Name: Kemik Metastaz Modelleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Keşfedin kemik metastaz modelleri için farelerde tümör hücresi enjeksiyonu yöntemlerini. Görüntüleme teknikleriyle tümör büyümesini izleyin ve kemik yıkımını değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P01CA040035 (FE / JAS) ve VA Kariyer Geliştirme Ödülü (JAS): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarından kabul.

1. Hücre Bakım <ol><li> MDA-MB-231 çoğu kemik metastazı yola çıkılarak alt klonlar kemik kolonizasyon ve büyüme için değişken eğilime sahip oldukları mevcut. Bizim deneyler için biz UTHSCA 2 geliştirilen GFP etiketli MDA-MB-231 türetilmiş bir klonu kullanın. Bu belirli bir alt-klon 4 hafta özveri ile, yaklaşık 3 hafta sonrası aşılama görülebilir osteolitik kemik lezyonları oluşturacaktır. </li><li> DMEM,% 5-8, 2 7 CO içinde 37 ° C &#39;de% 10 FBS, 0.1 mg / ml penisilin-streptomisin içeren hücreler koruyun. </li><li> 1:10 dilüsyon% 80-90 izdiham ve re-plaka Passage hücreler (bu hücre tipi ve boyut plaka bağlı olarak değişir. T-75 MDA-MB-231 hücre için bu yaklaşık 6x10 5&#39;tir), hangi Yaklaşık her 72 saat. </li><li> MDA-MB-231 hücrelerinde çok sayıda pseudopodia ile genel fibroblastik görünümünü korumak. Herhangi bir yuvarlama aşırı kalabalık veya diğer istenmeyen gerilme göstergesi olup, bu kaçınılmalıdırin vivo metastatik potansiyel etkileyebilir. </li><li> İdeal olarak, hücreler inokülasyon (biz az 1 wk tavsiye ya da deney için yeterli hücre elde edene kadar) daha önce sadece kısaca kültür tutulmalı ve yuvarlama veya hücre büyüme oranı değişikliği oluşursa, yeni bir flakon çözdürülmelidir. </li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> % 0.15 ile% 80-90 izdiham hücreleri Trypsinize tripsin / EDTA (PBS içinde% 0.5 Gibco Tripsin EDTA 01:02 sulandırmak). Bu konsantrasyon hızlı ayrılma (&lt;2 dakika) için olanak sağlar ve hücre kümelenmesi azaltır. </li><li> Hemen 10 ml buz-soğuk DMEM, 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de 15 ml konik santrifüj tüpü içine ve% 10 FBS, pipet ile levha içeren hücreleri çıkarmak. </li><li> 25 ml buz gibi soğuk PBS (Ca ve Mg olmadan) ve sayma içinde bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde süspanse pelet. </li><li> Yeniden pelet Santrifüj ve ml (intrakardiyak) başına 10 6 hücre ya da buz gibi soğuk PBS 250.000 cells/10 ul (intratibial) de tekrar süspansiyon haline getirin. TemperaPBS Ture hücreleri ve enjeksiyon sonrası sonraki emboli Topaklanmaması için önemlidir. Hücre süspansiyonu enjeksiyon yaparken buz üzerinde kalmalıdır ve yaşayabilir olması ve 30 dakika için un-clumped kalacaktır. Gerekli plaka sayısını tam araştırmacıdan araştırmacıya değişir iken, biz genellikle 8-10 fareler arasında 1 T-75 kullanın. </li></ol> 3. İntrakardiyak Aşılama <ol><li> 4-6 haftalık dişi (Foxn nu-/ -: Harlan) da olabilir diğer immün yetmezlikli farelerde (- -, RAG2-/, SCID, XID, vb RAG1-/) ama fareler, bu deneyler için kullanılır insan kanser hücre deneyleri ile birlikte kullanılabilir. </li><li> Enjeksiyon prosedürü gelen mortaliteyi azaltmak ve görüntüleme işlemleri arka plan floresan azaltmak için enjeksiyon öncesinde çıplak farelerin beslenen Teklad 2920x diyet 5-10 gün olmalıdır (gıda yonca ücretsiz olduğundan). </li><li> Nu / nu dışında fare kullanıyorsanız, ventral abdominal ar tıraş veya Nair (bizim deneyim Nair iyi çalışır olarak) kullanarak tüyleriyordamına başlamadan önce ea. </li><li> Veya diğer tercih edilen anestezi (bizim deneyim izofluran intrakardiyak aşılar için tolere iyi): Bir izofluran buharlaştırıcı (2-3 L / dk O 2% 2.5 Iso) kullanarak bir izolasyon odasında fare uyuştur. </li><li> Bir paslanmaz çelik havalandırılmış kaput içinde anestezi makinenin burun konisi bir defada bir fareyi hareket ettirin. </li><li> Göğüs yukarı bakacak sırtında her fare yerleştirin. </li><li> 2 kez yinelenen,% 70 etanol ardından% 10 povidon / iyot swab / çözeltisi ile göğüs yıkayın. </li><li> Enjeksiyon için Mark Farenin göğüs (steril bir kalem kullanarak veya enjeksiyon yerinde steril tutmak için biraz yana işaretleme). Biz sternumun bir işareti konumu sternal çentik ve xyphoid sürecinin üst arasında tam orta ve hafif sola (anatomik) kullanın. 300 ul 28 g ½ insülin şırınga pistonu ve menisküs arasındaki boşluk (kardiyak nabız görmek için önemli) oluşturmak için şırınga içine küçük bir hava kabarcığı çizin vehücrelerinin 100 ul hazırlar. </li><li> Dik iğne tutun. Diğer elinizle gergin fare deri tutarken, iğne takın. </li><li> Sol kalp ventrikül içine Başarılı ekleme şırınga kan farklı bir parlak kırmızı darbe ile sonuçlanmalıdır. Bu derinlikte, dikkatle göğüs boşluğuna kalp veya dökülmesini hücreleri delinmesiyle önlemek için iğne önemli hareketi olmadan, şırınganın pistonu (100 ul hacim) basın. </li><li> Hücreleri enjekte edildikten sonra, göğüs boşluğu içine hücre damlama azaltmak için negatif bir basınç yaratmak için az miktarda dalma pistonu üzerine hafifçe yukarı çekmek. </li><li> Kalp zarının yırtılmasına ve kanamaya neden olabilir kaldırma sırasında eğilme iğne önlemek için emin olurken doğrudan göğüs iğne çekin. </li><li> Kanamayı azaltmak için enjeksiyon sitesi üzerinden göğsüne hafif basınç uygulayın. </li><li> Burun konisi gelen fareyi çıkarın ve yaklaşık 1 dakika boyunca hafif bir baskı uygulamaya devam ediyoruz. </li><li> Tam con kadar ısıtma pedi için fareyi hareket ettirinscious. </li><li> Fare spin veya kurtarma sonra seğirme başlarsa, olası nedeni, bir emboli. Damar direnci azaltırken kan akımı ve kardiyak outputu artırır ketamin 80-120 mg / kg intraperitoneal yolla fare enjekte. Bu fare pıhtı geçmek yardımcı olmalıdır. Bu oluşur, sonra bu hücreler topaklanma olduğunu gösterir gibi, bu, hücre hazırlıkları değiştirmek en iyisidir. Biz yaklaşık 8 fareler sonrası hücre preparatları değiştirmek veya 30 dk. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Buprenex (0.1 mg / kg) ya da hemen işlem öncesinde benzer onaylanmış analjezik ile fare enjekte. </li><li> Izofluran kullanarak fare uyuştur, sonra burun konisi taşımak ve anesteziyi idame ettirmek. </li><li> % 10 povidon / iyot ile iki bacak temizleyin çubukla / çözüm, 2 kez tekrarlayarak, etanol izledi. Önce kürk varsa temizlik için tüylerini ayakları (Nair veya benzer ürün ile). </li><li> Yavaşça lateral malleol, medial malleol ve işaret parmağı ve inci ile tibia alt yarısında kavramakumb, sonra dirsek bacak (diz görünür ve erişilebilir şekilde fleksiyon ve lateral rotasyon kombinasyonu. </li><li> Ayrı, kalın, beyaz bir çizgi olarak görünür olmalıdır patellar ligaman, altta yatan görünürlüğünü artırmak için% 70 EtOH ile cildi ıslatın. Sıkıca 28g fare insert ½ iğne patellanın altında patellar bağ ortasından ayak bileği / bacak kavrama ve tibia üst anterior interkondiler alana da. </li><li> Tibia içine iğne takarken, hafif delme işlemi ile sürekli, sert basınç kullanarak büyüme plağı dikkatle rehberlik. </li><li> Tibial büyüme plağının penetrasyonu üzerine, iğne ile daha az direnç karşılaşacak. </li><li> Iğne tibia ve büyüme plağı geçer sağlamak için iğne yumuşak, yanal hareket kullanın. İğne tibia içinde uygun bir yer olup olmadığını Hareketi sınırlı olacaktır. </li><li> Yavaşça hücre çözümü 10 ul enjekte pistonu bastırın. Hiçbir direniş Little bu noktada hissettim olmalıdır. </li><li> SloWLY iğne ayıklayın. </li><li> Aynı prosedür izlenerek, PBS 10 ml enjekte yanındaki bacağa geçin. </li><li> Anesteziden fareyi çıkarın ve düzelene kadar ısıtma yastığı tutmak. </li><li> Sonraki 24 saat boyunca farelere Monitör ve hayvanların sıkıntı belirtileri göstermeye devam ederse ek buprenex ile her 12 saat enjekte. </li></ol> 5. Görüntüleme Zaman Kursu <ol><li> Lusiferaz Görüntüleme: Uygulanamaz, lusiferaz görüntüleme 7 gün sonrasında tümör hücre aşılama (çoğu kemik metastazı model olsa da, yakın günü 14 saptanabilir) başlayan kullanılmalıdır nerede. Fare 150 mg / kg luciferase, anestezi ile intraperitoneal ve IVIS ekipmanlar 8 kullanarak enjeksiyondan sonra 8 dakika olarak görüntülenir. </li><li> GFP görüntüleme: Genellikle GFP ifade tümörler Maestro görüntüleme ekipmanı (CRi) 9 kullanarak intrakardiyak deneyler için intratibial enjeksiyonları ve 16-21 için günde 10-14 etrafında algılanabilir olmaya başlar. Kısaca, fareler izofluran ile anestezi uygulanmıştır (% 3) Ve Maestro görüntüleme odasında bir burun konisi ile anestezi altında yapılmaktadır. Bizim eGFP salgılayan hücrelerin için biz 10 nm adımlarla 500 ms maruziyet de mavi filtre seti (eGFP için 498 excitation/515 emisyon) kullanın. </li><li> Faxitron (X-ray): X-ışınları haftalık 14 günlük 7 arasında başlayan alınır. Lezyonlar 21. günde intrakardiyak modelinde görünür ve bir hafta önce intratibial enjeksiyonları 3 olacaktır. Ex vivo ve in vivo Bizim radyografik veriler maruziyet 8 saniye için 35 kV bir Faxitron LX-60 ile elde edilmiştir. </li><li> Diğer Görüntüleme: Görüntüleme yöntemleri tamamen özel araştırma dayalı olacaktır. Yukarıdaki yöntemlere ek olarak, 3D mikro-bilgisayarlı tomografi (μCT), mikro-pozitron emisyon tomografisi (μPET), ve diğer modaliteler 10,11 dayalı canlı hayvan görüntüleme değerli bilgiler sağlayabilir. </li></ol> 6. Fare Kurban <ol><li> Her model biraz farklı bir zaman süreci vardır. MDA-MB-2 ile birlikte31 hücreleri fareler genellikle 21 ve 35 gün ve genellikle günde yaklaşık 28 (BT 21-28 gün arasında farelere enjekte) arasındaki kaşektik veya felçli hale gelir. </li><li> Bir kez birkaç fare kortikal kemik kırmaya felçli olmak, ya da vücut ağırlığının% 10-20 arasında, servikal dislokasyon (veya diğer IACUC onaylanmış yöntem) ile xylazine / ketamine doz kullanılarak çalışmadaki bütün fareler kurban kaybetmeye başlar lezyonlar gelişir. </li><li> Tamponlu% 4 formalin daha fazla çalışma ve mağaza için gerekli kemikleri çıkarın. </li><li> Göğüs tümörü olan Fare cevapsız enjeksiyon bir işareti ve çalışma dışında tutulmalıdır. </li></ol> 7. Ex Vivo Analizi <ol><li> μCT:% 70 EtOH içinde tarama kemik aynı numune üzerinde ölçülür için yapısal ve histolojik parametreler için olanak sağlar. </li><li> Kontur ve bireysel deney tasarımı ve ekipmanları mevcut 10&#39;a göre analiz. Bizim verilerimiz 12 mcM çözünürlük kullanarak Scanco μCT 40 ile elde edilmiştir. </li><li> Histomorphometry: Tercih histolojik yöntemler kullanılarak Süreç örnekleri ve Hematoksilen / Eosin 7 ile lekesi </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Tümör hücrelerinin intrakardiyak veya intratibial aşılama (Şekil 1) takiben fareler röntgen ve flöresanlı (ya da lüminesans) ile haftada bir izlenir. Onlar modeli (Şekil 2) bağlı olarak, haftada 2 gibi erken floresans ve lüminesans görülebilir iken Lezyonlar normalde haftada 2 ve 3 arasında x-ray tarafından anlaşılacaktır. Lezyonlar kemik karanlık delikler gibi görünür, ve zaman (Şekil 3) ile daha belirgin hale gelir. Lezyonlar radyografiler Metamorph analizi kullanılarak ölçüldü ve floresan Maestro (CRi) görüntüleme toplama ve analiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. Lezyonlar büyümeye başlaması, fareler sıkça kaşektik olur. Farelerin başlangıç ​​vücut ağırlığının% 10-20 arasında bir kayıp olduğunda Kurban gereklidir. Durumu<html> farelerin hızla değiştirebilir ve gün boyunca birden çok kez kontrol edilmelidir. 3-4 hafta arası farelerde bir veya arka bacaklarda hem sürüklemeye başladığını ve tüm çalışma kurban edildi. Görüntüleri feda öncesinde alınmıştır. Anestezi overdose sonra kan kemik döngüsü veya diğer faktörler belirteçleri ölçmek için toplandı. Servikal dislokasyon sonra, cilt eksize fare ve kemiklerinden sıyrılmış ve en az 7 gün önce in vivo görüntüleme teknikleri daha tümör odaklarının görüntülenmesine izin verecektir ex vivo görüntüleme (Şekil 3) için temizlenmiş. Bir kez görüntüleme tamamlanan kemiklerde etiketli kasetleri yerleştirilir ve fiksasyon ve ileri histolojik işleme veya μCT analizi için formalin bekletildi. ΜCT kemik bozulumu miktarı (Şekil 4) ölçmek için bir incik kemiği üzerinde yapıldı sonra histomorfometri tümör yükü ve BV / TV gösteren numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Enjeksiyon doğru yerleştirilmesi. Ventral radyografik görünümü (A) 4. interkostal ve intrakardiyak aşılama için sol ventrikül içine iğne doğru yerleştirilmesi gösteren erişkin fare toraks. Anatomik görülecek sternum (beyaz özetlenen) yatay kesikli çizgi ile gösterilmiştir. Fare derisi üzerinde sternal çentik ve xyphoid süreci simgesel olarak hizmet ve iğne sternum sol biraz eklenir. Ventral radyografik görünümü (B) kondiller arasındaki hizalanır, proksimal tibia iğnenin doğru yerleştirilmesi gösteren erişkin fareden bacak. Yanal bir perspektiften bakıldığında iğne ucu tibia tuberositas ve epifiz plaka derin arkasına yerleştirilir. Enjeksiyon için ideal bir konuma beyaz bir daire ile gösterilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Şekil 2. Kemik metastazı modellerin Zaman elbette. Ca ilerlemesincer indüklediği kemik hastalığı x-ışınları ve GFP ile gösterilen + tümörlerin floresan görüntüleri intratibial enjeksiyonları (A) ve intrakardiyak enjeksiyon (B) in vivo. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Şekil 3,. . MDA-MB-231 intrakardiak gün sonra 0, 14, 21, ve 28 de GFP floresan gösteren ex vivo İmaj: intrakardiyak MDA-MB-231 modelinin Top Row Zaman elbette. Günde 14 tümör odakları yumuşak doku çıkarıldıktan sonra ex vivo sadece görünür olduğunu unutmayın. Alt satır: osteolitik kemik lezyonlar gösteren aynı femurların ex vivo radyografik görüntüler. Kemik yıkımı 3 hafta kardiyak enjeksiyonu kadar sonra genellikle görünür değildir unutmayın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Şekil 4. Tibi ve Maestro görüntüleme ex vivo tarafından görüntülenmiştir gibi kemik metastatik hastalık. GFP Niceleme + tümörolmayan bir tümörlü fare (A) ve 4 hafta MDA-MB-231 subclone (B) GFP ifade eden bir intrakardiak sonra, bir fare ae. Tümör odakları Faxitron (D) tarafından gösterildiği gibi kemik yıkım alanları ile ilişkili tümör (C) olmadan bir kemik karşılaştırıldı. MikroBT ölçümlerden Kemik yapısal ve mineral verilerin sağlıklı bir kemik (E) ve tümörlü kemik (F) kemik yıkım alanları void alanı olarak gösterilmiştir 3d görüntü olarak işlenir. Daha sonra kemik ve tümör ayrıntılı karşılık H &amp; E ile boyanmış histolojik kesitler (G &amp; H) görülür.

<ol><li>Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+biology+of+bone+metastasis%3A+how+the+skeleton+affects+tumor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior.</a> Bone. 48, 6-15 (2011).</li>
<li>Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteolytic+bone+metastasis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Osteolytic bone metastasis in breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).</li>
<li>Johnson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+promotion+of+Gli2-induced+expression+of+parathyroid+hormone-related+protein%2C+an+important+osteolytic+factor+in+bone+metastasis%2C+is+independent+of+canonical+Hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta promotion of Gli2-induced expression of parathyroid hormone-related protein, an important osteolytic factor in bone metastasis, is independent of canonical Hedgehog signaling.</a> Cancer Res. 71, 822-831 (2011).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic%2FOsteolytic+Bone+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lesions.</a> Mol. Cancer Res. , (2012).</li>
<li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li>
<li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hedgehog+signaling+molecule+Gli2+induces+parathyroid+hormone-related+peptide+expression+and+osteolysis+in+metastatic+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The hedgehog signaling molecule Gli2 induces parathyroid hormone-related peptide expression and osteolysis in metastatic human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 66, 7548-7553 (2006).</li>
<li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20, 701-714 (2011).</li>
<li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+myeloma+in+skeleton+of+mice+by+whole-body+optical+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection of myeloma in skeleton of mice by whole-body optical fluorescence imaging.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1701-1708 (2007).</li>
<li>Johnson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+live+animal+micro-CT+allows+for+quantitative+analysis+of+tumor-induced+bone+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction.</a> Bone. 48, 141-151 (2011).</li>
<li>Sterling, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSterling%2C+J+%22Imaging+Techniques+for+the+Detection+and+Examination+of+Breast+Cancer+Metastasis+to+Bone%22">Imaging Techniques for the Detection and Examination of Breast Cancer Metastasis to Bone</a>. 46, Nova Science Publishers. (2011).</li>
<li>Steinbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo%2C+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li>
<li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tümör kaynaklı kemik hastalığı Çalışmaları en sık kullanılan iki intrakardiyak ve intratibial aşıları olmak üzere çeşitli hayvan modelleri üzerinde güveniyor. Birçok durumda, intrakardiyak kemik metastazı incelemek için en iyi seçenek olmakla birlikte, bu tam metastaz temsil etmez ve bu nedenle, memenin yağlı pedine ya da diğer enjeksiyon ortotopik ideal olarak, bu amaca yönelik kullanılmalıdır. Tümör hücreleri insan hücreleri kullanarak birçok çalışmada birincil sitesinden kolayca metastaz yapmazlar, ve eğer öyleyse, b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinin </td><td> Başlangıçta ATCC-Yerinden klonlanmış ve seçilmiş </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech A.Ş. </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas Biyolojik </td><td> F-0050a </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Orkestra şefi </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT tarayıcı </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Atimik çıplak farelerde </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> İnsülin Şırınga (300 ul, 28.5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Kaliper </td><td></td></tr><tr><td> Işınlanmış Kemirgen Diyet </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

kemik metastaz modelleri

Models of Bone Metastasis

Kemik metastazları, meme, prostat ve akciğer gibi çeşitli maligniteler, ortak bir olay vardır. Bir kez kemik yılında kurulan, tümörler önemli morbidite ve mortalite 1 sorumludur. Bu nedenle, kemik tümörlerinin oluşturulması, büyüme ve aktivitesini kontrol eden moleküler mekanizmalarının anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Vivo modellerde birçok bu olayları incelemek üzere kurulan ve her özel yararları ve sınırlamaları vardır edilmiştir. En sık kullanılan modeli doğrudan atimik (çıplak) BalbC farelerin arteriyel kan akımı içine tümör hücrelerinin intrakardiyak inokülasyon kullanır. Bu işlem birçok farklı tümör tipleri (PC-3 prostat kanseri, akciğer kanseri ve fare meme yağ yastığı tümörleri dahil) uygulanabilir, ancak bu makalede biz, MDA-MB-231 meme kanseri modeli üzerinde durulacak. Bu modelde biz başlangıçta San Antonio 2 Dr Mundy grubu olarak elde edilen bir çok kemik seçici klon, kullanmak, hberi GFP ifade için transfekte ve bizim grup 3 ile yeniden klonlanmış gibi. Bu klon bir osteotropism oranı yüksek ve akciğer, karaciğer ya da böbrek üstü bezlerinin çok az metastazı olan bir kemik metastatik çeşididir. Intrakardiyak enjeksiyonlar en yaygın olarak, belli durumlarda kemik metastazı 2 çalışmaları için kullanılsa da 4 intratibial ya da memenin yağlı pedine enjeksiyon daha uygundur. , Kemik tutuklamak hayatta kalmak, çoğalırlar ve kanser-kaynaklı kemik hastalığı haline tümörler kurmak için, özellikle kanser hücrelerinin metastaz yeteneği daha sonraki aşamalarında izleme amacı ile, insan tümör hücrelerinde kullanıldığında kalp içi enjeksiyon tipik olarak gerçekleştirilir. Bir tümör saptandığında metastatik kemik hastalığını kabaca ilişkilidir kemik, metastas sonra kanser hücreleri ve kemik ilişkisi üzerinde duruluyor varsa Intratibial enjeksiyonlar yapılır. Emboli ve giriş için ne bu modellerin recapitulates metastatik süreci erken adım öncekidolaşıma tümör hücrelerini yok etmektedir. Kemik birincil sitesinden primer tümörün büyümesi veya metastaz izlenmesi, sonra memenin yağlı pedine aşılar genellikle tercih olmakla birlikte, çok az sayıda tümör hücre hatları sürekli, 4T1 kemik tercihli klonları ile, birincil sitesinden kemik, meme fare metastaz olur karsinom, istisna 5,6 olmak. Bu yazının ayrıntıları aşılama işlemleri ve sonrası aşılama analizlerde golleri önemli adımlar. Özellikle, hücre kültürü, intrakardiyak ve intratibial aşılar için tümör hücre aşılama işlemleri yanı sıra, röntgen, floresans ve histomorfometrik analizleri ile haftalık izleme ile ilgili özet bilgiler içerir.

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik Metastaz Modelleri

Kemik metastazları; meme, prostat ve akciğer dahil olmak üzere birçok malignitede sıkça görülür. Kemiğe yerleşen tümörler, ...

Bu prosedürün genel amacı, kemikte tümör hücresi büyümesini ve ardından kemik yıkımını tetikleyecek şekilde tümör hücreleri enjekte etmektir. Bu işlem, öncelikle tümör hücrelerinin soğuk PBS içinde resüspanse edilmesi ve buz üzerine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, uygun sayıda hücre, anestezi altındaki bir farenin sol kardiyak ventrikülüne veya tibiasına enjekte edilir.Ardından kemik tümör büyümesi ve kemik parametreleri, çoklu görüntüleme teknikleri aracılığıyla boylamsal olarak izlenir. Son olarak, tümör ve kemik parametrelerinin uç nokta kantifikasyonu gerçekleştirilir. Nihayetinde, in vivo ve ex vivo floresan veya lüminesans 2D radyografi 3D'nin bir kombinasyonu kullanılır.Tümör büyümesini ve kemik mikroçevresindeki değişiklikleri hücresel ve büyüme yapısal düzeylerinde göstermek için mikro CT ve histoloji kullanılır. Bu yöntemler, meme ve prostat kanserinin metastatik kolonizasyonuna kemikte hangi faktörlerin izin verdiği gibi, kanser metastazı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre hazırlığını, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Alisa Merkel gösterecektir, hücreleri bir haftadan daha kısa süreyle muhafaza edin.GFP etiketli M-D-A-M-B 2 3 1 klonunu içeren hücreleri, %10 FBS ve 0,1 mg/mL penisilinle streptomisin içeren DMEM içerisinde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 ila %8 CO₂ ortamında kültüre edin. Hücreler %80 ila %90 konfluense ulaştığında pasajlayın ve 1:10 dilüsyonla yeniden ekim yapın. Hücreleri inokülasyona hazırlamak için, %80 ila %90 konfluense ulaştıklarında 10 mL 0,15% tripsin EDTA kullanarak tripsinizasyon yapın.%10 FBS içeren buz gibi soğuk DMEM ile hücreleri derhal 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti 50 mililitrelik konik bir tüp içerisinde 25 mililitre buz gibi soğuk, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yeniden süspande edin ve hücreleri sayın; hücreleri tekrar peletleyin ve intramiyokardiyal inokülasyon için mililitre başına 10⁶ hücre, intratibiyal enjeksiyon için ise mililitre başına 250.000 hücre konsantrasyonunda buz gibi soğuk PBS içerisinde yeniden süspande edin.Bu deneyler için, enjeksiyondan beş ila 10 gün önce Tela 29 20 x diyetiyle beslenmiş, dört ila altı haftalık dişi immün yetmezliği olan fareler kullanılır. Fareyi %2,5 isof fluorine içeren bir hazne içerisinde anesteziye aldıktan sonra, fareyi havalandırmalı bir davlumbaz altında burun konisine taşıyın ve sırtüstü konumlandırın. Göğüs bölgesini temizlemek için önce %10 povidon iyot çözeltisi, ardından %70 Ethanol kullanın.Enjeksiyon için farenin göğüs bölgesini, sternal çentik ile ksifoid çıkıntının üst kısmı arasındaki orta noktaya ve sternumun hafifçe soluna işaretleyin. Ardından, 300 mikrolitrelik 28 gauge yarım inçlik bir insülin şırıngası kullanın. Piston ile menisküs arasında boşluk oluşturmak için küçük bir hava kabarcığı çekin ve bir elinizle farenin derisini gergin tutarken 100 mikrolitre hücre çekin.İğneyi dik tutun ve yerleştirin; sol kalp ventrikülüne başarılı bir giriş, şırıngada belirgin, parlak kırmızı bir kan nabzı ile sonuçlanmalıdır. Bu derinlikte, kalbi delmemek veya göğüs boşluğuna hücre sızdırmamak için iğneyi önemli ölçüde hareket ettirmeden şırınga pistonunu dikkatlice bastırın. Hücrelerin göğüs boşluğuna damlamasını azaltmak için, az miktarda negatif basınç oluşturmak amacıyla pistonu hafifçe yukarı çekin.Ardından, iğneyi çıkarırken eğilmediğinden emin olarak doğrudan göğüsten çekin; iğnenin eğilmesi kalp zarının yırtılmasına ve kanamaya neden olabilir. Kanamayı azaltmak için enjeksiyon bölgesine yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe basınç uygulayın. Burun konisini çıkarırken, fare tamamen bilinci yerine gelene kadar onu bir ısıtma pedine taşıyın.İntratibial prosedürden hemen önce, fareye bup printex enjekte edin. Fareyi anestezi altına alıp burun konisine yerleştirdikten sonra, her iki bacağı önce %10'luk povidon iyot ile, ardından dört parmak ve başparmak şeklinde ethanol ile temizleyin.Lateral malleolü, medial malleolü ve tibianın alt yarısını nazikçe kavrayın. Ardından, diz görünür ve erişilebilir olacak şekilde bacağı bükün. Altında bulunan patella ligamanının görünürlüğünü artırmak için %70 ethanol ile cildi ıslatın; ayak bileği sıkıca tutulurken bu ligaman belirgin, kalın beyaz bir çizgi olarak görünmelidir.28 gauge yarım inçlik bir iğneyi, patella ligamentinin ortasından geçerek patellanın altına ve tibianın üst kısmındaki anterior interkondiler alana yerleştirin. İğneyi büyüme plağından dikkatlice geçirmek için hafif bir delme hareketiyle birlikte sabit ve güçlü bir basınç uygulayın. Tibial büyüme plağına girildiğinde, iğne belirgin şekilde daha az dirençle karşılaşacaktır.İğnenin tibia içerisinde ve büyüme plağının ötesinde olduğundan emin olmak için iğneyi nazikçe yanlara doğru hareket ettirin. İğne, tibianın içerisinde doğru konumdaysa hareket alanı sınırlı olacaktır. 10 µL hücre solüsyonu enjekte etmek için pistonu yavaşça aşağı bastırın.Bu noktada çok az direnç hissedilmeli veya hiç hissedilmemelidir. Ardından iğneyi yavaşça geri çekin. Fareyi anesteziden çıkarın ve iyileşene kadar bir ısıtma pedinin üzerinde tutun.Fareleri haftada iki ila üç kez gözlemleyin. Anestezize edilmiş fareler üzerinde lusiferaz, GFP floresansı ve röntgen gibi çeşitli görüntüleme teknikleri uygulanır. Floresans, tümör bölgelerini belirtir.Lezyonların yerini belirlemek için estron taraması kullanılır. Lezyonlar, floresan görüntülerle korelasyon gösterir. Görüntüleme teknikleri hakkında daha fazla ayrıntı, bu protokolün yazılı bölümünde bulunabilir.Enjeksiyondan 21 ila 35 gün sonra. Fareleri IACUC onaylı bir yöntemle sakrifiye edin ve kemikleri %4'lük Formalin içinde saklayın; izole edilen kemikler üzerinde mikro CT ve hematoksilin ile DSN boyamasıyla histo-morfolojik ex vivo analizler gerçekleştirin. Detaylar, tümör hücrelerinin intrakardiyak veya intratibiyal inokülasyonunu takip eden yazılı protokolde bulunabilir.Fareler, radyografi ve floresans veya lüminesans ile haftalık olarak izlenir. Lezyonlar normalde ikinci ve üçüncü haftalar arasında röntgen ile belirgin hale gelir. Burada gösterildiği gibi modele bağlı olarak, floresans ve lüminesans ile ikinci hafta kadar erken görünseler de, lezyonlar kemikte koyu delikler şeklinde görünür ve zamanla daha belirgin hale gelebilirler. Lezyonlar, radyografların ve floresansın metamorph analizi kullanılarak nicelleştirilmiştir.Maestro görüntüleme kazanım ve analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi. Bu şekilde, kemik kaybı mikro CT analizi ile nicelendirilmiştir. Mikro CT ölçümlerinden elde edilen kemik yapısal ve mineral verileri; sağlıklı kemiğin ve kemik yıkım bölgelerinin boş alanlar olarak gösterildiği tümör taşıyan kemiğin 3B görüntüleri olarak sunulmuştur.Ardından, tümör yükünü ve kemik hacminin doku hacmine oranını belirlemek için örnekler üzerinde histo morfoloji geometrisi uygulandı. Bu prosedürleri gerçekleştirirken sabırlı olmak, her bir fareyi dikkatle yerleştirmek ve fareleri yakından izlemek önemlidir. Eğer ölmeye başlarlarsa, bunun muhtemelen hücre kümelenmesinden kaynaklandığını varsaymalı ve derhal yeni hücreler hazırlamalısınız.Yapabileceğiniz en kötü şey, prosedürleri aceleye getirmek veya hüsrana uğramaktır. Unutmayın, daha fazla pratik ve zamanla, gelişimden sonra daha iyi ve daha hızlı hale geleceksiniz. Bu teknikler, kanser araştırmacılarının kemik metastazını in vivo olarak incelemelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kemik metastazının patogenezine, anjiyojenez önemli bir proses ve bu nedenle görüntüleme ve tedavi için bir hedef temsil eder. Burada siteye özel meme kanseri kemik metastazı bir sıçan modeli sunmak ve non-invaziv görüntü anjiyogenez için stratejiler...

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Insan prostat kanser ortotopik bir model akciğer tümör hücreleri ve farklı metastaz oluşumu dolaşan tümör boyutu ölçümü sağlar. Hücreler birincil organı kaçmak gerekir gibi, kan dolaşımına girerek, ve bir ikincil site içine implant, bu modeli etkin insanlarda senaryo tartışıldı.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bu el yazması, deneysel kemik metastazları oluşturmak için kanser hücrelerini özellikle kemikler de dahil olmak üzere arka bacak dokularına iletmek için bir teknik olan intra-iliak arter (IIA) enjeksiyonunun ayrıntılı prosedürünü sağlar. Başlangıçta meme tümörü modelleri ile oluşturulmuş olsa da, bu protokol diğer kanser türlerine de kolayca genişletilebilir.

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Kemik hücre dışı Matriks (BEM) modeli osteosarkom (OS) için de kurulan ve gösterilen işte. Bu uygun bir iskele birincil tümör büyüme vitro taklit ve OS histolojik ve cytogenic heterojenlik eğitim için ideal bir model sağlamak için kullanılabilir.

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Burada, kemik metastazı lezyonları olan bir fare modeli oluşturmak için insan prostat kanseri hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Kemik Metastazı Ksenograft Fare Modeli Oluşturmak için İnsan Prostat Kanseri Hücrelerinin İntrakardiyak Enjeksiyonu

Keşfedin kemik metastaz modelleri için farelerde tümör hücresi enjeksiyonu yöntemlerini. Görüntüleme teknikleriyle tümör büyümesini izleyin ve kemik yıkımını değerlendirin.

Kemik Metastaz Modelleri

Daha fazla video keşfet