen tüketim hızına bölerek solunumsal kontrol oranını hesaplayın; hedef RCR dört'ten büyük olmalıdır. Ardından, mitokondriyal membran bütünlüğünü değerlendirmek için, yeni bir mitokondri örneğine final konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde DP ekleyerek durum üç solunumunu indükleyin.

Ardından bir dakika boyunca oksijen tüketimini kaydedin, 10 µM sitokrom C ekleyin ve iki ila üç dakika boyunca oksijen tüketimini kaydedin. İyi bir mitokondri preparasyonunda sitokrom C, sağlam mitokondriyal membranlardan geçemediği için solunumda artış olmaz veya çok küçük bir artış olur. Solunumda meydana gelen bir artış, mitokondriyal membranların parçalandığını veya hasar gördüğünü gösterir.

Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin çok parametreli ölçümü için kullanılan cihaz düzeneği, Felix GX programı tarafından bilgisayar kontrollü bir quantum master çift emisyonlu spektroflorimetreden oluşmaktadır. Felix GX programını kullanarak, bir multidi kazanım protokolü oluşturun ve ratiometrik boyalar Forer ve JC-1 için kalsiyum mitokondriyal membran potansiyeli ve şişme ölçüm parametrelerini girin; Forer oranı ve JC-1 oranı için türetilmiş izleri oluşturun. Tek kullanımlık dört taraflı meth ACRL vete'ye, 1 µM rotenon, 5 mM süksinat ve 800 nM Forer nihai konsantrasyonuna sahip 1 mL mitokondri analiz tamponu ekleyin. Her bir kuyucuk için 250 µg mitokondri ekleyin ve örneği spektroflorimetrenin örnek bölmesine yerleştirin.

Bir dakika sonra floresan sinyallerini kaydetmeye başlayın, veri toplama işlemini duraklatın, 500 nanomolar JC-1 ekleyin ve ardından veri toplamayı yeniden başlatın. JC-1 oran sinyali, aktif mitokondriler tarafından boyanın alınmasını belirterek artış göstermelidir. JC-1 sinyali bir platoya ulaşana kadar kaydetmeye devam edin.

Genellikle beş dakika içinde, son konsantrasyonu 20 µM olacak şekilde kalsiyum klorür ekleyin. Analiz tamponundaki kalsiyum varlığındaki artışı temsil eden Fluor FF oran sinyalinde ani bir artış görülmeli, ardından mitokondriyal kalsiyum alımı nedeniyle kademeli bir azalma izlenmelidir. JC one oran sinyali, hafif mitokondriyal membran depolarizasyonuna işaret eden kısa süreli ve geçici bir azalma sergilemelidir.

ER FF oranı sinyali bazal seviyeye döndüğünde, genellikle başka bir 20 micromolar kalsiyum klorür uygulamasından sonra bir ila 1,5 dakika içinde, mitokondriler kalsiyumu biriktiremeyene ve kalsiyumu analiz tamponuna salmaya başlayana kadar sabit aralıklarla darbeler vermeye devam edin. Mitokondriyal permeabilite geçiş gözeneklerinin açılması, kalsiyum salınımı nedeniyle URA FF oranı sinyalindeki eşzamanlı artış ile görselleştirilir. C 56 black six J farelerinden izole edilen mitokondrilerde, membran potansiyelinin çökmesi nedeniyle JC one sinyal oranında bir azalma ve mitokondriyal şişme nedeniyle ışık saçılımında bir azalma görülür.

Bu videoda gösterildiği gibi, ardından süksinat ve ADP varlığında durum üç solunumu sırasında ve burada gösterildiği üzere ADP tüketildikten sonra durum dört solunumu sırasında oksijen tüketimi ölçülmüştür; ADP eklenmesi, oksidatif fosforilasyon nedeniyle oksijen tüketimini artırır ve oksijen tüketimi yavaşlar. Tüm ADP tüketildiğinde, izole mitokondrilerin açımlanmaya verdiği yanıt, CCCP varlığında CCCP eklenerek ölçülür. İzole mitokondrilerin membran bütünlüğünü değerlendirmek için oksijen tüketim hızının durum üç solunumu sırasındakinden daha yüksek olması beklenir.

Oksijen tüketimi, süksinat ve a DP varlığında ve sitokrom C ilavesinden sonra ölçülmüştür. Burada görüldüğü üzere, sitokrom C ilavesinin a DP ve süksinata kıyasla oksijen tüketimini önemli ölçüde artırmaması, sağlam mitokondriyal membranların sitokrom C'ye geçirgen olmadığını göstermektedir; mitokondriyal geçirgenlik geçişini değerlendirmek için izole kalp mitokondrilerinde mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesinin bir göstergesi olarak geçirgenlik gözeneklerinin açılması incelenmiştir. Mitokondriyal geçirgenlik geçişindeki gözenek açılımı, 20 mikromoların ardışık ilaveleriyle tetiklenmiştir.

Kalsiyum klorür, ekstracitoplazmik kalsiyum ve membran potansiyeli rasyometrik indikatörlerle ölçüldü. Yeşil izle gösterilen URA FF ve kırmızı izle gösterilen JC-1 kullanılmıştır; mitokondri şişmesi, siyah izle gösterilen 525 nanometredeki ışık saçılımı kaydedilerek ölçülmüştür. JC-1 ve şişme sinyallerinin özgünlüğü, 1 µM CCCP ve 5 µg/mL mikrobiyal toksin etin ile test edilmiştir; burada görüldüğü üzere, mitokondriler tarafından kalsiyum alımı, mitokondriyal membranın hafif bir depolarizasyonu ile birlikte gerçekleşmektedir.

Dört kalsiyum pulsundan sonra, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılması, kalsiyum salınımını belirten URA FF artışı olarak görülür. Membran potansiyelinin çöktüğünü belirten JC-1 azalması ve mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri açılmasının özgüllüğünü doğrulamak için şişme belirteci olarak görülen ışık saçılımındaki azalma ile karakterize edilen mitokondriyal matriks hacmindeki artış gözlemlenir. Aynı ölçümler, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri bileşeni siklofillin D'ye bağlanan siklosporin A varlığında gerçekleştirilmiştir. Bu şekildete gösterildiği üzere, bir mikromolar siklosporin A varlığı, kontrol örneğine kıyasla mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerini açmak için gereken kalsiyum klorür pulslarının sayısını artırır.

Bu videoyu izledikten sonra, izole kalp mitokondrilerinde mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin açılmasının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürün en zor yönü, yüksek kaliteli izole mitokondriler elde etmektir. Bu nedenle, mitokondrileri ileri deneyler için kullanmadan önce kalite kontrol ölçümlerinin yapılması önemlidir.