Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Bu prosedürün amacı, tanımlanmış kültür koşulları altında kranial mezenkim kültürünün davranışını izlemektir. İlk adım, zamanlanmış gebe bir fareden uterus boynuzlarını toplamaktır.

Coum sonrası 8,5 gün. İzole edildikten sonra embriyolar desidüadan çıkarılır ve genotipleme için vitellus kesesi uzaklaştırılır. Ardından, kranial bölge mikrodiseksiyonla ayrılır ve hücre dışı matris kaplı doku kültürü plakalarına aktarılır.

X eksplantlarının yapışmasına izin verilir ve tanımlanmış farmakolojik ajanların varlığında veya yokluğunda 48 saate kadar kültürlenirler. Nihayetinde, hücre göçündeki farkları göstermek için eksplantların görüntüleri alınır. Bu yöntem, nöral katlanma yükselmesi sırasında kran kullanma türünün davranışına hangi sinyal yollarının ve hücre dışı matris proteinlerinin dahil olduğu ve bunları nasıl kontrol ettiği gibi temel soruların yanıtlanması için kullanışlıdır.

Mikrodiseksiyon basamaklarının öğrenilmesinin zor olması ve uzmanlaşmak için sabır ve pratik gerektirmesi nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Başlamak için, eğer immünohistokimya yapılacaksa lamel camları hazırlayın; aksi takdirde bu adımı atlayın ve doku kültürü plakalarını doğrudan ECM ile kaplayın. 12 milimetrelik dairesel steril cam lamelleri etanola daldırarak hazırlayın. Kendi kendine kurumaya bırakın. Ardından, 12 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna steril bir lamel cam yerleştirin.

Laminer akışlı kabinde çalışarak, lamel camlarını veya doku kültürü plağının tabanını kaplamak için 1 mL hücre dışı matris veya ECM ekleyin. Plağı 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası ECM solüsyonunu aspire edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Bu aşamadan sonra, kaplanmış plaklar hemen kullanılabilir veya sarılarak 4 °C'de iki haftaya kadar saklanabilir.

Yarı saydam embriyonun görüntülenmesinde Ade kullanımı. Üretici protokolü takip edilerek, dirençli siyah arka planlara sahip Syl guard plakaları hazırlanır.

Bir toplu iğneyi iğne tutucuya yerleştirerek disseksiyon aletlerini hazırlayın. Her şey hazır olduğunda, pensetleri bilemek için bir bileme bloğu kullanın. Quot sonrası 8,5 günlük olan, zamanlanmış gebe bir fareden uterusu toplayın.

İzole edilen uterusu steril PBS içeren bir kaba yerleştirin ve yıkayın. Diseksiyon mikroskobu altında, pens ve makas kullanarak tekil desidua bölgelerini birbirinden ayırın. Embriyoyu desidua içerisinden basınçla fırlatmamaya dikkat ederek, uterus bağ dokusunu yırtma hareketiyle uzaklaştırın.

Plasentanın karşı tarafındaki uterus dokusunu pens yardımıyla dikkatlice yırtın. Vitellüs kesesi içine hapsolmuş embriyoyu açığa çıkarmak için, pensle embriyoyu ve vitellüs kesesini plasentadan ayırarak tutun ve uterus dokusunu kaptan çıkarın. Ardından, pensle nazikçe yırtarak vitellüs kesesini embriyodan ayırın.

İzole edilen vitellus kesesini, genotipleme için bir pipet yardımıyla bir eppendorf tüpüne yerleştirin; ardından somitleri sayarak embriyonun evresini belirleyin. İdeal olarak, embriyo altı ile on somit arasında, yani orta evrelerde olmalıdır. Bu evrede, nöral kıvrımlar yükselmeye yeni başlamıştır ve kranial mezenşimin ana morfogenezi henüz gerçekleşmemiştir.

Evre belirlendikten sonra, embriyoyu fenol kırmızısı içermeyen DMEM bulunan siyah bir hücre koruma plakasına aktarın. İlk olarak, mümkün olan en yüksek büyütmeye sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, her iki elinizde bir diseksiyon iğnesi tutarak embriyonun başına odaklanın ve başı rmba meres'in anteriorundan disekte edin. Ardından, ikiye bölmek için orta hat boyunca kesin.

Her iki elde birer diseksiyon iğnesi kullanarak başı iki eşit yarıya ayırın. Embriyo başının kenarları ve orta hattı boyunca dış kısımları diseke edin. İstenen açıklığın istenmeyen dokuyla karıştırılmasını önlemek için gerekirse dokuları uzaklaştırın.

Gevşekçe yapışmış hücreleri uzaklaştırmak için ekplant; göç eden kranial nöral kristayı, paraksiyel mezodermi ve yüzey ektodermini içerecektir. 200 µL'lik bir pipet ucuyla dikkatlice aşağı yukarı pipetleme yapın. Ardından ekplantı, bir pipet ucuyla dikkatlice alın.

Kaplanmış bir doku kültürü kabının merkezine yaklaşık 10 µL DMEM yerleştirin ve üzerine %15 FBS ile takviye edilmiş 20 µL ılık DMEM ekleyin; kültür kabı artık bir doku kültürü inkübatörüne aktarılabilir. Yaklaşık bir ila iki saat sonra, eksplant yapışacaktır ve 250 µL ek besiyeri eklenebilir. Yaklaşık 24 saat sonra, eksplant lamelle sıkıca yapışmış olacaktır.

Bu aşamada, ek 24 saatin ardından besiyerine farmakolojik ajanlar eklenebilir; hücreler bunlardan göç edecektir. Göç eden hücrelerin sayısı ve mesafesini belgelemek için genellikle görüntüler alınır. Bu noktada, daha uzun inkübasyon sürelerinde canlılığın azaldığına dair belirtiler görülmeye başlar.

Kranial me ve chix bitkilerinden göç eden hücrelere dair örnekler burada sunulmuştur. Farklı substratlarda 48 saat sonra, eksplanttan göç eden hücrelerin hem şekli hem de boyutu substrata bağlıdır. Göç; fibronectin, laminin, max gel, ECM ve hyaluronik asit üzerinde desteklenmiştir.

Bu prosedürün ardından, nöral katlanma yükselmesi sırasında kranial mezenkimin davranışını düzenleyen yolları daha ayrıntılı incelemek için immunofloresan ve canlı görüntüleme gibi diğer yöntemler kullanılabilir.