Name: Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarından izole edilen kraniyal mezenkim eksplantları kullanarak nöralasyon sırasında hücresel davranışları incelemeyi. Bu yöntem, farmakolojik müdahaleler ve canlı görüntüleme için geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma için ieZ R01-HD058629 tarafından desteklenmektedir

1. ECM Kaplı Kültür Yemekleri veya lameller hazırlanması <ol><li> PBS içinde ECM substrat (Dulbecco Saline, Invitrogen, # 14040-133 Fosfat Tamponlu) çözülmesi ECM stok solüsyonu hazırlayın. -80, Bir 0.2 mm şırınga filtresi (VWR, # 28145-495) ve alikots içinde dondurularak ° C ile filtre </li><li> PBS içinde istenilen konsantrasyona ECM stok solüsyonu seyreltin. MaxGel için DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065) içinde seyreltin. </li><li> Immünofloresan yapılacak ise, etanol daldırma ile 12 mm dairesel cam lamelleri (VWR, # 89.015-724) sterilize ve kurumaya bırakın. Bu, steril laminer başlık içinde yapılmalıdır. Immünofloresan gerçekleştirilmez ise 1.5 adıma atlayın. </li><li> Sıra (Corning, # 3526), ​​24 kuyulu plakanın her bir kuyuya lamelleri sterilize edilir. </li><li> 3 saat boyunca oda sıcaklığında 24 kuyulu plaka ve inkübe her bir kuyucuğa seyreltilmiş substrat çözeltisi 0.5 ml ilave edilir. </li><li> ECM çözümü kapalı aspire ve thre yıkayınPBS e kat. </li><li> PBS kapalı aspire ve hemen kullanın ya parafilm sarılmış ve 4 ° C&#39;de en fazla 2 hafta saklanabilir. </li></ol> 2. Diseksiyon araçları hazırlanması Ilave mangal kömürü ile Sylgard plakaları üreticinin protokolüne göre hazırlanır. Bu levhaların dayanıklı siyah arka embriyo aşağı bağlantılarını ve renkli saydam embriyo görselleştirme kolaylaştırır iyi bir kontrast sunuyor için destek sağlar. <ol><li> Plakaları hazırlamak için bir denge 150 gr Bölüm A sıvı 15 g Kısım B ve 1 g kömür tozu (Dünya Hassas Aletler, # SYLG184) üzerinde bir tri-dökmek behere doğrudan tartın. Tahta bir popsicle sopa veya dil depressor kullanarak birlikte karıştırın. Cam veya plastik 100 cm tabaklar içine dökün. Kabarcıkları yakmak için yemekler yukarıdaki 10 ila 12 inç hakkında tutulan küçük bütan meşale kullanın. Sıra plakaları üzerinde kapakları ve izin ayarlamak için en az 24 saat boyunca oturmak. </li><li> (0,1 mm Diamete bir Minutien pin ucu diseksiyon araçları hazırlamakr) bir pim tutucusu (İnce Scientific araçları, # 26002-10 ve # 26018-17, sırasıyla) alternatif olarak 26 gauge iğne (BD, # 309597) forseps yardımıyla dik açılı kıvrılmış içine kesme araçları olarak kullanılabilir. Bir taş netlik (Güzel Bilimsel Araçları, # 29008-22) kullanarak Netleştirilmiş Öğrenci Dumont # 5 Forseps (Güzel Bilim Araçları, # 91150-20). </li><li> Kullanmadan önce% 70 etanol ile tüm diseksiyon aletleri sterilize edin. </li></ol> 3. Embriyolar Koleksiyonu <ol><li> Hayvan kullanımını komitesi yönetmeliklere göre 8.5 gün sonrası coitum de zaman aşımına hamile fare Euthanize ve rahim kaldırmak. </li><li> Steril PBS ile bir plastik Petri kabı yerleştirin rahim. </li><li> Steril PBS ile bir kez rahim yıkayın. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu altında dikkatle forseps bir çift kullanarak desidual elde edilen embriyo çıkarın. </li><li> Extraembryonic membranlar çıkarın ve gerekirse genotipleme için kaydedin. </li><li> Somitlerin sayarak Sahne embriyo. İdeal aşamaları eksplantlar hücresel beh analiz yapmaknöral kat yüksekliği boyunca Avior nöral kıvrımlar sadece yükseltmesine başlıyor ve kraniyal mezenşimi önemli morfolojilerinden gerçekleşmeden önce 6 ve 10 somite aşamaları arasında olacaktır. </li><li> PBS içinde embriyo yıkayın. Hiçbir fenol kırmızısı (Invitrogen, # 21.063-029) içeren DMEM ile siyah Sylgard tabak koyun. Extraembryonic membranlar çıkarın ve gerekirse genotipleme için kaydedin. </li></ol> 4. Eksplant Hazırlanması <ol><li> Embriyonun baş bölge üzerinde mümkün olan en yüksek büyütmede mikroskop Refocus. </li><li> Her elinde bir diseksiyon iğne ile kesikler yapın. Kesinti yapmak yerine doku ve diğerini tutmak için bir iğne kullanın. </li><li> Rhombomeres anterior embriyonun kafasını kesti. </li><li> Iki eşit parçaya kafasını ikiye bölmek orta hat boyunca kesin. </li><li> Baş ve orta hat dış saçaklar etrafında kesin. Bu kesikler dış sınırda premigratory kret ve yüzey ektoderm kaldırmak ve olacakorta hattan prechordal plakası. Kalan doku eksplant olacak ve göç kranial nöral krest, paraxial mezoderm ve yüzey ektoderm içerecektir. </li><li> Doku kesilmiş olarak, steril bir Pasteur pipeti kullanılarak tabaktan parçalara artığı çıkarın. Bu disseke enkaz ile eksplant karıştırıyor önler. </li><li> Yavaşça 20 ul pipet ve Pipetman yukarı veya aşağı pipeting tarafından eksplant yıkayın. Bu gevşek tutturulmuş hücreler kaldırmak ve eksplantlar üzerinde pürüzlü kenarları engeller. </li><li> Dikkatli bir şekilde 20 ul pipet ucu ile Pipetman ve de kaplanmış kültür merkezinde yer kullanarak sıvı, yaklaşık 10 ul, her eksplant al. </li><li> Eksplant karşılamak için% 15 FBS ile takviye kültür ortamı 20 ul ekleyin. </li><li> 1-2 saat boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi (% 5 CO2, 37 ° C) içinde yer plaka eksplant çanak tabanına takmak için izin verir. Eksplant kuru değil emin olmak için periyodik olarak görüntüledışarı. </li><li> Eksplant bağlı sonra, dikkatli bir şekilde ° C&#39;de bir su banyosu içinde 37 ısıtıldı edilmiş% 10 FBS ile takviye edilmiş Her bir oyuğa 250 ul DMEM ilave edin. Bir kez eksplantları plakası yavaşça mikroskop altında sarsıldığı zaman onlar hareket etmez eklenmiş. </li><li> Doku kültürü inkübatör tabak dönün. </li><li> 24 saat sonra, eksplantlar sıkıca tutturulmuş olacak ve hücrelerin göç başlayacaktır. Bu zamanda farmakolojik ajanlar ortama ilave edilebilir. </li><li> 48 saat sonra kaplama, hücreler eksplantlar göç olacaktır. Göç mesafesi görüntülenebilir ve görüntülü olabilir. Eksplantları uzun inkübasyonlar azalmış canlılık belirtileri göstermeye başlayabilir çünkü biz genellikle bu noktada kültür durdurun. A, akridin turuncu ve tripan mavi boyası gibi hayati da eksplant canlılığı kontrol etmek için de kullanılabilir. </li><li> Bu noktada görüntüleri eksplant göç hücrelerinin mesafe ve sayısını belgelemek için elde edilebilir. Alternatif olarak, eğer eksplantlar, lamelleri üzerine ekildionlar sabit ve immünohistokimyasal analizler ilgi proteinlerin görselleştirmek için yapılabilir. </li></ol> Protokolünde Kritik adımlar <ol><li> Yaklaşık olarak aynı boyut ve eksplantlar kesin. </li><li> İstediğiniz eksplante dokusu ile kafa karıştırıcı enkaz önlemek için diseksiyon gibi kesme plakası kapalı tüm diseksiyon enkaz temizleyin. </li><li> Kuyularda veya lamelleri üzerine kaplama eksplantları kuyu merkezinde eksplant ile medya damlacık yer emin olun zaman. </li><li> Medya ile de sel önce takmak için yeterli zaman eksplantasyona bekleyin. </li><li> Tedavi şartları kullanılan her test yüzey ve farmakolojik ajan için standardize edilmelidir. </li><li> İki eksplantlar (soldan ve bir nöral tüpün doğru bir kişi) her bir embriyo yapılabilir. </li><li> Farklı deneysel koşullar altında mutant fare hücre hatlarından göç test ederken, tedavi edilen grup içinde bir mutantı, kontrol grubunda eksplant ve diğer koydu. </li></ol> Sorun Giderme <ol><li> Eksplantları takmak için başarısız olursa, eki için ayrılan süre artar. Bizim tecrübelerimize göre, eksplantlar yaklaşık yarısı binmemelidir ve büyük eksplantlar daha verimli yapışır. </li><li> Eksplantları kuyunun çevresine eklerseniz bunlar görüntü zor olacaktır. Kuyunun merkezi eksplantlar yerleştirdiğinizden emin olun. </li><li> İdeal eksplantları yaklaşık aynı boyutta olacaktır. Bununla birlikte, eksplant büyüklüğü arasındaki çelişkiler eksplantlarından hücre göçü quanitating zaman bir düzeltme faktörü olarak eksplant çap kullanılarak düzeltilebilir. </li><li> Bulaşması halinde steril çalışma koşulları kullanılmaktadır emin olun. Tüm araçlar ve çalışma yüzeyleri% 70 etanol ile sterilize edilmelidir. Pipetler ve Petri kutularına yeni ve steril olmalıdır. </li><li> Eksplantları diseksiyonu sırasında kaybolan alıyorsanız, periyodik eksplant kaybını engellemek için enkaz kaldırma. </li><li> Mastering diseksiyonu zaman alıcıdır ve pratik gerektirir. Optimal büyütme, keskin diseksiyon araçları ve iğneler yardımı. </li></ol>

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+cranial+region--normal+and+abnormal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the cranial region--normal and abnormal.</a> Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).</li>
<li>Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+normal+and+abnormal+neurulation%3A+evidence+from+embryo+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies.</a> The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).</li>
<li>Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+mammalian+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of mammalian neurulation.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+fibronectin%2C+laminin+and+entactin+in+the+neurulating+rat+embryo+studied+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcian+blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material%3A+effect+of+different+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+II.+Patterns+of+hyaluronate+synthesis+and+distribution+in+embryos+developing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+I.+Patterns+of+mesenchymal+cell+distribution+and+proliferation+in+embryos+developing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mesenchymal+cell+and+hyaluronate+distribution+correlate+with+in+vivo+elevation+of+the+mouse+mesencephalic+neural+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds.</a> Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).</li>
<li>Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+in+mammalian+craniofacial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme.</a> Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).</li>
<li>Noden, D. M., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+and+interactions+between+cranial+mesoderm+and+neural+crest+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations.</a> Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).</li>
<li>Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Streptomyces+hyaluronidase+on+tissue+organization+and+cell+cycle+time+in+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).</li>
<li>Morriss-Kay, G., Tuckett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localisation+of+chondroitin+sulphate+proteoglycans+and+the+effects+of+chondroitinase+ABC+in+9-+to+11-day+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos.</a> Development. , 106-787 (1989).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparitinase+treatment+of+rat+embryos+during+cranial+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation.</a> Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).</li>
<li>Sarkar, A. A., Zohn, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hectd1+regulates+intracellular+localization+and+secretion+of+Hsp90+to+control+cellular+behavior+of+the+cranial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).</li>
<li>Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hectd1+ubiquitin+ligase+is+required+for+development+of+the+head+mesenchyme+and+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure.</a> Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).</li>
<li>Chen, Z. F., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist+is+required+in+head+mesenchyme+for+cranial+neural+tube+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis.</a> Genes Dev. 9, 686-699 (1995).</li>
<li>Tzahor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonists+of+Wnt+and+BMP+signaling+promote+the+formation+of+vertebrate+head+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle.</a> Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).</li>
<li>Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+epithelium+and+the+role+of+neural+crest+cells+in+the+initiation+of+the+mammalian+tooth+germ%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ.</a> Development. 103, 155-169 (1988).</li>
<li>Newgreen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+explants+of+embryonic+chick+mesenchymes+and+epithelia+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin.</a> Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).</li>
<li>Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+ECM+mechanics+and+cytoskeletal+tension+as+important+regulators+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada uygulanan yöntem, kranial mezenşimi hücrelerin davranışlarını incelemek için güçlü bir tahlil sağlar. Burada yer alan statik analiz ek olarak, GFP-etiketli proteinlerin ekspresyonu ile parlak saha olarak ya da kombinasyon halinde görüntüleme deneyler yaşayan bunlar eksplant göç gibi, gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilmektedir. Canlı görüntüleme deneyler için, eksplantlar Dii ile etiketlenmiş olabilir veya paraxial mezoderm, ROSA-YFP gelen nöral krest göç ayırt etmek; Mesp1-CRE veya ROSA-YFP; Wnt1-CRE veya diğer transgenik hatları kullanılabilir. Kraniyal mezenşimi-ECM etkileşimleri de bu eksplant tahlil kullanılarak incelenebilir. İşte biz bu hücrelerin farklı derecelerde bunlar üzerinde göç ve ECM hücrelerinin morfolojisini etkilediğini göstermek için kranial mezenşimi mevcut olan farklı ECM yüzeylerde plaka eksplantlar. Ayrıca, eksplant cel davranışlarını erişmek için üç boyutlu bir matriks içinde gömülü olabilirBu bağlamda ls. Bu eksplant tahlil göç düzenleyen ve değiştirebilirsiniz içsel ve dışsal ipuçlarını analiz kraniyal mezenşimi davranışları üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonlar etkisinin analizine iyileştirilebilir. Örneğin, biz Hectd1 mutant kranial mezenşimi 15 anormal hücre davranışlarını aşırı hsp90 salgı rolü ayırt etmek bizim çalışmalarda bu testte kullanılmıştır. Bu deneylerde, bu Hectd1 mutant hücrelerin anormal davranışları fazla hücre dışı HSP90 15 bağlı olduğunu göstermek için HSP90 salgılanmasını engellemek için anti-HSP90 antikor ile eksplantlar, HSP90 proteini, geldanamycin ve DMA (dimetil amelioride) tedavi edildi. Benzer yaklaşımlar farmakolojik kraniyal mezenşimi normal veya anormal morfolojilerinden altta yatan ek yolları kesmek için kullanılan olabilir. Tahlil tamamlandıktan sonra, eksplantlar ve göç eden hücrelerin yöntemler bir dizi ile analiz edilebilir. Örneğin, immünohistokimyasal analizler cBir hücre hareketleri için kritik proteinlerin yerelleştirme incelemek için istihdam edilecek. Transcriptome analizleri de tedaviler gen ekspresyonu nasıl etkilediğini belirlemek için istihdam edilebilir. Bu tekniğin bir önemli sınırlama onlar in vivo olarak ortaya çıkıyordu üç boyutlu modeli davranışları değil olmasıdır. Eksplantlar floresan protein-işaretli hücresel bölümlerin ifadesi ile birlikte, üç boyutlu bir matris (örneğin, Matrigel) gömülü olan protokol Modifikasyonu Bu sorunu çözmek için gerekli kullanılabilirdi. Bu değişiklikler yapılmıştır bile, in vivo olarak, bu, bu ex vivo deneyi de görülen davranış ilişkilendirmek için başka deneyler gerekli olacaktır. Diğer sınırlamalar istatistiksel olarak anlamlı verileri oluşturmak için yeterli sayıda üretmek için gerekli embriyoların çok sayıda bulunmaktadır. En önemlisi, diseksiyon nispeten basit, o ana uygulama gerektirir.

Kranial bölgede Nöral tüp kapanma embriyonik gün 8,5 (E8.5) ve fare embriyo 9.5 arasında gerçekleşir. Düzgün anensefali, insanlarda ortak yapısal bir doğum kusuru merkez sonuçlar nöral tüp kapatmak ve Başarısızlık hayat ile uyumsuz. Sefalik nöral tüpün kapanmasında sürücü kuvvetler nöral doku kendisi ve çevresindeki epidermis ve mezenşimi 3 hem de üretilir. Kraniyal mezenşimi Özellikle genişlemesi kranial nöral kıvrımlar 1,2 yükselmesine için gerekli olduğu düşünülmektedir. Kranial mezenşimi heparin sülfat proteoglikan, kondroitin sülfatlar ve hyaluronat 4-8 gibi belirli glikozile proteinler ECM proteinleri bakımından zengindir. Nöral krest hücreleri nöral tüp kapatılması sonrasında dorsal nöral tüp göç tavuk embriyo aksine, fare embriyo nöral krest nöral kıvrımlar r başlaması aynı zamanda göçimkb (5 somite aşamasından sonra). Böylece fare embriyo Nörülasyonu sırasında, kafatası mezenşim nöral tepe ve paraxial mezoderm türetilmiş hücrelerden oluşur. Nöral krest ve paraxial mezoderm nüfus gelişimi farklı zamanlarda indüklenir; embriyonun farklı pozisyonlarda lokalize ve farklı yapıları 9,10 dönüşebilir. Paraxial mezoderm primitive streak kaynaklanan ve varsayımsal nöral plakayı rol oynadığı embriyo ön bölgeye göç eder. Nöral krest nöral plak ve epidermal ektoderm kavşağında indüklenir, geçiş mezenşimin bir epitel uğrar ve kemirgen embriyoda nöral kat yüksekliği hemen önce delaminates. Nöral krest hücrelerinden branşiyal kemer, frontonasal ve perioküler mezenşimi için subectodermal paraxial mezoderm içinde stereotipik yollar boyunca göç ederler. Paraxial mezoderm kafatasının ve yüz kasları kemiklere bazı katkı sağlayacak; oysa inciE nöral krest kranial sinirler 9-11 yanında kafatası ve yüz kemiklerinin diğer katkıda bulunacaktır. Paraxial mezoderm ve nöral krest soylar ayirt sırasıyla 9 Mesp1-cre ve Wnt1-CRE transgenik fare hatları ile işaretlenmiş olabilir. Nöral tüpün kapanmasında kranial mezenşimi hayati rolü deney ile kanıtlandı olmuştur nerede ECM, Nörülasyonu düşüklüğüne nöral tüpün kapanmasında 7 sırasında hyalüronidaz chondroitinase ABC, heparitinase veya Diazo-okso-norlösin (DON) gibi ajanların bozucu olan kemirgen embriyo tedavisi, 12-14. Bu deneylerde, Nörülasyonu sonrasında statik bölümlerinin histolojik analiz kraniyal mezenşimi 7,12-14 arasında ilişkili dysmorphogeneis saptandı. Teratojenik ajan birden dokulara erişimi beri Ancak, kranial mezenşimi gerçekten hedef doku olup olmadığını tespit edilecek kalır. Sonuç destek olarak bu dokuNörülasyonu için gerekli olan, kraniyal mezenşimi eksensefali 15-17 ile bazı fare mutantlar histolojik analizler üzerine anormal görünür. Yine de, çoğu durumda, kafatası mezenşim bir hücresel davranışı üzerindeki mutasyon etkisi giderilmiş değildir. Biz doğrudan kranial mezenşimi hücreleri 15 davranışı üzerinde genetik bir mutasyon ya da farmakolojik manipülasyon sonucu incelemek için bir ex vivo eksplant tahlil geliştirdiler. Bu tahlil, kranial mezenşimi farklılaşma potansiyeli ulaşmak için Tzahor ark 2003 tarafından yayınlanan benzer olduğunu temelini anterior nöral temelini biz kranial mezenşimi daha ön nüfusun göç özelliklerini incelemek için eksplant diseksiyon değiştirdiyseniz hariç rhombomeres 18 plaka. Bizim yöntemi de ke ile nöral krest göç davranışlarını analiz etmek tavuk embriyo gerçekleştirilen eksplant deneyleri bir değişikliky farklılıklar. Önceki hazırlıkları nöral krest veya daha posterior paraxial mezoderm 19,20 eksplante oylandı. Ayrıca, tavuk embriyosunda nöral kat yükselmesi sırasında, nöral krest henüz dorsal nöral tüp göç olmamıştır ve böylece anterior paraxial mezodermin alınan eksplantlar nöral krest hücreleri içeren olmaz. Bizim analizde, paraxial mezoderm, nöral krest ve yüzey ektoderm oluşan kranial mezenşimi eksplantlar bir substrat üzerine hazırlanan ve kaplanır. Genetik mutantlar gelen eksplant izolasyon, farklı ECM veya farmakolojik tedaviler eksplantlar kaplama dahil Deneysel manipülasyon yapılabilir. Eksplant ve mesafe, sayısı ve davranış Hücreler göç analiz ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilir. Buna ek olarak, bu hazırlık canlı görüntüleme teknikleri ile hücresel göç analizleri iyileştirilebilir. Kürk göç deneyden sonra, eksplantlar tespit edilebilir ve immünohistokimyasal analizler tabitedavilerin etkisini açıklamak Ther. Genel olarak, burada sunulan protokol kraniyal mezenşimi davranışını araştırmak için basit bir ex vivo bir testtir. Temsilcisi deney olarak, farklı ekstraselüler yüzeylerde kranial mezenşimi göç incelemek için bu testte kullanmaktadır.

kranial mesenchyme hücresel davranış değerlendirme için bir eksplantasyon assay

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Merkezi sinir sistemi Nörülasyonu gibi bilinen bir işlem nöral tüp oluşumu ile sonuçlanan kompleks morfogenetik bir dizi hareket geçer sinir plaka elde edilir. Nörülasyonu sırasında nöral plakayı temelini mezenşimi morfogenezi nöral kat yüksekliği sürücü inanılıyor. Kranial mezenşimi paraxial mezoderm ve nöral krest hücrelerinden oluşur. Kraniyal mezenşimi formun hücreleri yıldızsı şekilli hücrelerden oluşan ve nöral kıvrımlar destekleyen ekstrasellüler matriks (ECM) ipliklerini karışmasının bir pourous ağ örgüsü. Nörülasyonu sırasında kraniyal mezenşimi genişlemesi sonucunda basmakalıp çevrilme uğrar ve bu hareketlerin nöral kat yüksekliği için bir itici güç sağlamak için inanılıyor. Ancak, kranial mezenşimi morfolojilerinden sürücü yolları ve hücresel davranışları kötü okudu kalır. ECM ve kafatası mezenşim underly thes hücreler arası etkileşimleriE hücre davranışları. Burada bu hücrelerin davranışlarını karakterize etmek için tasarlanmış basit bir ex vivo eksplant tahlil açıklamaktadır. Bu testte daha bu hücrelerin davranışını karakterize etmek dahil sinyalizasyon yolakları ve canlı görüntüleme analizleri incelemek için farmakolojik manipülasyonlar iyileştirilebilir. Bu ECM bileşenlerinin çeşitli kafatası mezenşim ve göç özelliklerini karakterize etmek için bu tahlil yararlarını gösteren temsili bir deney sunulmaktadır.

Kafatası mezenşim eksplantlar göç eden hücrelerin görünümü Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. , Laminin (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (DMEM içinde 1:500 seyrelti, biz fibronektin (Sigma # F1141 100 mg / ml) içeren Nörülasyonu sırasında kafa mezenşim içinde mevcut olan çeşitli ECM substratlar üzerinde göç test ; Sigma # E0282) ve hiyalüronik asit (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Hiçbir ECM (Veri gösterilmemiştir) mevcut olduğunda Hücreler eksplant göç başarısız ve tüm yüzeylerde hücrelerin desteklenen göç test. Şekil hem de eksplantlar göç eden hücre boyutları her iki alt tabaka bağlıdır. Daha önceki çalışmalarda farklı ECM ​​ile hücre etkileşimi tarafından üretilen mekanik kuvvetlerin hücrelerin 21 şekli ve göç özellikleri hem de etkili olduğunu göstermek olarak bu beklenmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5 inç&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; Şekil 1. Eksplantlar hazırlanması. (A) hazırlamak için eksplantlar, E8.5 embriyolar desidual ve extraembryonic dokulardan disseke edilir. (B) embriyo kafaları gövde ön dan rhombomeres için disseke edilir. Eksplantlarından sırasıyla, sınırda orta hatta ve premigratory nöral krest ve yüzey ektoderm de prechordal plakasını kaldırmak için orta hat ve başın dış kenarları dokular çıkararak tarafından hazırlanır. (C) Eksplantlarından orta hat ve sınırlardaki premigratory nöral krest ve yüzey ektoderm de prechordal plaka çıkarmak için baş orta hat ve dış kenarlarından doku keserek hazırlanır. (D) eksplantlar ECM kaplı tabaklar / lameller üzerine küçük bir ortam hacmi içinde yerleştirilir ve daha fazla ortam ilave edilmeden önce eklenmesi sağlanır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı yüzeylerde kaplama eksplantlarından kranial mezenşimi hücrelerin Göç. Eksplantlarından Fibronektin, laminin, MaxGel ECM veya Hyaluronik asit kaplama ve kültür içinde 48 saat sonra fotoğraflandı. Boyut bar = 200 mm.

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri uğrar<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Burada basit bir tarif<em&gt; Ex vivo</em&gt; Nörülasyonu sırasında kraniyal mezenşimi ve hücresel davranışları karakterize tahlil eksplantasyona. Bu testte farmakolojik manipülasyonlar ve canlı görüntü analizlerinin mükellef olması dahil birçok uygulama vardır.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Merkezi sinir sistemi, bir dizi karmaşık morfogenetik hareket geçirerek ... oluşumuyla sonuçlanan nöral plakadan köken alır.

Bu prosedürün amacı, tanımlanmış kültür koşulları altında kranial meen chiming kültürünün davranışını izlemektir. İlk adım, zamanlanmış gebe bir fareden uterus boynuzlarının toplanmasıdır.Çiftleşmeden 8,5 gün sonra. İzole edildikten sonra, embriyolar desidua tabakasından çıkarılır ve genotipleme için vitellus kesesi uzaklaştırılır. Ardından, kranial mechy yapıları mikrodiseksiyonla ayrılır ve hücre dışı matris kaplı doku kültürü plakalarına aktarılır.X eksplantlarının yapışmasına izin verilir ve belirlenmiş farmakolojik ajanların varlığında veya yokluğunda 48 saate kadar kültüre edilirler. Nihayetinde, hücre göçündeki farklılıkları göstermek için eksplantların görüntüleri alınır. Bu yöntem, nöral katlanma yükselmesi sırasında kranial dokunun davranışını kontrol eden ve bu sürece dahil olan sinyal yolakları ve hücre dışı matris proteinlerinin neler olduğu gibi temel soruları yanıtlamak için faydalıdır.Mikrodiseksiyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve ustalaşmak için sabır ve pratik gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Başlamak için, eğer immünohistokimya yapılacaksa lamine lamlar hazırlayın; aksi takdirde bu adımı atlayın ve doku kültürü plakalarını doğrudan ECM ile kaplayın. 12 milimetrelik dairesel cam lamine lamları etanol içine daldırarak sterilize edin. Havada kurumalarını bekleyin. Ardından, 12 kuyucuklu bir plağın her bir kuyucuğuna sterilize edilmiş bir lamine lam yerleştirin.Laminer akışlı kabin içerisinde, lamelleri veya doku kültürü plağının tabanını kaplamak için 1 mL hücre dışı matriks (ECM) ekleyin. Plağı 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından ECM çözeltisini aspire edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Bu aşamadan sonra, kaplanmış plaklar hemen kullanılabilir veya streç filmle sarılarak 4 °C'de iki haftaya kadar saklanabilir.Yarı saydam embriyonun görselleştirilmesinde Ade kullanılır. Üreticinin protokolü takip edilerek, dirençli siyah arka planlara sahip Syl guard plakaları hazırlanır.Bir toplu iğneyi iğne tutucuya yerleştirerek diseksiyon aletlerini hazırlayın. Her şey hazır olduğunda, pensleri bilemek için bir bileme bloğu kullanın. Quot sonrası 8,5. günde olan, zamanlanmış gebe bir fareden uterus örneği toplayın.İzole edilen uterusu steril PBS içeren bir kaba yerleştirin ve yıkayın. Diseksiyon mikroskobu altında, pens ve makas kullanarak bireysel desiduaları birbirinden ayırın. Embriyonun desiduadan çıkmasına neden olacak baskı oluşturmamaya dikkat ederek, uterine bağ dokusunu yırtma hareketiyle uzaklaştırın.Pens yardımıyla, plasentanın karşı tarafındaki uterus dokusunu dikkatlice yırtın. Vitellus kesesi içindeki embriyoyu açığa çıkarmak için, pensle embriyoyu ve vitellus kesesini plasentadan koparın ve uterus dokusunu kaptan çıkarın. Ardından, pensle nazikçe yırtarak vitellus kesesini embriyodan ayırın.İzole edilen vitellus kesesini, genotipleme için bir pipet yardımıyla eppendorf tüpüne yerleştirin; ardından somitleri sayarak embriyonun evresini belirleyin. İdeal olarak, embriyo altı ile on somit arasında, yani orta evrelerde olmalıdır. Bu evrede, nöral kıvrımlar yükselmeye yeni başlamıştır ve kranial mezenşimin ana morfogenezi henüz gerçekleşmemiştir.Evre belirlendikten sonra, embriyoyu fenol kırmızısı içermeyen DMEM bulunan siyah bir hücre koruma plakasına aktarın. İlk olarak, mümkün olan en yüksek büyütmeye sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, her iki elinizde bir diseksiyon iğnesiyle embriyonun başına odaklanın ve başı rmba sınırının anteriorundan diseke edin. Ardından, ikiye bölmek için orta hat boyunca kesin.Her iki elinizde birer diseksiyon iğnesi kullanarak başı iki eşit yarıya ayırın. Embriyo başının kenarı ve orta hattı boyunca dış saçakları disseke edin. İstenen açıklamanın istenmeyen dokuyla karıştırılmasını önlemek için gerekli kısımları uzaklaştırın.Eksplan; göç eden kranial nöral kristayı, paraksiyal mezodermi ve yüzey ektodermini içerecek, gevşekçe tutunmuş hücrelerin uzaklaştırılması sağlanacaktır. 200 µL'lik bir pipet ucu ile dikkatlice yukarı-aşağı pipetleme yapın. Eksplanı ise bir pipet ucu ile dikkatlice alın.Kaplamalı bir doku kültürü kabının merkezine yaklaşık 10 µL DMEM yerleştirin ve üzerine %15 FBS ile desteklenmiş 20 µL ılık DMEM ekleyin; kültür kabı artık bir doku kültürü inkübatörüne aktarılabilir. Yaklaşık bir ila iki saat sonra eksplant yapışacaktır ve ek olarak 250 µL besiyeri eklenebilir. Yaklaşık 24 saat sonra, eksplant lamel üzerine sıkıca tutunmuş olacaktır.Bu aşamada, ek 24 saatin ardından medyuma farmakolojik ajanlar eklenebilir, hücreler bunlardan göç edecektir. Göç eden hücrelerin sayısını ve mesafesini belgelemek için tipik olarak görüntüler alınır. Bu noktada, daha uzun inkübasyon sürelerinde canlılığın azaldığına dair belirtiler görülmeye başlar.Kranial mezankim ve kıkırdak öncülü bitkilerinden göç eden hücrelere ilişkin örnekler burada sunulmuştur. Farklı substratlarda 48 saat sonra, eksplanttan göç eden hücrelerin hem şekli hem de boyutu substrata bağımlıdır. Substrat göçü; fibronectin, laminin, matrigel, ECM ve hyaluronik asit üzerinde desteklenmiştir.Bu prosedürün ardından, nöral kıvrım yükselmesi sırasında kranial mezenkimin davranışını düzenleyen yolakları daha ayrıntılı incelemek için immünofloresan ve canlı görüntüleme gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Kraniofasial kıkırdaklar diğer dokuları ile yakın temas içinde gelişir ve canlı hayvan işlemek için zordur. Elektroporasyon erken embriyonik etkileri atlayarak kraniyofasiyal iskeletin büyüme sırasında moleküler araçlar sunmak için kullanıyor. Bu yaklaşım, aday moleküllerin etkin bir şekilde test etmek için bize izin...

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Bu video, civciv embriyolarının orta beyin bölgesinden kraniyal nöral kıvrımları izole etmek için bir tekniği göstermektedir. Nöral kıvrımların ayrıntılı bir diseksiyon sürecini, bunların yerleştirilmesini ve fibronektin kaplı lameller üzerine bağlanmasını ve ardından nöral kıvrımlardan nöral krest hücre göçünün gözlemlenmesini sunar.

Nöral krest hücre kültürü için bir civciv embriyosundan kraniyal nöral kıvrımların izole edilmesi

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.

Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Fare embriyonik kök hücrelerinden kraniyal nöral krest hücreleri üretmek için tekrarlanabilir boyutta nöroküreler üreten üç boyutlu (3D) bir in vitro farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu metodolojinin önceki protokollere kıyasla değişkenliği azalttığını ve kraniyal nöral krest hücre gelişimini incelemek için çoğullanmış test için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Öğrenin, fare embriyolarından izole edilen kraniyal mezenkim eksplantları kullanarak nöralasyon sırasında hücresel davranışları incelemeyi. Bu yöntem, farmakolojik müdahaleler ve canlı görüntüleme için geliştirilmiştir.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Daha fazla video keşfet