Üç boyutlu heterotipik In Vitro Modelleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, erken evre yumurtalık kanseri gelişiminin üç boyutlu tipik modellerini oluşturmaktır. İlk olarak, birincil, normal over epitel ve fibroblast dokularından türetilen H turt ölümsüzleştirilmiş hücre hatları oluşturun. Daha sonra, yumurtalık ko-kültüründe bulunan in vivo mimariyi ve karmaşık hücre hücre etkileşimlerini yeniden oluşturmak için, üç boyutlu S sferoid modellerinde epitelyal ve stromal hücre hatları, organoid kültürleri sabitlemeye ve boyamaya ve stromal epitel etkileşimlerinin moleküler özelliklerini incelemek için spesifik belirteçlerin ekspresyonunu analiz etmeye devam eder.

Elde edilen sonuçlar, 3D tipik modellerin stromal hücre bölmesindeki değişikliklerin, birlikte kültürlenmiş epitel hücrelerinin fenotipini nasıl etkileyebileceğini göstermektedir. Üç boyutlu tipik modeller, bu hastalığın kökenlerini araştırmak ve tümör başlangıcı ve gelişiminde stromal mikro çevrenin rolünü aydınlatmak gibi yumurtalık kanseri araştırma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniklerin uygulamaları, diğer 3D kültür yöntemlerine kıyasla hastalık teşhisi ve tedavisine kadar uzanır.

Bu teknik, daha geniş bir hücre kültürü hacmi yelpazesine ve aşağı akış uygulamalarına uygulanabilir. Örneğin, in vitro ilaç testi için 3D homo ve tipik kültürler kullanılabilir. Bu yaklaşım, diğer katı tümör tiplerinin incelenmesi veya iyi huylu hastalıklar gibi diğer model sistemlere de uygulanabilir.

Taze yumurtalık dokusunu, ekstra antibiyotikler ve antiklerle desteklenmiş ölümsüzleştirilmiş normal yumurtalık fibroblast büyüme ortamında hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. Dokuya gevşek bir şekilde bağlı kalan epitel hücrelerini çıkarmak için numuneyi beş mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, numuneyi ve PBS'yi temiz bir P 100 kültür kabına aktarın Steril aletler kullanarak, dokuyu ikinci bir kuru P 100 temiz kültür kabına aktarın.

Dokuyu 0,5 santimetre karelik parçalar halinde kesin ve her parçayı ayrı bir P 100 kabına aktarın. Dokuyu bir milimetre kareden daha küçük parçalar halinde kesmeye devam edin. Daha sonra faz mikroskobu kullanarak hücre büyümesi için 20 mililitre INOF GM ortamı ve kültür Monitörü ekleyin.

Hücrelerin 24 saat içinde yemeğe yapıştığını onaylayın. Faz mikroskobu kullanarak hücre büyümesini izleyin Hücreler genellikle 24 saat içinde yemeğe yapışır Bir hafta sonra. Yapışmayan dokuları aspirasyon ile çıkarın, ortamı doldurun ve daha sonra hücre kolonileri yaklaşık 500 mikron boyutunda olduğunda bir ila üç hafta içinde haftada iki kez kültürleri yeniden besleyin.

Geziler ve kaplanmış klonlama diskleri kullanarak klonları izole edin. % 100 fibroblastik hücreleri doğrulamak için. Hücre hattının bir örneğini cam kapak kızakları üzerine yerleştirin ve bir fibroblastik belirteç, bir epitel belirteç ve bir endotel hücre işaretleyicisi için immünofloresan boyama gerçekleştirin.

H Turt pasajının retroviral transdüksiyonundan bir gün önce, normal over fibroblast hücresi tek bir P 100 kabından üç P 100 kabına izole edilir. Önceden hazırlanmış viral supnatan HEC 2 9 3 T hücrelerinin manşon transfeksiyonu için standart protokoller kullanılarak şirket içinde satın alınabilir veya üretilebilir. Poli Hema çözeltisini hazırlamak için 1.5 gram poli hema tartın ve steril bir şişeye koyun.

95 mililitre moleküler biyoloji, derece, mutlak etanol ve beş mililitre hücre kültürü sınıfı damıtılmış su ekleyin. Poly Hema solüsyonunu tamamen eriyene kadar 65 santigrat derecede bir su banyosuna koyun. Doku kültürü kaplarını taze yapılmış poli Hema solüsyonu ile kaplayın.

Laminer akış başlığının içindeki hücre kültürü kaplarını havayla kurutun. Daha büyük boyutlu tabakların veya şişelerin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için sallanan bir platform üzerinde hafif sallanma kullanılabilir. Polyus çözeltisi çok çabuk kurursa, yüzey pürüzsüz olmayacaktır.

İstenirse, 3D kültürden önce fibroblastları ön işlemden geçirin, örneğin, yaşlanma indüksiyonu için, hücreleri öldürücü olmayan dozlarda hidrojen peroksit ile ön işleme tabi tutun. 3D heterotopik steroidler oluşturmak için yeterli hücreyi hazırlamak için in vitro INOF ve epitel hücre kültürlerini geri kazanın ve genişletin. Beş dakikalık bir PBS yıkamasından sonra, poli hema plakasına 15 mililitre orta ekleyin.

Bu arada, ölümsüzleştirilmiş normal yumurtalık fibroblast hücrelerine tripsin ekleyin ve onları kültür kabından ayırın. Üç ila beş dakika sonra, tripsini eşit miktarda kültür ortamı ile nötralize edin ve hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Hücre peletini beş mililitrelik ortamda yeniden süspanse edin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek veya hafifçe girdaplayarak iyice karıştırın.

Ardından, trian mavisi kullanarak canlı hücreleri numaralandırmak için 10 mikrolitrelik bir numune kullanın. Şimdi, poli hema kaplı plakaya zaten dağıtılmış olan ortama 4 milyon INOF hücresi ekleyin. Kültür ortamı hacmini 20 mililitreye yükseltin ve 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin.

S sferoid kültürlerini her iki ila üç günde bir yeniden beslemek için faz mikroskobu ile çok hücreli steroide hücresel agregasyonu izleyin. Plakaları bir pipet üzerinde belirli bir açıyla dinlendirin. Sferoidlerin yerleşmesine izin verin ve tükenmiş ortamın yaklaşık 16 mililitresini beş mililitrelik bir pipetle dikkatlice çıkarın.

Kültüre 16 mililitre taze ortam ekleyin ve yedinci günde inkübatöre geri dönün. Fibroblast phe'sine epitel hücreleri ekleyerek hetero tipik kültürler oluşturun. İlk olarak, hücreleri numaralandırdıktan sonra daha önce tarif edildiği gibi tripsin ile yumurtalık epitel hücrelerinin süspansiyonlarını hazırlayın.

Herhangi bir büyüme faktörünün epitelyal büyüme ortamından taşınmasını önlemek için INOF GM ortamında bir kez yıkayın. Fibroblast OID kültürlerinin ortamını yeniledikten sonra, epitel hücrelerini epitel hücre kültürüne dört ila bir fibroblast oranında ekleyin. INOF GM'deki heterotopik OID'ler, tipik kültürleri 14 gün daha boyunca her iki ila üç günde bir yeniden besler.

İmmünohistokimya için, PHE'yi nötr tamponlu formin ile sabitleyin, PHE'yi peletleyin ve formalini% 70 etanol ile değiştirin. İnsan dokuları için kullanılan standart protokolleri kullanarak parafine işlemeye devam edin. Parafin gömülü steroidler, immünohistik kimya kullanılarak spesifik moleküler belirteçlerin h ve e ile kesitlere ayrılabilir ve boyanabilir.

Alternatif olarak, steroidleri PBS'de yıkayın ve% 4 para formaldehit içinde sabitleyin. Daha sonra numuneleri OCT ortamına gömün ve kriyostat kesitleme ve akış sitometrisi ile analiz için immünofloresan boyama için ani dondurma yapın. Steroidleri PBS'de yıkayın ve 37 santigrat derecede tripsin veya Accutane sindirimi ile ayrışın.

Steroidlerin tek hücreli bir süspansiyona tamamen ayrışması, çözeltinin bir mililitrelik pipet ucu ile yukarı ve aşağı pipetlenmesiyle teşvik edilebilir. Hücreleri aşırı boyutlandırmamaya dikkat edin, Reaksiyonu eşit hacimde bir kültür ortamı ile nötralize edin ve süspansiyonu 40 ila 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek hücre kümelerini çıkarın. Daha sonra hücreleri pelet haline getirin ve PBS ile yıkayın ve istenen sayıda hücreyi üreticinin talimatlarına göre yeniden sayın, tamponlayın ve boyayın: Laboratuvarımızda, yumurtalık epitel hücrelerini kısmen dönüştürdük ve bu hücreleri erken evre yumurtalık kanseri gelişimini taklit etmek için normal ve yaşlanan over fibroblastı ile birlikte kültürledik.

Premenopozal bir yumurtalıkta h hert ölümsüzleştirilmiş normal over fibroblastlarının immünofloresan boyanması, hem primer normal over fibroblastlarının hem de ölümsüzleştirilmiş normal over fibroblastlarının fibroblast spesifik proteini eksprese ettiğini, ancak sitokeratin yedi eksprese etmediklerini ve menton eksprese etmediklerini göstermektedir. 3D formda tek başına kültürlenen normal over fibroblast hücreleri PHE, iğsi bir morfoloji ve bol miktarda hücre dışı matriks gösterir. Burada, normal yumurtalık fibroblastları, yedi gün boyunca yaşlanmayı indüklemek için hidrojen peroksite maruz bırakıldı ve daha sonra 14 gün boyunca kısmen dönüştürülmüş yumurtalık epitel hücreleri ile kültürlendi.

İki hücre tipini ayırt etmek için, elde edilen steroidler, bir proliferasyon belirteci olarak mim bir ve bir epitel belirteci olarak pan sitokeratin için immüno boyandı. Verilerin nicelleştirilmesi, yaşlanan mikro çevrenin kısmen transforme olmuş epitel hücrelerinin neoplastik özelliklerini desteklediğini, normal bir mikro çevrenin ise neoplastik ilerlemeyi, normal ve malign hücrelerin histolojik özelliklerinin, hücreler tek tabakalar restore edildiğinde kültürlendiğinde tespit edilemediğini göstermektedir. Hücreler sferoid kültüre geçtiğinde, örneğin, berrak hücreli yumurtalık kanserlerinin histolojik özellikleri, berrak hücreli yumurtalık kanseri hücre hatlarının 3D kültürlerinde tespit edilebilir, ancak aynı hücrelerin tek katmanlı kültürlerinde tespit edilemez.

Bu videoyu izledikten sonra, epitelyal ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için üç boyutlu tipik kültürlerin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Erken tümör oluşumu sırasında. Bir 3D kültür kurarken, hücre sayılarını sonraki uygulamaya göre ayarlamak önemlidir, bu da işleme sırasında bir miktar malzeme kaybına izin verir.

Mastering yapıldıktan sonra, bu prosedürü takiben bir saat içinde 3D kültürler kurulabilir. Gen ekspresyonu mikroışın profili oluşturma ile birleştirilmiş akış sitometrisi gibi diğer yöntemler, 3D tipik kültürlerde meydana gelen ancak tek katmanlı kültür koşulları altında tespit edilmeyen küresel gen ekspresyonu değişikliklerini analiz etmek için gerçekleştirilebilir. Bu, özellikle bir 3D çekirdek kültür altında meydana gelen çift yönlü sinyal yollarının diseksiyonunu mümkün kılacaktır. Mikro çevre.