İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, in vitro kontraktil fonksiyonu incelemek üzere sağlıklı ve sağlam kaslar izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fareden sağlam extensor digitorum longus (EDL) ve soleus kaslarının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, EDL ve soleus kaslarının ligamentleri ve tendonları cerrahi sütürle bağlanır.

Ardından, izole edilen kasları kuvvet transduserine ve kontraksiyon odasına yerleştirin. Son adım, kaslarda kontraksiyonlar oluşturmak için kası alan elektrik impulsları ile stimüle etmektir. Nihayetinde, ortaya çıkan kuvvetler kuvvet transduserine iletilerek kaydedilir ve kas kontraktilitesi üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için çeşitli fizyolojik ve farmakolojik manipülasyonlar gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin, in situ kontraktilite ölçümü veya erkek performans tedavisi gibi kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, bu yöntemin nöronal ve vasküler bileşenleri iskelet kasından uzaklaştırarak, kasılan kasın intrinsik özelliklerinin doğrudan değerlendirilmesine olanak tanımasıdır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler, sağlam inhale kasların diseksiyonunun yüksek el becerisi ve sabır gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Bu işlem, laboratuvarımdaki bir teknisyen ve Dr. Jma laboratuvarındaki bir doktora sonrası araştırmacı olan Keyhole Park tarafından gerçekleştirilecektir.

Kas diseksiyonunun ve kontraktil kamara montajının gerçekleştirilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu video kasın anatomik yapısının anlaşılmasına ve izole edilen kasın montajı için gereken ölçeğin kavranmasına yardımcı olur. Bu prosedürde, wild type C 57 black six faresini veya bir hastalık fare modelini servikal dislokasyonla sakrifiye edin ve fareyi lateral pozisyonda yerleştirin.

EDL'yi incelemek için yüzeysel bir cilt insizyonu yapın. Anterior tibialar ile posterior kas grubu arasındaki fasyayı kesin. Ligamanın tibianın lateral kondiline ve anterior fibular yüzeyin üst üçte dörtlemesine bağlandığı proksimal orijini belirleyin.

Ardından, EDL kasının proksimal başlangıç noktasını serbest bırakmak için ligamenti, kasın mümkün olduğunca distalinden hassas oftalmik makasla kesin. Bundan sonra, ligamenti küt uçlu bir pensle tutun ve EDL'yi serbest bırakmak için yavaşça çekin. EDL'yi çevreleyen paramesiyumun ve EDL çevresindeki diğer kasların bir kısmını kesmek gerekebilir.

EDL kasına zarar vermemek için bu adım hassas bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Ardından, iki ile beş arasındaki parmakların orta ve distal falankslarına tutunan dört distal tendonun insersiyo bölgesinde, tendonları kaslardan mümkün olduğunca uzak bir noktadan kesin. İzole edilen EDL kasını, kalsiyum içermeyen izotonik tyro çözeltisi bulunan bir disseksiyon kabına aktarın.

EDL kası, soluk pembe-beyaz renkte, yaklaşık 10 ila 13 milimetre uzunluğunda ve sekiz ila 11 miligram ağırlığında, hızlı glikolitik bir kastır. Ardından, izole edilen EDL kasının her iki ucuna, kasta mümkün olduğunca distalden ve ligamentin veya tendonun uzunlamasına orta noktasının hafifçe üzerinden, 6-0 boyutunda sütürle sıkı bir cerrahi düğüm atın. Daha sonra EDL kasını oksijenle doyurulmuş doku banyosu haznesine aktarın.

Kası, kuvvet dönüştürücüsünün örnek kanalına ve banyo haznesinin altındaki sabit kancaya monte edin. Bacağın posterior lateral kısmındaki soleus kasını diseke etmek için diğer bacağın EDL kası için izolasyon ve montaj işlemini tekrarlayın. Normalde bunu örten gastrocnemius kasını kenara itin.

Soleus kası, koyu kırmızı renge sahip, EDL'den yaklaşık bir milimetre daha kısa olan ancak EDL'den biraz daha ağır olan yavaş oksidatif bir kastır. Proksimal başlangıç noktasında; soleus hattı boyunca posterior tibia'nın proksimal yarısına ve posterior fibulanın proksimal üçte birine bağlanan ligamenti kesin.

Ardından distal insersiyonda, posterior kalkaneusa insere olan kalkaneal tendonu kesin. Daha sonra soleus kasını dikkatlice serbest bırakın. Soleus kasını banyo haznesine uygun şekilde yerleştirin.

Kaslar bireysel doku banyosu odalarına yerleştirildikten sonra veri kaydına başlayın. Kuvvet dönüştürücüsünün taban çizgisini sıfırlamayı unutmayın. Bu işlem, taban çizgisi değişikliklerinin gözlemlenmesini kolaylaştıracak ve farklı deneysel koşullar arasındaki kas kasılmalarının karşılaştırılmasını basitleştirecektir.

Ardından izole kasları kare dalga darbeleriyle uyarın. 60 ile 300 miliamper arasında değişen elektrik akımları, 0,3 ile bir milisaniye arasında bireysel kare dalga darbe süreleri ve 350, 500 veya 1000 milisaniyelik stimülasyon tren süreleri kullanın. Bir sonraki adım, izole kas oda sıcaklığında optimal uzunluğuna kadar gerildiğinde maksimal titanik kuvvet üretebilen bir stimülasyon frekansı seçmektir.

Bu frekans genellikle EDL için 100 hertz ve soleus için 60 hertz civarındadır. Soleus için kası yavaşça gerin ve 30 saniye bekleyin, ardından 100 hertz veya 60 hertz ile uyarın. Bundan sonra kası tekrar gerin.

30 saniye daha bekleyin ve germe işlemi sırasında kası tekrar uyarın. Kuvvet daha fazla artmıyorsa, bu durum genellikle maksimal kuvvete ulaşıldığı anlamına gelir. Bu sırada, tekrarlayan germe ve stimülasyon döngülerinde kuvvetin azalması, kasların aşırı gerildiğini gösterir. Bu durumda, kası önceki germe seviyesine geri getirin ve maksimal kuvvet gözlemlenene kadar kası tekrar uyarın.

Şimdi, kuvvet-frekans ilişkisini elde edin. Kasları 1 ile 140 hertz arasındaki frekanslarla, 5 ila 10 hertz'lik artışlarla ve 30 ila 60 saniyelik bir periyodla stimüle edin. Deneyler 25 degrees Celsius'ta gerçekleştirildiğinde; deneyler 37 degrees Celsius'ta gerçekleştirildiğinde ise kuvvet-frekans (FF) ölçümlerini diyafram kası için 300 hertz'e, soleus için 180 ila 200 hertz'e ve EDL için 220 ila 250 hertz'e kadar daha yüksek frekanslara genişletin.

Ardından, her bir stimülasyon frekansı tarafından üretilen kuvvet miktarını karşılaştırarak, maksimal titanik kuvveti ve yaklaşık olarak maksimal titanik kuvvetin yarısını üreten frekansı belirleyin. Tmax, kontraktil mekanizma modülasyonuna dair önemli bilgiler sağlar. Yarım Tmax ise kalsiyum regülasyonu ve ECC süreciyle daha ilgili bilgiler sunar.

Ardından kas, sarkoplazmik retikulumun katkısını incelemek amacıyla dengeleme (equilibration) olarak adlandırılan bir işlemle, birer dakikalık aralıklarla 30 dakika boyunca tmax frekansında stimüle edilir. Dengeleme sonrası kas kasılmasında kalsiyum salınımı, beş dakika boyunca iki saniyelik aralıklarla Tmax stimülasyonunun yarısı verilerek kasların yorulmasıyla gerçekleştirilir. Burada 500 milisaniyelik tren süresi kullanılmıştır ve bu nedenle görev döngüsü %25'tir. Ardından kas, birer dakikalık aralıklarla Tmax'in yarısı ile dinlendirilir.

Kuvvet sabitlenene kadar veya 30 dakika boyunca ek bir yorma protokolü uygulanabilir. Artık Tmax'ta tmax yorması kullanmanın, kontraktil mekanizmanın durumunu doğru şekilde test ettiğine inanılmaktadır. Ardından, farklı suşlar, hastalık modelleri veya ilaç tedavileri arasındaki fenotipik farkların gözlemlenebilmesi için FF'yi elde etme prosedürlerini tekrarlayın.

Ekstraselüler kalsiyum girişinin kas kasılabilirliğine katkısını incelemek için yorgunluk öncesi ve sonrası FF analiz edilerek, banyo solüsyonu kalsiyum içermeyen ancak 0,1 milimolar EGTA içeren bir solüsyonla değiştirilebilir. Alternatif olarak, banyo solüsyonuna farklı depo tarafından aktive edilen kanal blokörleri uygulanabilir. Deneyin sonunda kasların deneysel uzunluğunu ölçün, ardından her birini analitik terazide tartın, kasları sıvı azotla şoklayarak dondurun ve biyokimyasal analizler için -80 °C'de saklayın.

Şimdi, kuvvet transdüserini kalibre edin. Kaydedilen kas kuvvetini, kalibrasyon sonuçlarına dayanarak milivolt biriminden gram kuvvet birimine dönüştürün. Ardından, bu değeri fizyolojik kesit alanına göre normalize edin.

Bu şekil; 5 hertz, 20 hertz ve maksimal titanik kuvvet tarafından indüklenen kasılma kuvvetlerini göstermektedir; burada hasarlı bir kasın kasılma kuvvetine ait bir iz yer almaktadır. Burada, EDL'de kuvvet-frekans ilişkisindeki bireysel kasılmaları ve bu ilişkiden elde edilen çizilmiş eğriyi gösteren temsili bir örnek bulunmaktadır. Bu, EDL kasının tipik hızlı düşüşlü yorulma profili ve soleus kasının yavaş düşüşlü yorulma profilidir.

Yorgunluk uyaranları, kalsiyum yönetimi özellikleri bozulmuş nakavt bir kas modelinde mekanik alternatiflerin ortaya çıkmasına yol açar. Bu teknik bir kez kavrandığında, iki saat içinde tamamlanabilir. Doğru şekilde uygulandığında, deneyin tamamı daha uzun sürecek ve gerçekleştirilen müdahale sayısına bağlı olacaktır. Bu prosedürü uygularken, DL kasını mümkün olduğunca hızlı izole etmek ve monte etmek çok önemlidir; çünkü in vitro düşük oksijenli ortam, her bir kasın hızlı liflerine geri dönüşü olmayan zararlar verebilir.

Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak amacıyla aynı deneysel kaslar üzerinde gen analizi, western blotting, immünohistokimya ve yapısal çalışmalar gerçekleştirilebilir. Örneğin, belirli bir proteinin veya kas kasılabilirliğini veya kalsiyum sinyalleriyle düzenleyen kas proteinlerinin bileşenlerinin ekspresyon düzeyi ve lokalizasyonunun yanı sıra, belirli durumların gelişimi sonrası kaslarda meydana gelen morfolojik veya ultrastrüktürel değişiklikler incelenebilir. Bu teknik, kas fizyolojisi alanındaki araştırmacıların fareler, sıçanlar ve hamsterlar da dahil olmak üzere çeşitli modellerde iskelet kası fonksiyonunu etkileyen genetik defektleri araştırmalarının önünü açmıştır.