Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tasarlanmış bir insan bağışıklık sistemi taşıyan fareler üretmektir. Bu, önce fareyi ameliyat için hazırlayarak ve ardından ikinci adımda trokara bir parça timus yükleyerek elde edilir. Matrigel, CD 34 negatif ve CD 34 pozitif transdüksiyonlu hücreler ile karıştırılır ve karışım daha sonra trokara eklenir.

Daha sonra, matrigel yapıları böbrek kapsülünün altına nakledilir. Sonuç olarak, hedef tümörlerin genetik olarak tasarlanmış CD sekiz T hücreleri tarafından reddedilmesi, canlı evcil hayvan görüntüleme ve fiziksel tümör ölçümleri ile izlenebilir. Bu tekniğin tam nöron modelleri gibi mevcut metamfetamin yöntemlerine göre en büyük avantajı, bu yöntemin insan timusu içinde genetik olarak değiştirilmiş insan kök hücre gelişiminin incelenmesine ve ardından prosedürü gösteren türetilmiş soyların in vivo etkinlik testine izin vermesidir. laboratuvarlarımızdan üç teknisyen, Gregory Bristol, Bernard Levin, ve Sean Kim.

Bu şematik diyagramda, mart taşıyan kimerik farelerin üretimi için bu çalışmalarda kullanılan modifiye edilmiş BLT modeli, spesifik bir T hücresi ana hatlarıyla belirtilmiştir. İmplant, otolog bir fetal karaciğerden izole edilen transdüksiyonlu ve transdüksiyonsuz CD 34 hücrelerinden yeniden yapılandırılır. Dönüştürülen hücrelerin bir kısmı daha sonra dondurulur ve dört ila altı hafta sonra ışınlanmış farelere enjekte edilir.

Bu videoda, hayvanlar anesteziden halsiz hale geldikten sonra canlı yapının implantasyonu gösterilmektedir. Her farenin sol tarafını kalçadan omuza kadar, sırtın merkezi ile göbek arasında tıraş ederek başlayın. Her bir hayvanın ağırlığını kaydettikten sonra, numaralandırma için kulaklarını yumruklayın ve deri altına 0.3 mililitre carprofen enjekte edin.

Sonra fareleri sola bakacak şekilde sağ taraflarına yatırın. Şimdi 16 gauge kanser implantı iğnesinin trokarını PBS ile yuvarlak bir eğe ucu ile yıkayın. Bir çift iğne burunlu forseps kullanarak, PBS kabına bir parça timus ekleyin ve ardından trokarı çubukla yatay tutun.

Ucun hemen içinde dokuyu aspire edin. Trokarın böbrek kapsülünün altına kaydırılması ve dokunun enjekte edilmesi bu işlemin en zorlu yönlerinden biridir. Sonra, bir yardımcınız olsun.

Beş mikrolitre soğuk matrijeli hafifçe karıştırarak bir tüp hücreye karıştırmak için bir eend orph pozitif yer değiştirmeli pipet kullanın. Trokarı yatay tutmak. Yardımcı matri jeli pipetlerken çubuğu yavaşça geri çekin.

Her fare için trokara karıştırın. İlk olarak, hayvanın çıplak derisini Betadine ile temizleyin ve ardından bir izopropanol mendil ile silin. Dalağın yerini gösteren cildin altındaki en koyu noktayı iki kez belirler.

Böbrek, cildi böbreğin üzerinden almak için künt forseps kullanılarak dalağın yaklaşık beş milimetre dorsalinde bulunur. Dalağa paralel olarak deride yaklaşık 15 milimetre uzunluğunda bir kesi yapın. Aşağıdaki periton kas tabakasında da benzer bir kesim yapın.

Erkeklerde böbrek doğrudan görünür olmalıdır. Çıkarmak için karnı sıkmanız yeterlidir. Kadınlarda böbreği açıkta tutmak için sol elinizle karın bölgesine baskı uygulayın: önce yumurtalığı almak için bir hemostat kullanın ve ardından organı vücudun dışında tutmaya yardımcı olmak için böbreği dışarı sürükleyin.

Böbrek kapsülünün arka ucunda küçük bir delik açın ve ardından trokarın ağzı tamamen böbrek kapsülü tarafından kaplanana kadar trokarı bu deliğe ve böbrek boyunca kaydırın. Daha sonra sağ elin küçük parmağını kullanarak dokuyu enjekte edin. Şimdi böbreği nazikçe yerine itmek için kapalı hemostatı kullanın.

Peritonda bir dikişi çift fiyonkla bağlayın, cildi bir çanta gibi sıkın ve ardından iki yara klipsine koyun. Son olarak, her göze bir damla PBS damlatın ve fareyi bir yatak takımının üzerine bir kafeste yan yatırın. Tüm fareleri aynı şekilde implante ettikten sonra, hayvanların ayrılmadan önce karınlarının üzerine yatmaya geri döndüklerini onaylayın.

Bu ilk şekil, insanlaştırılmış farelerde THI canlı implantının temsili bir görüntüsünü göstermektedir. Bu şekilde, timik dokunun normal gelişimi ve insan CD dört ve CD sekiz pozitif T'nin fizyolojik doku dağılımı gösterilmiştir. Sulandırıldıktan sonra, hayvanlar normal bir CD dört ve CD sekiz pozitif T hücresi dağılımına sahip bir insan bağışıklık sistemi taşırlar.

Burada melanom tümörü taşıyan bir farenin temsili bir görüntüsü gösterilmektedir. Gri alanlar CT tarama görüntüsünü gösterir. Renkli alanlar, PET taraması tarafından tespit edilen tümörün metabolik aktivitesini gösterir.

Bu deneyde tek başına BT taraması, beyaz daire ile gösterilen alanda büyük bir tümör kitlesi olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, in vivo PET görüntülemenin gösterdiği gibi, bu alan çoğunlukla nekrotik ve skar dokusundan oluşur ve PET görüntülemenin tümör regresyonunu ve klerensini değerlendirmenin daha hassas ve doğru bir yolu olarak faydasının altını çizer. Bu prosedürü takiben, T hücresi fonksiyonu ile ilgili soruları yanıtlamak için T hücresi, fenotipleme ve ex vivo aktivasyon gibi diğer testler yapılabilir.