Kemik Metastaz Modelleri

Bu prosedürün genel amacı, kemikte tümör hücresi büyümesini ve ardından kemik yıkımını tetikleyecek şekilde tümör hücreleri enjekte etmektir. Bu işlem, öncelikle tümör hücrelerinin soğuk PBS içinde süspande edilmesi ve buz üzerinde bekletilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, uygun sayıda hücre, anestezi uygulanmış bir farenin sol kardiyak ventrikülüne veya tibiasına enjekte edilir.

Ardından, kemik tümörü büyümesi ve kemik parametreleri birden fazla görüntüleme tekniği ile boylamsal olarak izlenir. Son olarak, tümör ve kemik parametrelerinin bitiş noktası nicelendirmesi gerçekleştirilir. Nihayetinde, in vivo ve ex vivo floresans veya lüminesans 2D radyografi 3D kombinasyonu uygulanır.

Tümör büyümesini ve kemik mikroçevresindeki değişiklikleri hücresel ve yapısal büyüme düzeylerinde göstermek için mikro CT ve histoloji kullanılır. Bu yöntemler, meme ve prostat kanserinin metastatik kolonizasyonuna kemikte hangi faktörlerin izin verdiği gibi, kanser metastazı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre hazırlığının gösterimini, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Alisa Merkel gerçekleştirecektir; hücreleri bir haftadan az süreyle muhafaza edin.

GFP etiketli MDA-MB-231 klonlarını, %10 FBS ve 0,1 mg/mL penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında, 37 °C'de ve %5-8 CO₂ atmosferinde kültüre edin. Hücreler %80-90 konfluense ulaştığında pasajlayın ve 1:10 dilüsyon oranında yeniden ekim yapın. Hücreleri inokülasyona hazırlamak için, %80-90 konfluense ulaştıklarında 10 mL %0,15 tripsin EDTA kullanarak tripsinize edin.

%10 FBS içeren buz gibi soğuk DMEM ile hücreleri hemen 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti 50 mililitrelik konik bir tüpte, 25 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin ve hücreleri sayın; hücreleri pelletleyin ve ardından hücreleri, intrakardiyak inokülasyon için 10⁶ hücre/ml ve intratibiyal enjeksiyon için 250.000 hücre/ml konsantrasyonda buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.

Bu deneyler için, enjeksiyondan beş ila 10 gün önce Tela 29 20 x diyeti ile beslenmiş, dört ila altı haftalık dişi immün yetmezliği olan fareler kullanılır. Fare, %2,5 isoflorin içeren bir hazne içerisinde anesteziye alındıktan sonra, havalandırmalı bir davlumbaz altındaki burun konisine taşınır ve sırt üstü konumlandırılır. Göğüs bölgesi önce %10 povidon iyot çözeltisi, ardından %70 Etanol ile yıkanır.

Farenin göğsünü, sternal çentik ile ksifoid çıkıntının tepe noktası arasındaki orta noktaya ve sternumun hafifçe soluna gelecek şekilde enjeksiyon için işaretleyin. Ardından, 300 mikrolitrelik 28 gauge yarım inçlik bir insülin şırıngası kullanın. Piston ile menisküs arasında boşluk oluşturmak için küçük bir hava kabarcığı çekin ve bir elinizle farenin derisini gergin tutarken 100 mikrolitre hücre çekin.

İğneyi dik tutun ve yerleştirin; sol Kardiyak ventriküle başarılı bir yerleştirme, şırıngada belirgin, parlak kırmızı bir kan nabzı ile sonuçlanmalıdır. Bu derinlikte, kalbi delmemek veya hücrelerin göğüs boşluğuna dökülmesini önlemek için, iğneyi önemli ölçüde hareket ettirmeden şırınganın pistonunu dikkatlice bastırın. Hücrelerin göğüs boşluğuna damlamasını azaltmak için, az miktarda negatif basınç oluşturmak amacıyla pistonu hafifçe yukarı çekin.

Ardından, iğneyi çıkarma sırasında eğilmediğinden emin olarak doğrudan göğüsten çekin; iğnenin eğilmesi kalp zarının yırtılmasına ve kanamaya neden olabilir. Kanamayı azaltmak için enjeksiyon bölgesine yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe basınç uygulayın. Burun konisini çıkarırken, fare tamamen kendine gelene kadar onu bir ısıtma pedine taşıyın.

İntratibial işlemden hemen önce, fareye bup printex enjekte edin. Fareyi anestezi altına alıp burun konisine yerleştirdikten sonra, her iki bacağı önce %10 povidon iyotla, ardından dört parmak ve başparmak hareketiyle etanolle temizleyin.

Lateral malleolü, medial malleolü ve tibia'nın alt yarısını nazikçe kavrayın. Ardından, diz görünür ve erişilebilir olacak şekilde bacağı bükün. Alttaki patella ligamanının görünürlüğünü artırmak için %70 ethanol kullanarak cildi ıslatın; ayak bileğini sıkıca kavrarken bu ligaman, belirgin kalın beyaz bir hat olarak görülmelidir.

28 gauge yarım inçlik bir iğneyi patella altına, patellar ligamentin ortasından geçirerek tibianın üst kısmındaki anterior interkondiler alana yerleştirin. İğneyi büyüme plağından dikkatlice geçirmek için hafif bir delme hareketiyle birlikte sabit ve güçlü bir basınç uygulayın. Tibial büyüme plağı geçildiğinde, iğne belirgin şekilde daha az dirençle karşılaşacaktır.

İğnenin tibia içerisinde ve büyüme plağının içinden geçtiğinden emin olmak için iğneyle hafif yan hareketler yapın. İğne tibia içinde doğru konumdaysa hareket kısıtlı olacaktır. 10 µL hücre solüsyonunu enjekte etmek için pistonu yavaşça bastırın.

Bu noktada çok az direnç hissedilmeli veya hiç hissedilmemelidir. Ardından iğneyi yavaşça çıkarın. Fareyi anesteziden çıkarın ve iyileşene kadar bir ısıtma pedinin üzerinde tutun.

Fareyi haftada iki ila üç kez izleyin. Anestezi altındaki fareler üzerinde lüsiferaz, GFP floresansı ve röntgen gibi çeşitli görüntüleme teknikleri uygulanır. Floresan, tümör bölgelerini belirtir.

Lezyonların konumunu belirlemek için estron taraması kullanılır. Lezyonlar, floresan görüntülerle korelasyon göstermektedir. Görüntüleme teknikleri hakkında daha fazla ayrıntı, bu protokolün yazılı kısmında bulunabilir.

Enjeksiyondan 21 ila 35 gün sonra. Fareleri IACUC onaylı bir yöntemle sakrifiye edin ve kemikleri %4 Formalin içinde saklayın; izole edilen kemikler üzerinde mikro CT ve hematoksilin ile DSN boyamalı histomorfometrik analizleri ex vivo olarak gerçekleştirin. Ayrıntılar, tümör hücrelerinin intrakardiyak veya intratibiyal inokulasyonunu takip eden yazılı protokolde bulunabilir.

Fareler haftalık olarak radyografi ve floresans veya lüminesans ile izlenir. Lezyonlar normalde iki ila üç hafta arasında röntgen ile belirginleşir. Burada gösterildiği gibi modele bağlı olarak, floresans ve lüminesans ile ikinci hafta kadar erken görülebilseler de, lezyonlar kemikte koyu delikler şeklinde görünür ve zamanla daha belirgin hale gelebilir; lezyonlar, radyografların ve floresansın metamorph analizi kullanılarak nicelendirilmiştir.

Maestro görüntüleme kazanım ve analiz yazılımı kullanılarak nicelleştirilmiştir. Bu şekilde, kemik kaybı mikro BT analizi ile nicelleştirilmiştir. Mikro BT ölçümlerinden elde edilen kemik yapısal ve mineral verileri; sağlıklı kemiğin ve kemik yıkım alanlarının boşluklar şeklinde gösterildiği tümör taşıyan bir kemiğin 3D görüntüleri olarak sunulmuştur.

Tümör yükü ile kemik hacminin doku hacmine oranını belirlemek amacıyla örnekler üzerinde histomorfometrik analiz yapılmıştır. Bu prosedürler uygulanırken sabırlı olmak, her bir fareyi dikkatlice yerleştirmek ve fareleri yakından izlemek önemlidir. Fareler ölmeye başlarsa, bu durum muhtemelen hücre kümelenmesinden kaynaklanmaktadır ve derhal yeni hücreler hazırlamanız gerekir.

Yapabileceğiniz en kötü şey, prosedürleri aceleye getirmek veya hayal kırıklığına uğramaktır. Unutmayın, daha fazla pratik ve zamanla, gelişimlerinin ardından daha iyi ve daha hızlı hale geleceksiniz. Bu teknikler, kanser araştırmacılarının kemik metastazını in vivo olarak incelemelerinin yolunu açmıştır.