Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu videonun amacı, mitokondriyal geçirgenlik geçişini karakterize etmek için bir prosedürü tanımlamaktır. Mitokondride zayıf açıklık, fare kalbinden izole edilmiştir. İlk olarak, mitokondri fare kalplerinden izole edilir.

Diferansiyel santrifüjleme yöntemi kullanılarak, izole edilen mitokondrinin kalitesi daha sonra solunum kontrol oranını ölçmek ve mitokondriyal membran bütünlüğünü değerlendirmek için bir bilgisayara bağlı bir oksi termal oksijen elektrodu kullanılarak değerlendirilir. Daha sonra spektro floro metrik enstrümantasyon kullanılarak, geçirgenlik geçişini belirlemek için kalsiyum işleme, mitokondriyal membran potansiyeli ve mitokondriyal hacmin eşzamanlı ölçümü kullanılır. Kötü açılış.

Elde edilen veriler, kalsiyum tutma kapasitesi ve mitokondriyal geçirgenlik geçişinde farklılıklar gösterdi. İzole mitokondrinin zayıf duyarlılığı, Mitokondriyal geçirgenlik geçişinin açılması. Gözenek, mitokondriyal fizyoloji ve anatomide çeşitli seviyelerde değişiklikleri içeren karmaşık bir fenomendir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, aynı anda birden fazla parametrenin ölçümünün, kalsiyum, mobilizasyon veya şişme gibi tek tek parametrelerin tek başına ölçümünden daha kapsamlı bir fenomen resmi sunmasıdır Prosedüre başlamadan önce, mitokondriyal izolasyon tamponunu çözün ve 7.4 olması gereken pH'ı kontrol edin. Ardından kullanılacak tüm tamponları, tabakları ve tüpleri buz üzerine yerleştirin. Mitokondri izolasyon protokolünün tüm adımlarının buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

Ötenazi uygulanmış farelerin kalplerini bir Petri kabına yerleştirin ve kanı soğuk mitokondri ile durulayın. İzolasyon tamponu. Daha sonra, kalpleri bir bıçak kullanarak yeni bir Petri kabına aktarın, yağı ve kulakçıkları çıkarın, ardından homojen bir ürün elde edilene kadar kalpleri kıyın.

Kıyılmış kalpleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mililitre tripsin başına 0.1 miligram ile 10 mililitre mitokondri izolasyon tamponu ekleyin ve numunenin 10 dakika boyunca buz üzerinde sindirilmesine izin verin. Tripsin kullanımının izole edilmiş mitokondri verimini arttırdığını ve mitokondriyal hazırlık arasında sabit tutulması gerektiğini unutmayın.

Bununla birlikte, enzimin iyonlarına müdahale etmediğinden emin olmak için tripsin yokluğunda elde edilen preparatlar üzerinde izole mitokondrinin işlevselliğini test etmenizi öneririz. İnkübasyondan sonra,% 0.1 yağ asidi içermeyen, BS, a ve beş miligram tripsin inhibitörü içeren 10 mililitre mitokondri izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın Tripsini nötralize etmek için, sindirilmiş dokuyu düşük ila orta hızda geri kazanın. Dört santigrat derece bir dakika santrifüjleme.

Spin Resus'tan sonra, dokuyu %0.1 yağ asidi içermeyen BSA ile sekiz mililitre mitokondri İzolasyon tamponunda askıya alın ve numuneyi buz üzerinde tutun. Numuneyi 1.200 ila 1.400 RPM'de dört ila altı geçişle homojenize etmek için Teflon havaneli motorlu bir dans homojenizatörü kullanın. Homojenatı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 10 dakika dört santigrat derece boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin.

Çekirdekleri ve doku kalıntılarını peletlemek için. Döndürmeyi takiben, mitokondriyi içeren supinatı mikro santrifüj tüplerine geri kazanın ve bunları dört santigrat derece 15 dakika boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, peletin üzerinde beyaz bir tabaka olacaktır.

Mitokondriyal peletin üzerindeki beyaz tabakayı dikkatlice aspire etmek ve çıkarmak için bir vakum sistemi kullanın. Ardından, bir mililitre mitokondride mitokondriyi içeren kalan koyu renkli peleti yeniden süspanse edin. İzolasyon tamponu.

Daha sonra mitokondriyi 10 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleyin. Supinatı atın ve mitokondriyal peleti yeniden süspanse edin. 150 mikrolitre mitokondride, izolasyon tamponu, mitokondriyi buz üzerinde tutun.

İzole edilmiş mitokondrinin solunumu, bir bilgisayara bağlı ve oksi tarafından kontrol edilen bir oksi termal oksijen elektrodu ile ölçülür. Artı yazılım olan oksijen elektrodu deney günü kalibre edilmelidir. Hazneye bir mikromolar rotenonun son konsantrasyonunu içeren iki mililitre mitokondri solunum tamponu ekleyin, hazneyi kapatın ve oksijen sinyalini kaydetmeye başlayın.

Sistem tarafından kaydedilen ve bilgisayar ekranında görüntülenen sinyal, oksi termal odasındaki oksijen konsantrasyonu ile orantılıdır. Oksijen sinyali stabil hale geldiğinde, 250 mikrogram mitokondri ekleyin ve bir dakika boyunca bazal solunumu kaydedin. Mitokondri endojen substratlar üzerinde istekli olduğu için bu noktada solunum çok düşük olmalıdır.

Bu birinci durum solunumudur. İkinci komplekste mitokondriyal solunumu başlatmak için beş milimolar son konsantrasyona süksinat ekleyin ve sinyali bir dakika boyunca kaydedin. İkinci durum solunumu sırasında oksijen tüketimi artmalıdır.

Durum solunumunu indüklemek için, 150 mikromolar nihai konsantrasyona bir DP ekleyin. Bu noktada, oksidatif fosforilasyon yoluyla bir TP sentezi nedeniyle oksijen tüketimi artmalıdır. Solunum yavaşlayana kadar sinyali kaydedin, bu da bir DP tüketimini ve dördüncü durum solunum kaydına geçişi gösterir.

Dördüncü durum, en az bir dakika solunum. CCCP'yi bir mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin ve sinyali bir dakika boyunca kaydedin. Bu noktada, bağlanmamış solunum maksimum olmalıdır.

Üçüncü durum sırasında oksijen tüketim oranını bölerek solunum kontrol oranını hesaplayın. Dördüncü durum sırasında oksijen tüketim oranına göre solunum, solunum hedef RCR'nin dörtten büyük olması gerekir. Daha sonra, mitokondriyal membran bütünlüğünü değerlendirmek için, bir milimolar nihai konsantrasyona bir DP ekleyerek yeni bir mitokondri örneğinde üçüncü durum solunumunu indükleyin.

Ardından oksijen tüketimini bir dakika boyunca kaydedin, 10 mikromolar sitokrom C ekleyin ve oksijen tüketimini iki ila üç dakika boyunca kaydedin. Sitokrom C, iyi bir mitokondriyal preparatta sağlam mitokondriyal zarlara karşı geçirimsiz olduğundan, solunumda herhangi bir artış olmayacak veya çok küçük bir artış olacaktır. Solunumdaki artış, mitokondriyal zarların kırıldığını veya hasar gördüğünü gösterir.

Mitokondriyal geçirgenlik geçiş portu açıklığının çok parametreli ölçümü için enstrümantasyon, Felix GX programı tarafından kontrol edilen bir kuantum ana çift emisyon spektro florimetre bilgisayarından oluşur. Felix GX programını kullanarak, bir multidi edinim protokolü oluşturun ve kalsiyum mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü için parametreleri ve oran metrik boyaları için şişmeyi girin, Forer ve JC one, tek kullanımlık dört taraflı bir metamfetamin ACRL vete karışımında bir oran ve JC bir oran için türetilmiş izleri oluşturur bir mililitre mitokondri tahlil tamponu ile bir mikromolar rotenon nihai konsantrasyonu ile, beş milimolar süksinat ve 800 nanomolar. Bir FF için 250 mikrogram mitokondri ekleyin ve numuneyi spektro florimetrenin numune bölmesine yerleştirin.

Bir dakika sonra floresan sinyalleri kaydetmeye başlayın, alımı duraklatın, 500 nanomolar JC bir tane ekleyin ve ardından alımı yeniden başlatın. JC bir oran sinyali artmalıdır, bu da aktif mitokondri tarafından kalıp alımını gösterir. JC bir sinyal bir platoya ulaşana kadar kayda devam edin.

Genellikle beş dakika içinde, 20 mikromolar nihai konsantrasyona kalsiyum klorür ekleyin. Test tamponunda artan kalsiyum varlığını temsil eden Fluor FF oranı sinyalinde anlık bir artış görülmelidir, ardından mitokondriyal kalsiyum alımına bağlı kademeli azalma görülür. JC bir oran sinyali, hafif mitokondriyal membran depolarizasyonunu gösteren kısa bir geçici azalma göstermelidir.

ER FF oranı sinyali bazal seviyeye döndüğünde, genellikle 20 mikromolar kalsiyum klorürde bir ila 1,5 dakika içinde, mitokondri kalsiyum biriktiremeyene ve tahlil tamponuna kalsiyum salmaya başlayana kadar sabit aralıklarla darbeye devam edin. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş portu açılması, kalsiyum salınımına bağlı olarak URA FF oranı sinyalindeki eşzamanlı artış ile görselleştirilir. C 56 siyah altı J faresinden izole edilirken membran potansiyel çökmesi nedeniyle JC bir sinyal oranında bir azalma ve mitokondriyal şişme mitokondriyal nedeniyle ışık saçılmasında bir azalma.

Bu videoda gösterildiği gibi, oksijen tüketimi daha sonra süksinat ve bir DP varlığında üçüncü durum solunumu sırasında ölçüldü ve burada gösterildiği gibi bir DP tüketiminden sonra dördüncü durum solunumu sırasında, bir DP ilavesi oksidatif fosforilasyon nedeniyle oksijen tüketimini artırır ve oksijen tüketimi yavaşlar. Tüm bir DP tüketildikten sonra, izole edilmiş mitokondrinin ayrılmaya tepkisi, CCCP varlığında CCCP ilavesi ile ölçülür. Oksijen tüketim oranı, izole edilmiş mitokondrinin membran bütünlüğünü değerlendirmek için üçüncü durum solunumundan daha yüksektir.

Oksijen tüketimi, süksinat ve bir DP varlığında ölçüldü ve burada görüldüğü gibi sitokrom C.As ilavesinden sonra, sitokrom C ilavesi, sağlam mitokondriyal zarların mitokondriyal geçirgenlik geçişini değerlendirmek için sitokrom C'ye geçirgen olmadığını gösteren bir DP ve süksinat açısından oksijen tüketimini önemli ölçüde artırmaz, mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesinin bir göstergesi olarak izole kalp mitokondrisinde zayıf açıklık. Mitokondriyal geçirgenlik geçişi. Kötü açılma, 20 mikromolar ardışık ilavelerle tetiklendi.

Kalsiyum klorür, ekstra mitokondriyal kalsiyum ve membran potansiyeli oran metrik indikatörleri ile ölçüldü. Yeşil iz olarak gösterilen URA FF ve kırmızı iz olarak gösterilen JC bir mitokondrinin şişmesi, siyah iz ile gösterilen 525 nanometrede ışık saçılımı kaydedilerek ölçüldü. JC bir ve şişme sinyallerinin özgüllüğü, burada görülebileceği gibi, mikrobiyal toksin etinin mililitresi başına bir mikromolar, CCCP ve beş mikrogram ile test edildi, mitokondri tarafından kalsiyum alımına mitokondriyal membranın hafif bir depolarizasyonu eşlik eder.

Dört kalsiyum atımından sonra, mitokondriyal geçirgenlik geçiş havuzu açılması, kalsiyum salınımını gösteren URA FF'de bir artış olarak görülür. JC'de bir azalma, membran potansiyel çökmesini ve mitokondriyal matris hacminde bir artışı gösterir, bu da mitokondriyal geçirgenlik geçiş portu açıklığının özgüllüğünü doğrulamak için bir şişme belirteci olarak ışık saçılmasında bir azalma olarak görülür. Aynı ölçümler, mitokondriyal geçirgenlik geçişine bağlanan siklosporin A varlığında da gerçekleştirildi D.As bu şekilde gösterildiği gibi, A delen bir mikromolar siklistin varlığı, mitokondriyal geçirgenlik geçişi PO'yu açmak için gereken kalsiyum klorür darbelerinin sayısını arttırır

Bu videoyu izledikten sonra, izole kalp mitokondrisinde mitokondriyal geçirgenlik geçiş portunun açılmasını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürün en zor yönü, kaliteli izole mitokondri elde etmektir. Bu nedenle, daha ileri deneyler için mitokondriyi kullanmadan önce kalite kontrol ölçümleri yapmak önemlidir.