Plazma Protein Koruma Kan Alma Kitleri Genomik DNA Ayıklama Pratik ve Yeni Bir Yöntem

Bu video, P 100 tüpleri olarak adlandırılan yeni BDP 100 plazma proteini koruma sisteminden genomik DNA ekstrakte etmek için pratik ve yeni bir yöntemi açıklayacaktır. Serum veya plazma tüplerinden ekstraksiyon geçmişte oldukça yaygın bir prosedür olmuştur, ancak bu yeni P 100 tüpünün burada sunulan ekstraksiyon yöntemiyle kombinasyonu, çok daha az çabayla daha kaliteli DNA elde etmek için yeni ve daha kolay bir yaklaşım sunmaktadır. P 100 tüpünün iç kısmı potasyum EDTA ve proteaz inhibitörleri ile kaplanmıştır.

Bu işlem pıhtılaşmayı önler ve plazma proteinlerini stabilize eder. Santrifüj sonrası test için plazma elde etmek amacıyla kan bu tüplere toplanır. P 100 tüpündeki kan; yoğunluklarına göre üstte plazma, altta eritrositler ve beyaz kan hücreleri şeklinde katmanlara ayrılacaktır.

Bu iki tabaka arasındaki Buffy coat. Plazmanın geri kazanımı genellikle bu tüplerin temel kullanım amacıdır. Antikor ve protein seviyeleri gibi çeşitli ölçümler bu plazma kullanılarak yapılır.

Buffy coat genellikle atılır ancak bu videoda gösterileceği üzere; sekanslama, genotipleme, biyobelirteç tanımlama ve benzeri birçok analiz için yeterli DNA içermektedir. P one hundreds; kap, tüp ve separatör olmak üzere üç ana bileşenden oluşur. Mekanik separatör, buffy coat tabakasının hemen üzerine kadar ilerler.

Buffy coat'a erişim sağlamak için, separatör ile buffy coat arasındaki mesafeyi artırmak gerekir. Bu, %17 sükroz eklenerek gerçekleştirilir. Buffy coat normalde P 102 ile birlikte atılır; ancak bu videoda gösterileceği üzere, -80°C dondurucudan P 100 tüplerini çıkarmadan önce birkaç analitik test gerçekleştirmek için bu tabakadan yeterli miktarda DNA'nın kolayca geri kazanılması mümkündür.

Bir su banyosunu 37 °C'ye ısıtın, her bir P 100 tüpünü sıcak su banyosuna yerleştirin ve tüm örneklerin çözünmesi için yaklaşık beş dakika inkübe edin. Tüm örnekler tamamen çözündüğünde, separatörün üzerinde kalan tüm serumun uzaklaştırılması gerekir. Ardından, separatörün üzerine 5 mL %17 sükroz eklenir; sükroz eklendikten sonra tüm tüpler 2.500 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjlenir. Separatör artık tüpün üst kısmında olduğundan ve buffy coat'tan ayrıldığından, kolayca çıkarılabilir.

Bir kimyasal silgiye %70 etanol püskürtün ve tüm yüzeyi iyice silerek bir ataş kancasını sterilize edin. P 100 tüpünü, steril ataşla birlikte 45 derecelik bir açıyla tutun. Ayırıcının dudağını hafifçe yukarı çekerek ve ayırıcıyı bir biyotehlike torbasına yönlendirerek, ayırıcıyı tüpten çıkarmaya başlayın.

Ayırıcı çıkarıldıktan sonra, buffy coat veya eritrosit tabakalarını bozmadan %17 sükroz tabakasının mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın; tüpteki en üst tabaka artık buffy coat olmalıdır. Bu tabakayı, etiketlenmiş yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Her tüp için alınan buffy coat hacmi değişkenlik gösterecektir ancak 3 mililitreden az olmalıdır.

Tüm tüplerin hacmini normalize etmek için, her bir tüpün hacmini üç mililitreye çıkaracak kadar PBS fosfat tamponlu salin ekleyin. Tüm buffy coat'lar eşit hacimde süspanse edildiğine göre, kalan kırmızı kan hücreleri dokuz mililitre RBC eritme çözeltisi eklenerek uzaklaştırılmalıdır.

Ardından, lizis olmuş eritrositleri buffy coat'tan ayırmak için tüpleri oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyon boyunca birkaç kez alt üst edin. 2.500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme işlemi, DNA'nın ekstrakte edileceği bir pelet oluşturur. Her tüpteki bu atığı sıvı biyotehlike toplama kabına dökün ve peletin yeniden süspande edileceği küçük bir hacim bırakın. Peleti yerinden oynatmak ve yeniden süspande etmek için tüpü vorteksleyin.

Üç mililitre hücre lizis solüsyonu ekleyin ve en az 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Hücreler lizize edildiğinden, proteinler ve DNA artık solüsyon içinde serbestçe süspanse haldedir ve ayrıştırılmalıdır; bir mililitre protein çöktürme solüsyonu kullanarak proteinleri çöktürmeye başlayın ve en az 15 saniye boyunca yüksek hızda VORTEKSEYİN. Şimdi, proteinleri çöktürmek için tüpleri 5 dakika boyunca 2,500 G'de santrifüj edin.

Uygun şekilde ilerleyin. Her yeni tüpe aktarılacak her bir örnek için bir adet 15 mililitrelik konik tüpü etiketleyin. Üç mililitre %100 isopropanol aktarın.

Proteinler çöktürülüp santrifüjlendikten sonra, her tüpte nispeten büyük bir pelet ve çoğunlukla şeffaf bir süpernatan bulunmalıdır; her tüpteki DNA içeren süpernatanı, son aşamada hazırlanan ilgili isopropanol tüpüne aktarın. İzopropanol, çözeltideki DNA'nın küçük beyaz lifli iplikçikler şeklinde çökelmesini sağlayacaktır. İyi bir karışım elde etmek için tüm tüpleri 50 kez altüst edin; ardından, bir DNA peleti oluşturmak için tüm tüpleri 2.500 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. DNA genellikle tüpün dibinde küçük beyaz bir pelet olarak görülür. Ancak, düşük DNA verimi gözle görülmeyebilir. Konsantrasyonlar ölçülene kadar tüm ekstraksiyon işlemlerine devam edin.

DNA peleti olup olmadığına bakılmaksızın, izopropanol süpernatantını atın. DNA'yı %70 etanol ekleyerek yıkayın. Bu işlem, sonraki analizleri etkileyebilecek tüm istenmeyen kalıntıların uzaklaştırılmasını sağlayacaktır; 2.500 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. DNA peletinin tüpün altına iyice yapıştığından emin olmak için tüplerdeki tüm %70 etanolü atın, ardından bir saat boyunca hava ile kuruması için temiz bir kağıt havlu üzerine ters çevirin.

Protokole devam edilirken tüplerde görünür etanol kalmamış olmalıdır. Ekstraksiyonun son adımı, DNA'nın bir çözelti içinde yeniden süspande edilmesidir. Çoğu ekstraksiyon için DNA hidratasyon çözeltisi veya su yeterli seçeneklerdir.

Az miktarda veya hiç görünür DNA lifi ya da peleti oluşmayan örnekler için 250 µL daha az DNA hidratasyon çözeltisi ekleyin; DNA'yı süspande etmek için nazikçe ve kademeli olarak vorteksleyin. Son olarak, süspande olan tüm DNA'yı bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu aşamada, DNA konsantrasyonu ve saflığı NanoDrop veya başka bir spektrofotometre ile okunabilir.

Genellikle, DNA saflığının, yalnızca DNA elde etmek amacıyla toplanan potasyum EDTA'lı tüplerde bulunan tam kandan doğrudan ekstrakte edilen DNA'nın saflığına yakın olması beklenir; DNA konsantrasyonu başlangıç materyalinin miktarına bağlıdır ancak mikrolitre başına 50 nanogramdan mikrolitre başına yaklaşık 1000 nanograma kadar değişebilir ve ortalama mikrolitre başına 200 nanogram civarındadır. Bu protokolü kullanmanın faydası iki yönlüdür. Birincisi, klinisyenlerin iki kez kan almak yerine, iki klinik test için tek bir kan alımı yapmalarına olanak tanır.

İkinci olarak, önceki nesiller yerine modern mekanik ayırıcı tüpler kullanarak DNA içeren hücrelere erişim sağlama sürecini kolaylaştırır. Önceki nesil jel ayırıcı tüplerde, hem jelin kendisi hem de kan pıhtısı, DNA içeren hücreler için birer engel teşkil ediyordu. P 100 tüplerde ise mekanik ayırıcı, %17 Sucrose ile yoğunluk ayrımı kullanılarak kolayca uzaklaştırılır.

Bu, ortalama bir DNA ekstraksiyonunun NanoDrop okumasının ekran görüntüsüdür. Örnek başına P 109 yönteminin kullanıldığı bu ekstraksiyon sonucunda, 209 ng/µL konsantrasyonda 250 µL'lik bir DNA çözeltisi elde edilmiştir. Toplam verim yaklaşık 52 µg olmuştur.

DNA saflığı için temel ölçüt olan 260/280 oranı, 1,88 değeriyle 1,8 ile 1,9 arasındaki optimal aralıkta yer almıştır. DNA saflığı için ikincil bir ölçüt olan 260/230 oranı ise 2,35 değeriyle 2 ile 2,2 arasındaki beklenen aralığa yakın çıkmıştır.

Bunlar oldukça tipik sonuçlardır. Gerçekçi olmak gerekirse, ekstraksiyonlar; standart jel elektroforezi ve tiyobromür boyaması kullanıldığında, ekstraksiyon öncesindeki kanın hacmine ve durumuna bağlı olarak verim ve kalite açısından farklılık gösterecektir. Daha ileri kalite testleri, P 100 tüplerinden ekstrakte edilen genomik DNA'nın, tam kandan ekstrakte edilen DNA kadar sağlam olduğunu göstermektedir.

Bu durum, genomik DNA içeren her şeridin üst kısmında beliren parlak ve kalın banttan açıkça görülmektedir. Bu protokolün önceki yöntemlerin yerine kullanılmasının iki temel avantajı vardır. Birincisi, normalde iki ayrı kan alma işlemini tek bir işleme indirgemesidir.

İkinci olarak, bu protokol tipik SST jel ayırıcı tüpler içeren bir protokolden daha hızlı ve daha temizdir. Pıhtılaşmış kanın rutin olarak parçalanması gerekliliğini ortadan kaldırarak, klinisyenler genetik ve serolojik testler gerektiğinde iki tüp kan alırlar. Genel olarak, altın kapaklı olarak adlandırılan bir SST jel ayırıcı tüp ve mor kapaklı olarak adlandırılan bir potasyum EDTA tüpü alınır; serum SST tüpünden ayrılır ve DNA mor kapaklı tüpten ekstrakte edilir. Bu yöntemi kullanmak, yalnızca tek bir kırmızı kapaklı P 100 tüpü almayı gerekli kılar.

Gel ayırıcı DNA ekstraksiyon yöntemine aşina olan kurumlar, hem serolojik hem de genetik testler için halihazırda tek bir tüp kullanıyor olabilirler. Burada sunulan yöntem, mevcut gel ayırıcı yöntemlere kıyasla kademeli ancak önemli bir iyileştirmedir. Her iki yöntem de bir tür ayırıcının çıkarılmasını gerektirse de, gel genellikle plastik gele göre daha fazla kirlenmeye yol açar.

Ayırıcı tüpler, DNA ekstraksiyonundan önce pıhtılaşmış kanın bir tel örgü aracılığıyla homojenize edilmesini gerektirir. Bu homojenizasyon işlemi zahmetli olabilir ve DNA içermeyen kırmızı kan hücrelerinin belirgin miktarda mevcut olduğu durumlarda DNA ekstraksiyonu daha zor hale gelir. Bu P 100 ekstraksiyon yöntemi, DNA içeren beyaz kan hücrelerinin hematokrit ayrımına olanak tanıyarak, DNA ekstraksiyonuna müdahale edecek çok az sayıda kırmızı kan hücresi bırakır.

DNA'nın önceki nesil jel separatör tüpler yerine P 100 plazma tüpünden geri kazanıldığı bu sistemin birçok avantajı vardır. P 100 tüpleri, magnezyuma bağımlı endonükleazı inhibe eden EDTA ve kan pıhtılaşmasını önleyen antikoagülan içerir. Nihai sonuç, çok daha kolay bir ekstraksiyon protokolü ile daha yüksek DNA bütünlüğüdür; yani pıhtılaşmış kanın parçalanması ve homojenize edilmesi işleminin önlenmesidir.

Ek olarak, plazması uzaklaştırılmış kan, DNA ekstraksiyonu istenene kadar üç yıla kadar süresiz olarak P100 tüplerinde saklanabilir. Ayrıca klinisyenler, daha az kan alımıyla daha kullanışlı hasta verileri elde edebilecek ve böylece prosedürleri uygulanan hastaların üzerindeki stresi azaltacaktır.