Name: İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Öğrenin, insan fetal nöral progenitör hücrelerini oligodendrositlere farklılaştırma yöntemini. Bu protokol, destek hücreleri olmadan saf oligodendrosit popülasyonları üretir ve beyin hastalıklarını incelemek için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NINDS de İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar düzenleme ile yardım için mikroskop ve Pamela C. Eleme ile yardım için Moleküler Tıp ve Nörobilim, Rick Dreyfuss ve Laboratuvar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Not: öncül ve nöral oligodendrocytic soy hücreleri rutin kültürü için inkübasyon 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosfer içinde gerçekleştirilir. Her 2 gün, kültür ortamı% 40-70 oranında konfluent ise taze aracı madde içinde 50 ila% 100 kullanılarak değiştirilir. Yakınlarındaki confluency sırasında, kültürler genellikle bir haftalık çalışma programı üzerinde 2-2.5e6/T75 şişeyi de geçişli edilmektedir. 1. Kaplı Flask hazırlanması <ol><li> Kaplanmış şişeler daha sonra deiyonize su (DI-su) ile ceket T75 şişeleri, 100 ml poli-D-lizin (PDL) ve 5 mg seyreltik hazırlamak için, 50 mg / karanlık içinde oda sıcaklığında (RT) PDL ml. 1 ½ saat sonra, PDL aspire ve DI-su ile bir kez durulama şişeler. Hücrelerine bağlanır (Tablo 1) tohumlu önce kuru şişeler izin verin. </li></ol> 2. Progenitör türetilmiş Oligodentrositler (PDO) içine Sinir progenitör hücreleri farklanma Başlangıç Için protokolİnsan MSS progenitör hücrelerin Olate önceki bir yayında açıklanan ve bu protokolün 1 parçası değildir. İnsan MSS progenitör hücrelerin NIH kurallara uygun olarak elde edilen bir 8 haftalık gebe fetal beynin telencephalon izole edilmiştir. <ol><li> 25 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) (Şekil 1A) ile takviye neurobasal ortamda PDL kaplanmış şişeler üzerinde sinir projenitör hücrelerin multipotential nüfus büyütün. Geçişi 11 (p11) daha yüksek ise bunları kullanmayın. </li><li> Kültür yaklaşık% 70 birleşik olduğunda nöral progenitör hücrelerin ayırt başlayın. </li><li> Sığır serum albumin, L-glutamin, gentamisin, N2 bileşenleri, T3, Şşş, NT-3, bFGF ve PDGF-AA (Tablo 1) ile desteklenmiş serumsuz DMEM / HAMS F12 01:01 orta kullanarak tam farklılaşma oligodendrosit orta Yap . Bu ortam, büyüme faktörleri (oligo orta + GF) ile oligo ortamı olarak tanımlanır. </li><li> Progen kaldırşişelerinden alınmış itor ortamı ile bir kez durulama hücreler fosfat-tamponlu salin (PBS) ile, daha sonra oligo orta eklemek + GF oligodendrosit farklılaşma başlatmak için (2.3 anlatılan ayrıntılar). Oligodendrocytic soy taahhüt Sadece hücrelerinin (Şekil 1B) artacak. 3 hafta için bu ortam içinde kültür hücreleri. </li><li> Her hafta, hücreler% 90-95 izdiham, geçit onları tripsin (% 0.05)-EDTA (% 0.1) (a T75 şişesi için 4 ml) kullanarak olduğunda. 50 ml&#39;lik bir konik tüpe pasajlanmağa devam edilmesi için hücrelerin tüm orta aktarma; bu şartlı ortam tripsin gidermek için kullanılır. Hücrelerin kurumasına değil emin olun. Sonra tripsin ekleyin. </li><li> Nazikçe hücre ayırma yardımcı olmak için şişeye birkaç kez dokunarak, oda sıcaklığında 5 dakika için hücreler tripsin ile inkübe edin. </li><li> Müstakil hücreleri ile şişeye şartlı ortam 4-5 ml ilave edilerek tripsin dindir. </li><li> Aynı 50 ml konik bir tüp için orta ve hücre transfer edin. 1.200 rpm (~ azından orta ve hücreler santrifüje300 xg) RT az 5 dakika. </li><li> Süpernatan aspire tüpü yavaşça devrilmesi, hücre pelet tekrar süspansiyon ve daha sonra taze ortam oligo + GF ekleyin. Yavaşça pipet orta ve hücreler yukarı ve aşağı bir üniforma hücre süspansiyonu yapmak. </li><li> Her bir yeni PDL-kaplı T75 şişeye hücreleri, ve transfer 2.5e6 sayın. </li></ol> 3. Oligodentrositler Arasındaki Farklılığın Nihai Adım <ol><li> Oligo orta + GF, hücrelerin% 70-80 izdiham olan kültür 3 hafta sonra, farklılaşma son işlem (Şekil 1C) başlatın. </li><li> Oligo orta + GF olduğu gibi aynı şekilde, ama dört GF ilave edilmeden orta hazırlayın: Shh, NT-3, bFGF ve PDGF-AA. GF - dört GF olmadan Bu orta oligo ortamı olarak tanımlanır. </li><li> Şişesi oligo orta + GF aspire, bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra ortam 16 ml toplam hacim eklemek, oligo aracı olan ¾ (12 ml) - GF ve ¼ (4 ml) bir PDN şartlı ortam olduğu için, 6-10 Gün). PDN şartlandırılmış ortam kullanılması da farklılaşma için ya da hücrelerin hayatta kalması için kritik değildir. Biz aslında ko-kültür deneyleri PDN hücreleri ile PDO yalnızca doğrudan temas PDO hayatta kalma süresine bir etkisinin olmadığı görülmüştür. Oligo orta sağkalım süresi - PDO hücreleri PDN hücreleri ile birlikte kültüre eğer GF iki veya üç hafta uzatılabilir olabilir. PDN içine insan nöral progenitör hücrelerin ayırt etmek için protokolü önceki bir yayında açıklanan ve bu protokolün 1 parçası değildir. Çoklu süreçleri (Şekil 1D) ile hücrelerin giderek farklılaşmış kültür kültür ortamı sonuçları Büyüme faktörü çekilmesi. </li></ol> 4. Akış Sitometri Assay Flow sitometri testi kendi ebeveyn nüfusun olanlarla ilişki içinde farklılaşma sürecinde oligodendrosit belirteçlerin edinimi karşılaştırır. <ol><li> Nöral pro kullanınkontrol olarak genitörleridir. Oligo orta + GF poli-D-lizin ile kaplı iki T75 şişeler 2.5x10 6 hücrelerini Tohum PDO hücreleri. </li><li> GF - Diğer matara oligo orta varken Bir hafta sonra, hücre canlılığı için bir kontrol kültürü olarak matara taze oligo orta + GF ile orta değiştirin. </li><li> Hem medya PDO hücreleri ayırmak için 20 U / papain ml tripsin kullanılması uygun değildir. Papain hücre morfolojisini koruyan ayrışma sırasında hücreler üzerinde yumuşak bir etkiye sahip olmasıdır. </li><li> Papain bir şişeye Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) 5 ml ilave edilir. 10 dakika için ya da papain tamamen çözündürüldü ve çözelti berrak görünene kadar, 37 ° C &#39;de şişe yerleştirin. Bu hücreler ayrıştırmak için kullanılan papain çözümdür. </li><li> Bir deoksiribonükleaz I (Dnase) şişenin (Tablo 1) ile EBSS 0.5 ml ilave edilir. Yavaşça karıştırın. Çözünmüş papain şişeye bu çözeltinin 0.25 ml ilave edilir. Bu karışım yaklaşık olarak 20 U / ml, papain ve 0 olan bir nihai konsantrasyonda içerir.005% DNaz. </li><li> 15-30 dakika için 37 ° C sıcaklıkta inkübe hücreleri ve üzerinde yer papain çözelti (yukarıda açıklandığı gibi), bir mikroskop kullanılarak hücrelerin ayrılması izler. Ile ya da 7 dakika boyunca 1,200 rpm&#39;de santrifüj ile GF olmadan ortam 5 ml reaksiyon durdurun. </li><li> İki farklı 5 ml polipropilen tüplere içine de şişelerinden alınmış hücre peletleri aktarın ve normal fizyolojik ortam (UÖM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glukoz) ile yıkayınız 1 mg / ml ile takviye sığır serum albümin (YKY + BSA). </li><li> Yüzey 4&#39;te immün gerçekleştirme ° GalC (Tablo 2), A2B5, O4 için spesifik ve uygun bir şekilde titre birincil antikor kullanılarak 20 dakika için C&#39;dir. </li><li> 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta NPM + BSA ile yıkayın hücrelerini ve 20 dakika (tablo 2) için 4 ° C sıcaklıkta belirli sekonder antikor ile inkübe edilir. </li><li> Nestin, glial fibriler asidik protein (GFAP), sınıf III ve olmaya da dahil intraselüler antijenlere leke içinta,-tubulin, ve miyelin bazik protein (MBP) (Tablo 2), oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehid (PFA) hücreleri düzeltmek ve -20 ° C &#39;de 15 dakika süreyle soğuk% 70 etanol ile geçirgen </li><li> 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve spesifik sekonder antikor (Tablo 2) ile inkübe edin. </li><li> Flow sitometri analizi sırasında sağlam hücre ve hücre içi moloz arasında ayrımcılık için, 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihidroklorür (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY) ile hücreler leke. </li><li> Yukarıdaki protokol optimize, biz her immunoreagent özgünlüğünü doğrulamak için tüm uygun kontrol deneyleri yapılmaktadır. Kısaca, direkt olarak etiketlenen antikorlar için, uygun negatif kontrol birincil antikor (örneğin, izotip kontrol) ile aynı izotip immünoglobulin sınıfı (ya da alt sınıfı) ile florokrom konjugat bir direkt olarak konjuge antikor idi. Primer antikor indirekt immün, uygun negatif kontrol w içinözellikle birincil antikor oluşturulduğu ana immünoglobulin sınıfı (ya da alt sınıfı) hedeflenen ki ilgi florokrom ile konjuge sekonder antikor olarak. Birden çok konaklardan (fare, tavşan, tavuk) primer antikorları birlikte kullanıldığı zaman, genellikle en aza indirmek için çapraz diğer bilgisayarlardan gelen immünoglobulinler karşı çapraz adsorblanmıştır kullanılan her ana ve her sekonder antikor primer antikor hedefleyen ikincil antikor kullanılır immunreaktivitesi barındırabilir. Pozitif kontroller bu antijenlere spesifik primer antikorlar ile doğrudan veya dolaylı immunoreactions kullanarak ilgi antijenleri ifade bilinen hücre hazırlıkları doğrudan veya dolaylı immün dahildir. Yukarıdaki optimizasyon yöntemleri immüno-deney her türü için bir kez yapılmıştır. Kontrol immunoreactions birincil ve ikincil antikorlar arasında anlamlı çapraz epitopu immünreaktivitesi saptandı. Flow sitometri düzgün yapıldı488 nm, 647 nm ayarlı uyarma dalgaboyu sağlayan üç lazer ile donatılmış bir FACVantage SE hücre sıralayıcı (BD Biosciences, San Jose, CA), ve geniş bir UV (351-364 nm) (Şekil 2) kullanılarak askıya floresan etiketli hücreleri . </li></ol> 5. İmmünofloresan Assay Not: immünofloresan denemeleri için PDO oligo orta + GF veya oligo orta kaplanıyor - PDL ile kaplı 6 kuyucuğu içinde 2.5e5 de GF. Hücre büyüme faktörlerinin çekilmesinden sonra çeşitli zaman noktalarında% 2 PFA ile tespit edilir. Leke antikor Plastik 6 kuyucuğu yerine cam lameller üzerine yapılır. <ol><li> Ortamı çıkarın ve% 2 PFA ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. PFA atın. PBS, 5 dakika süre ile her hücreler 3 kez yıka. Hücrelerin kurumasına için dikkatli olun. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.25 triton çözeltisi kullanılarak hücre içi belirteçler için hücreler geçirgenliği. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma, blok hücreleri önlemek için, fya da HHG (1 mM, HEPES tamponu,% 2 at serumu, ve Hanks &#39;dengelenmiş tuz çözeltisi içinde% 10 keçi serumu) ile 10 dak. HHG içinde önceden belirlenmiş bir yoğunlaşma ile spesifik primer antikorlar (Tablo 2) seyreltilir. Hücreleri üzerine sulandırılmış antikor yerleştirin. Karıştırma cihazı üzerinde, ya da 4 ° C&#39;da gece boyunca oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 5 dk her zaman için, hücreler PBS ile 3 kez yıka. HHG içinde önceden belirlenmiş bir konsantrasyon ile bir florokrom ile birlikte uygun bir ikincil antikor (Tablo 2) seyreltilir. Hücreler üzerine seyreltilmiş sekonder antikor karışımı yerleştirin. Karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde RT inkübe 1 saat. </li><li> 5 dk her zaman için, hücreler PBS ile 3 kez yıka. </li><li> Photobleaching önlemek için hücrelere DAPI ile Altın Prolong ve bunların üstüne bir cam lamel yerleştirin 10 ul ekleyin. Bir Axiovert 200M floresans mikroskobu (Zeiss, Thornwood, NY) (Şekil 3) kullanılarak etiketli hücreler gözünüzde canlandırın. </li></ol>

<ol><li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li>
<li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li>
<li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li>
<li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+niche-defying+feat%3A+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li>
<li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Res.+Found+Workshop%22%5BJournal%5D)">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li>
<li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells%3A+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li>
<li>Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+%28O4%2BGalC-%29+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li>
<li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li>
<li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li>
<li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li>
<li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapping+into+the+glial+reservoir%3A+cells+committed+to+remaining+uncommitted%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li>
<li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5(2009).</li>
<li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li>
<li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination%2Fremyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li>
<li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li>
<li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, birincil insan nöral progenitör hücrelerin fetal oligodendrosit türetmek ve flow sitometri ve immünfloresan boyama kullanarak hem kendi fenotip karakterize açıklamaktadır. Fetal CNS sinir progenitörlerinin genişleme ve büyüme çok iyi 1-4 tarif edilmiştir. Erişkin insan beyaz madde 5-13 glial öncüleri tanımlamak ve ayırmak mümkün olsa bile Ancak, in vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit elde, zor kalır. Oligodendrosit 14-21 üreten miyelin içine fetal nöral...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12 01:01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Albumin Sığır </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2 Bileşenleri </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3, </td><td> PeproTech A.Ş. </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Şşş </td><td> Ar-Ge Sistemi </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech A.Ş. </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech A.Ş. </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml &#39; </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 mg / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15712 </td><td> % 2 </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNaz şişeleri </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0.005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Altın uzatmak ileDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Reaktifler. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Birincil Abs (tüm 1 mg / ml) </td><td></td><td> Türler İzotip </td><td> Kaynak </td><td> İkincil Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Akış Sitometri </td></tr><tr><td> A2B5-Biotin </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Hediye J. Nielson </td><td> Streptavidin PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> J. Nielson dan Hediye </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Fare </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Güney Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Tavuk </td><td> IGY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IGY-AMCA, Jackson İmmünoreaktif., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Fare </td><td> IgG 1 </td><td> Messam ve ark. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Tavşan </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson İmmünoreaktif, PA </td></tr><tr><td> βIII tubulin </td><td> Fare </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> İmmünositokimya </td></tr><tr><td> βIII tubulin (1:1,500) </td><td> Fare </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Tavşan </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson İmmünoreaktif, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Tavuk </td><td> IGY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IGY-FITC, Jackson İmmünoreaktif, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Tavşan </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Flow sitometri ve immünsitokimya deneyleri için kullanılan Tablo 2 Antikorlar (Abs) Antikor konjugatları: PE, fikoeritrin; PETR, fikoeritrin Texas Red, AMCA, amino-metil-kumarin asetat; Cy, cyanine; FITC, floresein izotiyosiyanat Ig:. Immünoglobulin. . AF: Alexa Fluor; gαm: keçi anti-fare; gαrb: keçi anti-tavşan; dαck: eşek anti-tavuk. </td></tr></tbody></table>

İnsan fetal beyin gelen progenitör-türetilmiş oligodendrosit kültür sistemi

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Nöronal ve glial hücre tipleri içine insan nöral ataları Farklılaşma nöral hücre soyu gelişmenin moleküler düzenlenmesi incelemek ve karşılaştırmak için bir model sunuyor. Fetal MSS dokusu nöral progenitörlerinin vitro genişlemesi de karakterize edilmiştir. In vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit edinme miyelin üreten oligodentrositlere fetal nöral ataları, doğrudan farklılaşma çeşitli kültür şartlarının yetişkin insan subkortikal beyaz cevher ve geliştirme glial progenitörlerin tespiti ve izolasyonu rağmen zor kalır. Galactocerebroside + (GalC) ve O4 Farklılaşma + oligodendrosit habercisi veya nöral prekürsör hücrelerden progenitör hücrelerin (OPC) ikinci trimesterde fetal beyin kullanarak rapor edilmiştir. Ancak, bu hücreler astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere destek hücrelerin yokluğunda çoğalırlar yok, ve kültür zaman içinde hızla kaybolur. Gerek in vitro deneyler için uygun soy oligodendrosit hücreleri üretmek için bir kültür sistemi için devam etmektedir. Primer oligodendrosit insan kültürü, örneğin, in vivo olarak bu hücreleri enfekte eden insan polyomavirus, JCV gibi nörotropik bulaşıcı ajanların patogenezine incelemek için yararlı bir model olabilir. Bu kültür hücreleri aynı zamanda merkezi sinir sistemi (MSS) diğer demiyelinizan hastalıkların modelleri sağlayabilir. Nöronlar (progenitör türetilmiş nöronlar, PDN) ve astrositler (progenitör türetilmiş astrositler, PDA) Bu çalışmada nöral ataları ikna edilebilmesi göstermektedir içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential nöral progenitör hücrelerin in vitro prolifere oligodendrocytic soy geliştirme aşamaları (progenitör türetilmiş oligodendrosit, PDO) birçok yoluyla ayırt etmek. DMEM-F12 serum serbest medya Biz kültür nöral progenitör hücrelerin suptemel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA), Sonic kirpi (Sus), nörotrofik faktör 3 (NT-3), N-2 ve triiyodotironin (T3) ile yürütülecek. Kültürlü hücreler yaklaşık her yedi günde 75cm matara başına 2.5e6 hücrelerini pasajlanmağa edilmektedir. Bu koşullar kullanılarak, kültürdeki hücrelerin çoğunluğunun az süreçleri ve bu gibi A2B5 ve O-4 gibi ön-oligodendrosit hücreleri, açık belirteçleri ile karakterize edilen bir morfoloji korumak. Biz dört büyüme faktörleri (GF) (bFGF, PDGF-AA, Şşş, NT-3) çıkarın ve PDN şartlandırılmış ortam eklerken, hücreler gibi GalC ve myelin oligodendrosit farklılaşma belirli daha süreçleri ve ekspres belirteçler, elde başlar bazik protein (MBP). Biz oligodendrosit eşsiz belirteçler tanımlamak amacıyla renkli akım sitometri kullanılarak fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.

Bu 70% -80% konfluent nöral progenitör hücre kültürü (Şekil 1A) gelen farklılaşma sürecini başlatmak için çok önemlidir. Birçok hücreler spesifik büyüme faktörleri içeren yana progenitör gelen oligo orta kültür ortamı değiştirdikten sonra ölecek. Bu oligodendrocytic fenotipi vermeyenleri nöral progenitör hücrelerin büyüme yeni orta (Şekil 1B) tarafından desteklenen olmayacağını belirtir. Bir hafta boyunca oligo orta + GF Kuluçka dar bir, iki kutuplu morfoloji (Şekil 1B)...

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler çoğalmaya<em&gt; In vitro</em&gt; Nöron ve astrosit içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak. Bu çalışma nöral ataları select büyüme faktörleri ile klima tarafından oligodendrocytic soy aşamalarında farklılaştırmak için ikna edilebilmesi gösterir.

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

İnsan nöral progenitörlerinin nöronal ve glial hücre tiplerine farklılaşması, nöral hücre soyu gelişiminin moleküler düzenlemesini incelemek ve karşılaştırmak için bir model sunar. Fetal MSS dokusundan nöral progenitörlerin in vitro ekspansiyonu iyi tanımlanmıştır. Erişkin insan subkortikal beyaz cevherinden glial progenitörlerin tanımlanıp izole edilmesine ve fetal nöral progenitörlerin miyelin üreten oligodendrositlere farklılaşmasını yönlendirmek için çeşitli kültür koşullarının geliştirilmesine rağmen, in vitro deneyler için yeterli miktarda insan oligodendrositi elde etmek zor olmaya devam etmektedir. İkinci trimester fetal beyin kullanılarak nöral öncül hücrelerden galaktoserebrosid+ (GalC) ve O4+ oligodendrosit öncül veya progenitör hücrelerinin (OPC) farklılaşması bildirilmiştir. Ancak bu hücreler; astrositler ve nöronlar dahil destek hücrelerin yokluğunda prolifere olmazlar ve kültürde zamanla hızla kaybolurlar. In vitro deneylere uygun oligodendrosit soyu hücreleri üretmek için bir kültür sistemine ihtiyaç duyulmaktadır. Primer insan oligodendrositlerinin kültürü, örneğin, in vivo ortamda bu hücreleri enfekte eden insan poliyomavirüsü JCV gibi nörotropik enfeksiyöz ajanların patogenezini incelemek için yararlı bir model olabilir. Bu kültüre edilmiş hücreler, merkezi sinir sisteminin (MSS) diğer demiyelinizan hastalıkları için de modeller sağlayabilir. Primer, insan fetal beyin kaynaklı, multipotansiyel nöral progenitör hücreler, nöronlara (progenitör kaynaklı nöronlar, PDN) ve astrositlere (progenitör kaynaklı astrositler, PDA) farklılaşma kapasitelerini koruyarak in vitro ortamda prolifere olurlar. Bu çalışma, nöral progenitörlerin oligodendrositik soy gelişiminin birçok aşaması boyunca farklılaşmaya teşvik edilebileceğini göstermektedir (progenitör kaynaklı oligodendrositler, PDO). Nöral progenitör hücrelerini; temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), nörotrofik faktör 3 (NT-3), N-2 ve triiyodotironin (T3) ile takviye edilmiş serumsuz DMEM-F12 ortamında kültüre ediyoruz. Kültüre edilen hücreler, yaklaşık her yedi günde bir, 75 cm'lik flask başına 2,5e6 hücre olacak şekilde pasajlanır. Bu koşullar kullanıldığında, kültürdeki hücrelerin çoğunluğu az sayıda çıkıntı ile karakterize bir morfolojiyi korur ve A2B5 ile O-4 gibi pre-oligodendrosit hücre belirteçlerini eksprese eder. Dört büyüme faktörünü (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) kaldırdığımızda ve PDN'den elde edilen kondisyonlu medyumu eklediğimizde, hücreler daha fazla çıkıntı geliştirmeye başlar ve GalC ile miyelin temel proteini (MBP) gibi oligodendrosit farklılaşmasına özgü belirteçleri eksprese eder. Oligodendrosite özgü belirteçleri tanımlamak için çok renkli akış sitometrisi kullanarak fenotipik karakterizasyon gerçekleştirdik.

Bu video, primer insan fetal nöral progenitör hücrelerinin oligodendrositlere farklılaşması için kullanılan bir yöntemi göstermektedir. İlk olarak, nöral progenitör hücreler progenitör besiyerinde konfluens seviyesine yakın bir düzeye gelene kadar kültüre edilir. Ardından progenitör besiyeri, farklılaşma sürecini destekleyen büyüme faktörleri ile desteklenmiş oligodendrosit besiyeri ile değiştirilir. Hücreler daha sonra üç hafta boyunca kültüre edilir ve genişletilir.Ardından, büyüme faktörü takviyeli oligodendrosit medyumu, büyüme faktörü içermeyen oligodendrosit medyumu ile değiştirilir ve hücreler, mikroskopi ile fenotipik değişiklikler görülene kadar ek olarak altı ila 10 gün boyunca kültüre edilir. Diferansiyasyon daha sonra, oligodendrosit soyuna özgü antikorlar kullanılarak immunofloresan mikroskopi ve akış sitometrisi ile doğrulanır. Nihayetinde, başarıyla diferansiye olmuş oligodendrositler, oligodendrosit biyolojisinin ve insan poliyomavirüsü JCV gibi enfeksiyöz ajanlarla etkileşimlerin in vitro çalışmaları için kullanılabilir.Bu laboratuvarda oluşturduğumuz tekniğin halihazırda yayınlanmış literatürle karşılaştırıldığında sağladığı gerçek avantajlardan biri, sistemimizde oligodendrositlerin astrositler ve nöronlar gibi destek hücrelerine ihtiyaç duyulmadan kültüre edilebilmesi ve farklılaştırılabilabilmesidir. Protokolümüzün bir diğer avantajının, fenotiplerini koruyarak birçok hafta boyunca patojen kültüründe büyütülebilen ve ol4 gibi markörleri eksprese eden çok sayıda öncül oligodendrositin kültüre edilmesini mümkün kılması olduğunu düşünüyoruz. Farklılaştırmanın nihai sonucu, bize neredeyse saf bir oligodendrosit popülasyonu sağlamaktadır.Sıçan ve fare hücrelerinde oligodendrositlerin in vitro farklılaşmasıyla ilgili kapsamlı literatürü okuduğumuzda bu yöntem fikri ilk kez ortaya çıktı. Ayrıca, farklı araştırmacılar hücrelerin farklılaşmasını tamamlamak amacıyla dar kültürlerden büyüme faktörlerini uzaklaştırıyorlardı. Bu prosedürü, buradaki N-I-N-D-S laboratuvarımızda lisans öğrencisi olan Alexa Bandon ile protokolümüz aracılığıyla göstereceğiz.Diferansiyasyon hazırlığı için, BFGF ve EGF ile desteklenmiş nöral bazal ortamda, polilizin kaplı flasklarda multipotansiyel bir nöral progenitör hücre popülasyonu büyütün ve kullanılmayan hücreleri atın. Kültür yaklaşık %70 ila %80 konfluense ulaştığında diferansiyasyonu başlatın. Bunun için, flasklardaki progenitör ortamını aspire edin.Hücreleri bir kez PBS ile durulayın ve ardından büyüme faktörleri içeren 12 mililitre oligo besiyeri ekleyin. Hücreleri, nemlendirilmiş %5 karbon dioksit inkübatöründe 37 degrees Celsius'de inkübe edin. Bir hafta sonra, kalan hücreler dar bipolar bir morfoloji sergileyecektir.Diferansiye hücreler en az %70 konfluens düzeyine ulaştığında, besiyerini uzaklaştırın ve taze bir 50 milliliter konik tüpe aktarın. Saklanan kondisyonlu besiyerini daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. Ardından, hücrelere hızlıca dört milliliter %0,05 trypsin, %0,1 EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için erleni birkaç kez hafifçe vurun. İnkübasyonun ardından, erlene saklanan kondisyonlu ortamdan dört ila beş mililitre ekleyerek tripsini nötralize edin. Daha sonra, ortamı ve hücreleri tekrar 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Ardından, besiyerini ve hücreleri oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 310 RCF'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, üst fazı aspire edin. Tüpe hafifçe vurarak hücre peletini yeniden süspande edin ve ardından büyüme faktörleri içeren taze oligo besiyeri ekleyin.Homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için besiyerini ve hücreleri pipetle nazikçe yukarı aşağı çekin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından, 2,5 milyon hücreyi poli-D-lizin kaplı yeni T 75 flasklara aktarın ve kültürü inkübatöre yerleştirin; üç hafta sonra, hücreler %80 ila %85 konfluens düzeyine ulaştığında, büyüme faktörleri içeren oligo besiyerini flasktan aspire edin.Bir kez PBS ile durulayın ve ardından büyüme faktörleri içermeyen 12 mililitre oligo medyum ile dört mililitre progenitör kaynaklı nöron koşullandırılmamış medyum ekleyin. Hücreleri bu medyumda, gün aşırı olarak altı ila 10 gün boyunca tutun. Diferansiyasyonu ve konfluensi değerlendirmek için hücreleri faz kontrast mikroskobu ile inceleyin ve büyüme faktörlerinin geri çekilmesinin ardından medyumun en az %50'sini yenileyin; hücreler, hücrelerin progenitör kaynaklı oligodendrositlere başarılı diferansiyasyonunu gösteren çok sayıda uzantı geliştirerek kademeli olarak gelişecektir.Bu aşamada, progenitör türevli oligodendrositler, bu videonun ilerleyen bölümlerinde açıklandığı üzere akış sitometrisi veya immünofloresan deneyleri için kullanılabilir. Akış sitometrisi analizi, diferansiyasyon sürecindeki oligodendrosit markerlarının kazanımını, ebeveyn popülasyonunkilerle ilişkilendirerek karşılaştırır. Kontrol olarak insan nöro progenitör hücreleri kullanılır. Büyüme faktörleri içeren oligo medyumunda, poli-D-lisin ile kaplanmış iki adet T 75 flaskın her birine 2,5 milyon progenitör türevli oligodendrosit hücresi ekleyin ve 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin. Bir hafta sonra, hücre canlılığı için kontrol amacıyla, flasklardan birindeki medyumu büyüme faktörleri içeren taze oligo medyum ile değiştirin.İkinci flasktaki besiyerini, büyüme faktörleri içermeyen taze oligo besiyeri ile değiştirin. Bu hücreleri 10 güne kadar kültüre edin; büyüme faktörlerinin uzaklaştırılmasından üç ila dokuz gün sonra hücreler, oligodendrosit fenotipine özgü daha fazla uzantı kazanmaya başlayacaktır. Progenitör kaynaklı oligodendrosit hücrelerini dissosiye etmek için besiyerini aspire edin ve her flaska 5.25 milliliters perian solüsyonu ekleyin.Dissosiyasyon sırasında hücreler üzerinde daha yumuşak bir etkiye sahip olduğu için tripsin yerine Perian kullanılır. Hücresel morfolojiyi korumak için 37 °C'de 15 ila 30 dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılmasını periyodik olarak bir mikroskop kullanarak kontrol edin.Hücreler ayrıldıktan sonra, reaksiyonu durdurmak için beş mililitre büyüme faktörlü veya büyüme faktörsüz besiyeri ekleyin. Ardından, her bir flaskın içeriğini 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 310 RCF'de santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından süpernatanı aspire edin ve hücre peletlerini, mililitre başına bir miligram bovine serum albumin veya NPM plus BSA ile desteklenmiş dört mililitre normal fizyolojik besiyerinde yeniden süspanse edin.Ardından hücreleri daha önce olduğu gibi sayın ve ardından her bir immün boyama koşulu için 1 milyon hücreyi beş mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın. Her bir immün reaktifin özgüllüğünü doğrulamak için tüm uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun. Daha sonra immün boyama işlemini gerçekleştirmek için hücreler öncelikle yüzey proteinleri A two B 5, 0 4 ve gal C'ye karşı antikorlarla inkübe edilir. Ardından hücreler, bağlanmamış primer antikorları uzaklaştırmak için yıkanır ve uygun florokromla işaretlenmiş sekonder antikorlarla inkübe edilir.Ardından, sekonder antikorları uzaklaştırmak için hücreler tekrar yıkanır. %2 paraformaldehit ile fikse edilen ve soğuk, %70 etanol ile permeabilize edilen hücreler, hücre içi proteinlerin boyanması için yıkanır ve ardından nesting, glial fibrillary, acidic protein, class three beta tubulin ve myelin basic protein'e karşı antikorlarla inkübe edilir. Bağlanmamış primer antikorlar yıkandıktan sonra.Hücreler, uygun florokrom işaretli sekonder antikorlarla inkübe edilir. Son olarak, akış sitometrisi analizi sırasında sağlam hücreler ile sübseleüler kalıntıları ayırt etmek için, hücreler dört altı DIA medino, iki fenol Lind dihidroklorür veya dappy ile işleme tabi tutulur; ardından 488 nanometre, 647 nanometre ve geniş bir UV dalga boyuna ayarlanmış eksitasyon dalga boyları sağlayan üç lazerle donatılmış bir cihazda akış sitometrisi gerçekleştirilir. İmmünofloresan mikroskopi hazırlığı için altı poli-D-lizin kaplı lam hazırlayın.Kuyu başına 250.000 progenitor kaynaklı oligodendrosit hücresi içeren altılı kuyucuklu plakalar. Her zaman noktası için iki plaka gereklidir. Hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştığında, plakalardan biri büyüme faktörleri ile diğeri ise büyüme faktörleri olmadan kültüre edilir.Plakadaki büyüme faktörleri içeren besiyerini aspire edin. Bir kez PBS ile durulayın ve ardından 12 mililitre büyüme faktörsüz besiyeri ekleyin. Büyüme faktörlerinin geri çekilmesinden beş ve dokuz gün sonra immün boyamayı şu şekilde gerçekleştirin: önce hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %2 PFA ile fikse edin.Ardından, PFA'yı boşaltın ve hücreleri her seferinde beş dakika olacak şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Sonra hücreleri %0,25 Triton ile işleme tabi tutun, ardından spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için hücreleri %2 at serumu ve %10 keçi serumu ile bloke edin. Bloklamadan sonra hücreleri beta three tubulin, G-F-A-P-M-V-P oh four ve gal C karşıtı antikorlarla inkübe edin. Daha sonra bağlanmamış antikorları hücrelerden yıkayarak uzaklaştırın ve hücreleri uygun florokromla işaretlenmiş sekonder antikorlarla inkübe edin.Bağlanmamış sekonder antikorları hücrelerden yıkayın ve ardından fotobeyazlamayı ve boya kaybını önlemek için çekirdek montajını yapın. Lamelini 10 µL dpi içeren prolonged gold kullanarak kapatın.İnsan primer nöral progenitör hücrelerinin oligodendrositlere farklılaşıp farklılaşamadığını belirlemek için, uygun filtre setine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak işaretli hücreleri görselleştirin. Multipotent nöral progenitör hücreler, bu videoda açıklandığı şekilde kültüre edilmiştir. Fenotipik değişiklikler daha sonra akış sitometrisi ve immünofloresan mikroskobu ile izlenmiştir.Burada görülebileceği üzere, nöral progenitorlerin çoğunluğu nöroepitelyal kök hücre belirteci Nestin ekspres ederken; yalnızca küçük alt popülasyonlar, astrosit belirteci GFAP, nöronal belirteç sınıf üç beta tübülin veya oligodendrosit belirteci OL4 gibi soy kısıtlayıcı belirteçleri ekspres etmektedir. Kültür ortamı, büyüme faktörleri eklenmiş oligo ortamı ile değiştirilip hücreler bir hafta boyunca kültüre edildiğinde, iki hafta sonra Nestin ekspresyonunda azalma ve A2B5 ekspresyonunda artış gözlemlenmiştir.Nestin ekspresyonu daha da azalırken, nörogial öncül hücre markörü A2B5 ekspresyonu arttı; bir başka oligodendrosit markörü olan O4'ün ekspresyonu da büyüme faktörü geri çekiminden iki gün sonra arttı. O4 ekspresyonu ve geç bir oligodendrosit markörü olan GAL C ekspresyonu, büyüme faktörü geri çekiminden altı gün sonra arttı. O4 ve GAL C'nin ko-ekspresyonu arttı ve GAL C ile MBP'nin ko-ekspresyonu ile kıyaslanabilir düzeydeydi.Çok epitoplu immün boyama, kültürdeki hücrelerin %72'sinin MBP ekspres ettiğini ortaya koymaktadır. Progenitör kaynaklı oligodendrosit farklılaşmasına dair daha ileri kanıtlar, bir immünofloresan analiz kullanılarak karakterize edilmiştir. Büyüme faktörlerinin geri çekilmesinden iki gün sonra, yeşil renkte gösterilen MVP ekspresyonu tespit edilmiştir.Bu durum beşinci günde artış göstermiş ve dokuzuncu günde daha da artmıştır. Diferansiye olmuş oligodendrositlerde MVP lokalizasyonu belirgindir. Toplu olarak değerlendirildiğinde, bu veriler, tanımlanan yöntem kullanılarak kültüre edilen insan fetal nöral progenitor hücrelerinin, oligodendrosit soy hatlarının aşamaları boyunca diferansiye olma kapasitelerini korurken in vitro ortamda prolifere olabildiklerini göstermektedir.Bu protokolün geliştirilmesinin ardından, teknik; gelişimsel biyoloji, nörobilim ve viroloji alanlarındaki araştırmacıların insan beyninin biyolojisini, insan beynini etkileyen hastalıkları ve özellikle beyaz cevher hastalıklarıyla sonuçlanan durumları incelemesine olanak sağlamaktadır.

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Bu video, fare yavrusu beyin korteksinden oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.

Fare Yavrusu Beyin Korteksinden Oligodendrosit Öncü Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelinli hücreleridir. Bu protokol, öncülleri olan oligodendrosit progenitör hücrelerinin sıçan kortekslerinden izolasyonu ve kültürü için bir yöntemin yanı sıra, deneysel faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenezi değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir kantitatif yöntemi tanımlar.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

Sunulan protokol, küçük molekül bileşiklerinin nörat dışı büyüme testini ve nörotoksisite değerlendirmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Olgun oligodendrositlere dönüşen fetal veya yetişkin nöral kök hücrelerden elde edilen astrositlerin ve oligodendrosit öncül hücrelerin karma kültürlerinin üretimini ve zararlı uyaranların in vitro modellemesini anlatıyoruz. Hücre tabanlı yüksek içerikli tarama tekniği ile bağlantı, güvenilir ve sağlam bir ilaç tarama sistemi oluşturur.

Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) organoid gelişimine dahil ederek yerleşik mikroglialı bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Öğrenin, insan fetal nöral progenitör hücrelerini oligodendrositlere farklılaştırma yöntemini. Bu protokol, destek hücreleri olmadan saf oligodendrosit popülasyonları üretir ve beyin hastalıklarını incelemek için değerli bir model sunar.

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Daha fazla video keşfet