Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektrokimyasal sensörler kullanarak bakterileri tespit etmek ve tanımlamaktır. Bu, florlu dedektör probu ile hibridizasyona izin vermek için önce ribozomal RNA'nın bakterilerden serbest bırakılmasıyla elde edilir, ikinci adım olarak, dedektör probuna bağlı ribozomal RNA, çalışma elektroduna eklenir, bu da sensör yüzeyindeki yakalama probu ile hibridizasyona izin verir. Daha sonra, anti floresein at turpu peroksidaz konjugatının florlu dedektör probuna bağlanmasına izin verilir.

Son olarak, yoğunluğu yakalama probu ribozomal sayısı ile ilişkili olan interferometrik akımda, sensör yüzeyindeki RNA dedektör prob kompleksleri elde edilebilir. Bu tekniğin kültür bazlı yöntemlere göre en büyük avantajı, bakterilerin yaklaşık 45 dakika içinde tespit edilebilmesi ve tanımlanabilmesidir, bu da gece ağırlığından kaçınır. Bir bakterinin bir EDGAR plakası üzerinde görünür bir koloni oluşturması için Bu tekniğin uygulanması bulaşıcı hastalıkların yönetimini iyileştirecektir.

Bakteriyel patojenlerin erken tespiti, hedefe yönelik antibiyotik tedavisi ve daha iyi klinik sonuçlar için gereklidir. Bu yöntem enfeksiyon hastalıklarının teşhisi için yararlı olsa da, immünodiagnoz gibi diğer tanısal problemlere de uygulanabilir. Yakalama probu üzerindeki tiyol grubunun azalmasını sağlamak için genişlemiş yakalama probunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hekzan di tiyol ile inkübe ederek başlayın, bu da daha tutarlı sonuçlar elde edilmesini sağlar.

Kuluçkadan sonra, altın taşımak için bir nitrojen akışı uygulayın. Herhangi bir nem veya partikülü gidermek için beş saniye boyunca 16 sensör dizisi çipi, Sensör dizisindeki çalışma elektroduna küçük hacimlerde sıvının dikkatli bir şekilde uygulanması gerekir. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir.

Pipetleme, yıkama ve kurutma tekniklerinin düzgün bir şekilde uygulanması, çipler arası değişkenliği büyük ölçüde azaltır. Daha sonra, sensör dizisinin 16 sensörünün tümünün çalışma elektroduna altı mikrolitre HDT dilate yakalama probu karışımı uygulayın ve sensör çiplerini ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede kapalı bir Petri kabında saklayın, sensör çiplerini iki ila üç saniye boyunca deiyonize su ile yıkayın ve ardından çipleri beş saniye boyunca bir nitrojen akışı altında kurutun. Şimdi 16 sensörün tümünün çalışma elektroduna altı mikrolitre attri hidroklorür sodyum klorür, EDTA MERCAPTOETHANOL solüsyonu uygulayın ve sensörleri oda sıcaklığında bir Petri kabında 50 dakika inkübe edin.

Elektrokimyasal sensör testi için numuneleri hazırlamak. Büyümenin log fazında bir mililitre bakteri kültürünü bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve daha sonra hücreleri 16.000 g'da beş dakika santrifüjleyin. Patojenik bakterilerin bir biyogüvenlik başlığında ele alınması gerektiğini lütfen unutmayın.

Talaşı çıkardıktan sonra, mikro santrifüj tüpünün dibine 10 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit içeren bir pipet ucu uygulayın ve peleti iyice yeniden süspanse etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, bakteriyel lizatı nötralize etmek için sığır serum albümini veya BSA içeren 50 mikrolitre PBS ve bir floresein modifiye dedektör probu ekleyin. Daha sonra nötralize lizatı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Bu adıma, hazırlanan sensör çiplerinden birinden merkaptoetanol çözeltisini deiyonize su ile iki ila üç saniye yıkayarak başlayın. Çipi az önce gösterildiği gibi kuruttuktan sonra, çalışma elektrotlarına dört mikrolitre nötralize bakteri lizatı uygulayın. Sensörlerin 14'ü.

Ardından, PBS artı BSA artı floresein modifiye dedektör probundaki köprüleme oligonükleotidinden dört mikrolitreyi iki pozitif kontrol sensörüne uygulayın. Daha sonra lizat ve pozitif kontrol sensörlerini 15 dakika inkübe ettikten sonra, tüm sensör çipini daha önce olduğu gibi yıkayın ve kurulayın. Şimdi, 16 sensörün tümünün çalışma elektrotlarına kazein içeren PBS'de dört mikrolitre anti floresein, at turpu, peroksidaz veya HRP uygulayın.

15 dakikalık bir inkübasyondan sonra sensör çipini yıkayın ve kurulayın. Ardından, sensör çipinin yüzeyine bir film kuyusu çıkartması uygulayın ve çipi sensör çipi montaj pipetine 50 mikrolitre TMB alt tabakasına 16 sensörün tümüne yükleyin ve sensör çipi montajını kapatın. Son olarak, 16 sensörün tümü için pirometri ve döngüsel telemetri ölçümleri elde etmek için bir Helios çip okuyucu kullanın.

Az önce tarif edilen elektrokimyasal tahlil, bu şekilde gösterildiği gibi bir sandviç olan Eliza'ya benzer şekilde yapılandırılmıştır, bu şekilde hedef ribozomal, yakalama ve dedektör probları ile RNA hibridizasyonu, dedektör probu üzerindeki üç çam floresein bağlantısını bağlayan anti floresein antikor fragmanlarına konjuge HRP tarafından katalize edilen bir redoks reaksiyonu ile geliştirilmiştir. Tahlil duyarlılığının önemli bir bileşeni, altın elektrotun yüzey kimyasıdır. Altın elektrot, merkaptoetanol ve hine ol ile kaplanır ve dilate yakalama problarının eklenmesiyle işlevselleştirilir.

Hedef ribozomal RNA'nın yakalama probu ve floresein etiketli dedektör probu ile sandviç hibridizasyonu, anti floresein at turpu peroksidaz konjugatı ve TMB substratının eklenmesiyle tespit edilen bir kompleks ile sonuçlanır. M parametrik akımı, TMB'nin yaban turpu peroksidaz tarafından oksidasyonundan ve TMB'nin elektrottan gelen elektronlar tarafından indirgenmesinden kaynaklanan redoks döngüsü tarafından üretilir. Burada gösterilen tahliller, bir gen akışkan 16 sensör dizisi çipi kullanır.

Dizideki sensörlerin her biri, çipin kenarında temas noktaları olan çalışma referansı ve yardımcı olmak üzere üç elektrot içerir. Çip okuyucu, temas noktalarının her birine bağlanan pogo pinlerine sahiptir. Çip okuyucu, bir bilgisayar algoritması tarafından kontrol edilen bir potansiyometre ile sensör dizisi için bir arayüz görevi görür.

Burada, bir elektrokimyasal sensör akım akışı örnekleri gösterilmektedir. Sensörlerdeki akım akışı, parametrik ölçümler başladıktan sonraki ilk birkaç saniye boyunca sensörlerde yapay olarak yüksektir. TMB'nin sensör yüzeyine uygulanmasından okuyucu algoritmasının başlatılmasına kadar geçen süre boyunca oksitlenmiş substratın birikmesi nedeniyle, akım akışı daha sonra hızlı bir şekilde sabit bir duruma ulaşır ve doğru sensör okumaları 60 saniye içinde güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Sensörden sensöre değişkenlik nispeten sabittir, bu nedenle gen akışkan 16 sensör dizisi çipi üzerinde paralel olarak 16 farklı sensör testi gerçekleştirmek mümkündür, pozitif ve negatif kontroller pozitif bir kontrol olarak gereklidir. Hem yakalama hem de dedektör problarına hibritleşen ve bilinen konsantrasyonda sentetik bir hedef olarak hizmet eden sentetik bir köprüleme DNA oligonükleotidi bu şekilde kullanılır. Köprüleme oligonükleotidi kullanılarak elde edilen sonuçlar, çipler arası varyasyonu en aza indirmek için dahili bir kalibrasyon kontrolü olarak

Elektrotun negatif akımı ne kadar büyükse, sinyal o kadar yüksek olur. Yakalama ve dedektör problarını test ederken. Tespit sınırı, bu şekilde gösterildiği gibi bilinen konsantrasyona sahip bir numunenin seri seyreltilmesi ile belirlenmelidir, numune konsantrasyonu ile testin dinamik aralığı üzerinden sinyal çıkışı arasında doğrusal bir log log korelasyonu vardır.

Bu çubuk grafiklerde, idrar yolu enfeksiyonu olan hastaların idrarında sıklıkla bulunan esia coli ve kleb seal ve amonyak içeren numuneler için temsili sonuçlar, sensörlerin çoğu için sinyallerin düşük ve benzer olacağı gösterilmiştir ve bu negatif sonuçlar, KE prob çifti ile arka plan sinyali reaktivitesi kanonu e coli'den ayırdığı için bir araya getirilebilir. Köprüleme oligonükleotidi, pozitif kontrol ve dahili kalibrasyon standardı olarak hizmet eder. Bu teknik, bakterilerin antibiyotiklere fenotipik tepkisini ölçerek klinik örneklerde antibiyotiğe dirençli bakterilerin tespitine uygulanabilir.

Bu teknik, bireysel bir hasta için en uygun tedaviyi belirlemek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çipteki farklı türe özgü sensörlerdeki atrik akımları karşılaştırarak bakterileri nasıl tespit edeceğinizi ve tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.