Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

Bu videoda gösterilen deneyin genel amacı, antimikrobiyal peptit lyin'in farelerde dekstran sülfatın neden olduğu kolitin iyileştirilmesinde bir rol oynayıp oynamadığını değerlendirmektir. Bu, yabani tip farelerden alınan kemik iliğinin ışınlanmış licit ve nakavt farelere ve nakavt farelerden alınan kemik iliğinin ışınlanmış vahşi tip farelere enjekte edilmesiyle elde edilir. Nakledilen kemik iliği, donör genotipin alıcısında yeni kan hücreleri üretecektir.

Alıcı fareler daha sonra dört hafta sonra koliti indüklemek için dekstran sülfata maruz bırakılır. Başarılı transplantasyon akım sitometrisi ile doğrulanır ve kolonik doku hasarı histoloji ile değerlendirilir. Yabani tip kemik iliği nakavt farelere nakledildiğinde kolitin iyileştiğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Tersine, nakavt kemik iliği vahşi tip farelere nakledildiğinde kolit daha da kötüleşir. Bu yöntem, inflamasyon veya enfeksiyonda kemik iliğinden türetilmiş hücrelerden veya kemik iliği türetilmiş olmayan hücrelerden gen ekspresyonlarının belirlenmesinde anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu deney için vahşi tip fareleri ve nakavt fareleri izlemeyi mümkün kılmak için C 57, siyah altı, vahşi tip ve C ortaya çıkan nakavt fareler önerilir.

Kemik iliği nakli sonrası donör hücreler. Yabani tip fareleri temsil etmek için CD 45.1 fareleri ve nakavt fareler için CD 45.2 kullanın. Burada gösterilen çizelge, her grup için beş donör fare ve 10 alıcı farenin atandığı deney kurulumunu açıklamaktadır.

A ve B grupları için, kemik iliği vahşi tip farelerden nakavt farelere nakledilecektir. Kolit A grubunda indüklenecek, ancak B grubunda indüklenmeyecek, C ve D grubu için kemik iliği nakavt farelerden vahşi tipe nakledilecek ve kolit sadece E ve F için C grubunda indüklenecektir. Nakil nakavttan nakavttan nakavta kadar olacak. Donör kemik iliğini ışınlanmış farelere transfer için hazırlamak için, bir biyogüvenlik kabininde kurban edilen farelerin kemiklerinden kemik iliği çıkararak başlayın.

Humerus, femur, tibia ve fibula kemiklerini kasları ve bağları bağlamadan ortaya çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın ve bunları bir Petri kabına aktarın. Kırmızı kemik iliğini göstermek için kemiklerin her iki ucunu da kesin. Sonra kemiklerden birini forseps ile kavramak.

Kırmızı kemik iliğini üç mililitrelik şırınga ve 25 gauge iğnelerle soğuk PBS ile başka bir petri kabına yıkayın. Daha sonra daha fazla kemik iliği hücresi elde etmek için kemiği diğer ucundan yıkayın. Bu işlemi kemiklerin her biri için tekrarlayın.

Yabani tip kemik iliğini bir araya getirin ve fareleri ayrı ayrı nakavt edin. Tekrarlanan aspirasyon ve ejeksiyon ile kırmızı kemik iliği tıkaçlarını kırmak için 18 gauge yarım inçlik bir iğne ile altı mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra toplanan kemik iliğini 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.

Kemik iliğinin tamamı transfer edildikten sonra, kemik iliğini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 740 G'de döndürün. Döndürmeden sonra, süpernatanı atın ve peleti beş ila 10 saniye boyunca girdaplayarak yeniden süspanse edin. Pelete, donör fare girdabı başına beş mililitre bir XRBC lizis tamponu ekleyin, tekrar beş saniye boyunca ve oda sıcaklığında tam olarak üç dakika inkübe edin.

Üç dakika sonra, her tüpe 20 mililitre soğuk PBS ekleyin ve lizizi durdurmak için ters çevirerek karıştırın. Daha sonra içeriği 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe dökün. Orijinal tüpü beş mililitre PBS ile durulayın ve çözeltiyi hücre süzgecine aktarın.

Konik borudaki akışı toplamaya devam edin. Daha sonra PBS ile hacmi 50 mililitreye getirin ve ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, bir hemo sitometre kullanarak trian mavisi dışlama ile canlı hücre sayısını belirleyin.

Hücre sayısı belirlendikten sonra, kemik iliği hücrelerini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 913 kez G'de döndürün. Döndürme işleminden sonra, toplam hücre sayımına göre süpernatanı çıkarın. Resus, peleti PBS'de mililitre başına 10 ila sekizinci hücrelere bir kez süspanse eder.

Kemik iliği hücreleri artık ışınlanmış alıcı farelere transfer edilmeye hazırdır. Bu deney için alıcı vahşi tip ve nakavt fareler, ekteki belgede açıklandığı gibi 1000 rad ile ışınlanmıştır, fareler, ışınlamanın alıcı fareleri bir ısıtma yastığı altında bir ısıtma yastığı üzerinde ısıtmasından dört ila 24 saat sonra patojen içermeyen bir tesiste yetiştirilir ve barındırılır. Bir alıcı fareyi kısıtlayıcıya yerleştirin, enjeksiyon bölgesini sterilize etmek ve kolay enjeksiyon için lokal vazodilatasyonu teşvik etmek için kuyruğu% 70 etanol ile silin.

28 buçuk gauge iğneli bir insülin şırıngası kullanarak, enjeksiyonu takiben her farenin kuyruk damarına bir ila 200 mikrolitrede 10 ila yedinci hücreye bir kez enjekte edin. Fareyi, enjeksiyondan sonraki ilk dört hafta boyunca enjekte edilen en fazla üç fareyle birlikte bir kafese yerleştirin. Enjekte edilen alıcı fareleri, antibiyotik sülfa süslemesi içeren su ile otoklav kafeslerinde tutun.

Bu, hayvanların bağışıklığını yeniden kazanmaları, kafesleri değiştirmeleri, antibiyotikle arıtılmış su ve yiyecekleri hijyeni sağlamak için her dört günde bir zaman tanır. Işınlama ve kemik iliği naklinden dört hafta sonra, antibiyotiksiz normal suya geçin ve normal bağırsak mikroflorasını yeniden kazanmaları için fareleri iki hafta daha koruyun. Kemik iliği enjeksiyonundan altı hafta sonra, koliti indüklemek için ilk vücut ağırlığını ölçün.

Kolit deney grubundaki farelere içme suyunda% 5 dekstran sülfat verin. Beş gün sonra, dört fareden alınan periferik kanı bir vakutainer heparin kaplı tüplerde toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde, 300 mikrolitre kanı 300 mikrolitre hücre boyama ile birleştirin, kanı tamponlayın ve buz üzerinde 100 mikrolitre ile her biri bir ila beş etiketli beş akış sitometrisi Test tüpüne ayırın.

Fareleri kurban ettikten sonra, vücut ağırlığını tekrar ölçün ve değişimi hesaplayın. Kolon dokularını inceleyin ve h ve d boyaması için formalin içinde hızlandırın. Daha sonra daha önce olduğu gibi kemik iliği hücreleri elde edin.

Yeniden askıya alınmış kemik iliğini, her biri 100 mililitre olan bir ila beş etiketli beş mikro santrifüj tüpüne bölün. Akış sitometrisi ile analize hazırlanırken, ekteki belgede açıklandığı gibi karanlıkta her bir ilgili tüp için antikor karışımını hazırlayın, bir numaralı etiketli kan ve kemik iliği örnekleri kontrol görevi görecek ve lekeli kan ve kemik iliği örnekleri olmayacaktır. İki numaralı etiket, fitzy izotip kontrolü, PE izotip kontrolü ve CD 16 eğik çizgi 32 engelleme çözeltisi ile boyanacaktır.

Bu izotip kontrolleri, birincil antikor bağlama numunelerinin özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. Üç numara etiketli, FZ CD 45.1 ve CD 16 eğik çizgi 32 ile lekelenecektir. Dört numara etiketli blokaj çözeltisi numuneleri, CD 45.2 ve CD 16 eğik çizgi 32 ile boyanacaktır.

Engelleme çözümü. Tek renkli etiketleme, kan veya kemik iliğinde donör veya alıcı hücrelerin varlığını ortaya çıkarabilir. Açıkçası, beş numara etiketli örnekler CD 45.1, CD 45.2 ve CD 16 eğik çizgi 32 için lekelenecektir.

Burada bloke edilen çift renkli etiketleme, kan veya kemik iliğindeki donör ve alıcı hücrelerin nispi oranını gösterir. İlgili numune tüplerine iki ve beş mikrolitre antikor karışımı ekleyin. Daha sonra ilgili numune tüplerine üç mikrolitre antikor karışımı üç ve dört ekleyin.

Tüm tüpleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her tüpe iki mililitre, bir XRBC lizis tamponu ekleyin. Daha sonra numuneleri karanlıkta buz üzerinde 15 dakika daha inkübe edin.

Hücreleri 350 kez G'de, dört santigrat derecede beş dakika döndürün. Döndürmeden sonra, süpernatanı çıkarın, karanlıkta 500 mikrolitre hücre boyama tamponu ile peleti yeniden süspanse edin. Sonra kısaca girdap.

Ardından, immüno-leke kan ve kemik iliği örnekleri üzerinde akış sitometrisi yapın. Vahşi tip CD 45.1'i temsil etmek için FZ'yi ve nakavt CD 45.2'yi temsil etmek için PE'yi seçin. Flo Joe'nun yazılımını kullanarak akış sitometrisi sonuçlarını analiz edin.

Donör genotipinin kan ve kemik iliğinde baskın genotip olup olmadığını belirlemek için uygun E'nin PE'ye oranının veya PE'nin e'ye uyma oranını hesaplayın. Bu görüntü, normal histoloji ve DSS koliti ile kolonların örnek h ve e görüntülerini göstermektedir. Histoloji görüntüleri, mukozal doku hasarı ve mukozal ve submukozal dokulara nötrofil infiltrasyonuna göre skorlanır.

Bu nedenle, daha yüksek bir histoloji skoru, lyin'in kolitin önlenmesinde rol oynayıp oynamadığını test etmek için daha şiddetli koliti gösterir. Kemik iliği, bu videoda anlatıldığı gibi vahşi tip ve nakavt fareler arasında değiştirildi. Histoloji daha sonra burada gösterildiği gibi değerlendirildi ve puanlandı.

Işınlanmış vahşi tip farelere nakavt fare kemik iliği sokulduğunda histoloji skorları önemli ölçüde artmıştır. Tersine, nakavt farelere vahşi tip kemik iliği eklendiğinde puanlar önemli ölçüde azaldı. Bu veriler, kemik iliği türevli hücrelerden elde edilen endojen C'nin anti-enflamatuar etkilere sahip olduğunu ve bu farelerde transplantasyonun başarılı olduğunu doğrulamak için koliti iyileştirdiğini göstermektedir.

Transplantasyonu takiben farelerden alınan kemik iliği ve kan üzerinde de akış sitometrisi yapıldı. Vahşi tip kemik iliği Fitz CD 45.1 için güçlü bir şekilde boyanır, ancak pe için değil, CD 45.2 burada gösterildiği gibi, nakavt kemik iliği PE için güçlü bir şekilde boyanır, ancak burada gösterildiği gibi Fitz için değil. Bununla birlikte, transplantasyondan sonra, nakavt kemik iliği alan vahşi tip farelerden hem kemik iliği hem de kan, PE için güçlü bir şekilde boyandı, ancak Fitz için boyanmadı, bu da lekeli hücrelerin baskın popülasyonunun donörden olduğunu gösterdi.

Benzer şekilde, vahşi tip kemik iliği alan nakavt farelerden alınan kemik iliği ve kan, fitzy için güçlü bir şekilde boyandı, ancak tekrar pe değil, baskın lekeli popülasyonların donör kökenli olduğunu doğruladı. Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği nakli deneyi yapabilmeli ve kemik iliği türevi hücreler aracılığıyla koliti değiştirebilmelisiniz.